Povzetek

Zanimanje potrošnikov za izdelke kozmetične industrije z učinki posvetljevanja kože je povečalo povpraševanje po pripravkih, ki zmanjšujejo melanogenezo. Številna antimelanogena zdravila so znana po svojih stranskih učinkih, kot so kontaktni dermatitis in visoka toksičnost ter slaba penetracija skozi kožo. Precej nedavnih raziskav se je osredotočilo na izdelke rastlinskega izvora kot alternativo kemoterapevtskim zdravilom z manj stranskimi posledicami.

V trenutni študiji smo preučevali antimelanogeno delovanje zunajceličnih veziklov (EV), ekstrahiranih iz listov in stebel patogenega Dendropanaxa. Z delom s spektrofotometričnimi in biokemičnimi metodami smo ugotovili, da zunajcelični vezikli (LEV) in zunajcelični vezikli (SEV), pridobljeni iz listov, zmanjšajo vsebnost melanina in aktivnost tirozinaze (TYR) na način, ki je odvisen od koncentracije v celični liniji mišjega melanoma B16BL6. Elektronsko mikroskopska analiza je nadalje pokazala, da so LEV in SEV povzročili od koncentracije odvisno zmanjšanje vsebnosti melanina v celicah melanoma. V primerjavi z arbutinom kot pozitivno kontrolo so LEV in SEV pokazali močnejši učinek beljenja na celice melanoma, belilni učinek LEV pa je bil močnejši. Predvsem niti LEV niti SEV niso povzročili pomembne citotoksičnosti. Preučili smo tudi učinke EV rastlinskega izvora na izražanje proteinov, povezanih s tirozinazo (TRP) v celicah melanoma. LEV so zavirali izražanje genov in proteinov, povezanih z melanogenezo, vključno s transkripcijskim faktorjem, povezanim z mikroftalmijo (MITF), TYR, TRP-1 in TRP-2. V človeškem epidermalnem modelu so LEV močneje zavirali melanogenezo kot arbutin. Naši podatki skupaj kažejo, da je lahko lev iz patogenov D. nova kandidatka za naravno snov za uporabo kot antimelanogeno sredstvo v farmacevtskih pripravkih.

ključne besede:EV rastlinskega izvora; LEV inSEV; antimelanogeno; TYRdejavnost; Vsebnost melanina inKoristi izvlečka Cistanche

Kliknite tukaj, da dobiteprednosti Cistanche za beljenje kožeinučinki izvlečka Cistanche

Uvod

Melanin, kritični del pigmentacijskega sistema človeških las, oči in kože, proizvajajo melanociti s postopkom, imenovanim melanogeneza. Nenormalno kopičenje melanina lahko povzroči kožne bolezni, kot so pege, sončne pege in melazma, lahko pa tudi povzroči raka in vitiligo. Regulacija melanogeneze je torej ključna strategija pri zdravljenju hiperpigmentiranih motenj. Na primer, hidrokinon, hidroksifenilna spojina, ki moti aktivnost TYR, se uporablja kot sredstvo za beljenje kože v kozmetični industriji. Kljub temu lahko hidrokinon povzroči neželene učinke, kot sta kontaktni dermatitis in eksogena porjavelost. Va-acid je drugo sintetično sredstvo, ki zavira aktivnost TYR, vendar je njegova uporaba povezana z visoko pogostnostjo edema ali draženja.

Glede na omejitve obstoječih kemičnih spojin, ki odražajo dejstvo, da so kozmetični izdelki iz rastlin in zelišč običajno blažji, bolj biološko razgradljivi in ​​manj strupeni kot sintetični, se povečuje zanimanje za prepoznavanje alternativnih zdravil iz naravnih virov proti melanogenezi. spojine. Pokazalo se je, da ekstrakti listov bolezni Dendrobium zavirajo nastajanje melanina z neposredno interakcijo z znotrajcelično aktivacijo TYR in izražanjem encimov, ki sodelujejo pri biosintezi melanina. Na podoben način je ekstrakt listov Croton officinalis zaviral vsebnost melanina in celično aktivnost TYR z zaviranjem z melanogenezo povezanih transkripcijskih faktorjev (MITF) in melanogenih encimov. Poleg tega so imeli listi murve zaviralni učinek na aktivnost TYR in tvorbo melanina v celicah melan-A. P-kumarinska kislina iz listov ginsenga je bila opredeljena kot glavni zaviralec TYR.

Herba Cistanche

Kljub dejstvu, da je bila v formulacijah medicinske kozmetike uporabljena široka paleta botaničnih spojin, so njihova nizka topnost, nizka ciljna afiniteta in zmerno posvetlitveno delovanje ovirale napredek pri izboljšanju terapevtskih učinkov botanične kozmetike. To je spodbudilo iskanje novih in progresivnih tehnik za izboljšanje učinkovitosti zdravilnih in bioaktivnih spojin ter izboljšanje njihove učinkovitosti dostave v kožo. Uspešno so bile na primer razvite številne nano-dostavne tehnologije, vključno z nano-lovely za učinkovito nego kože, nano-kvercetinom za odložitev poškodb celic, ki jih povzroča ultravijolično (UV) sevanje, nano-fulereni za regeneracijo kolagena in preprečevanje staranja kože. , nano-luteolin za ohranjanje antioksidativnega delovanja in nano-resveratrol za zaščito kože pred UV sevanjem.

V tej študiji se osredotočamo na vlogo zunajceličnih veziklov rastlinskega izvora (EV). Nedavne študije so pokazale, da imajo EV rastlinskega izvora podobno strukturo kot izolirani eksosomi sesalcev in delujejo kot zunajcelični prenašalci sporočil, ki posredujejo medcelično komunikacijo. Poleg tega so ti vezikli sposobni premestiti mRNA, mikro-RNA (miRNA), bioaktivne lipide in beljakovine v živalske celice.

Medtem smo proučevali zaviralni učinek EV, pridobljenih iz listov in stebel obolelih stročnic, na melanogenezo. Opredelili smo velikost in lastnosti zunajceličnih veziklov, pridobljenih iz listov (LEV) in zunajceličnih veziklov, pridobljenih iz stebla, ekstrahiranih iz listov in stebel obolelih stročnic, in pokazali, da so te EV zlahka prevzele celice melanoma in niso bili citotoksični. Da bi dokazali antimelanogene učinke LEV in SUV, smo pregledali vsebnost melanina in aktivnost TYR v celicah melanoma. Nadalje smo ocenili učinek EV na kompleksen proces sinteze melanina s spremljanjem sprememb ravni različnih beljakovin in encimov.

Alfa-melanocitni stabilizacijski hormon (-MSH) se veže na receptor melanokortina 1 (MC1R) na celični površini in aktivira adenilat ciklazo, kar vodi do povečanih znotrajceličnih ravni cikličnega adenozin monofosfata (cAMP). cAMP posreduje preko cAMP-odvisne protein kinaze A, kar vodi do fosforilacije cAMP-odzivnega elementa vezavnega proteina (CREB). Aktiviran CREB inducira MITF, ki se izraža v melanocitih in ima ključno vlogo pri diferenciaciji in razvoju melanocitov. -TRP1 je bistven za pravilno translokacijo TYR v sintezo melanina, TRP2 pa ima pomembno vlogo pri katalitični aktivnosti TRP v zgodnjih fazah sinteze melanina. Ti trije medsebojno delujejo v celicah melanoma (dopolnilna slika 1).

Ugotovili smo zmanjšano izražanje MITF v celicah melanoma, zdravljenih z LEV, čemur je sledilo zmanjšano izražanje TYR, TRP-1 in TRP-2, in z elektronsko mikroskopijo potrdili, da je bila sinteza melanina v teh celicah zmanjšana na ultrastrukturni ravni. Nadalje smo potrdili antimelanogeni učinek LEV z uporabo rekonstruiranega človeškega epidermalnega modela. Za kvantitativno oceno inhibitornega učinka LEV na celično sintezo melanina smo pripravili standardne raztopine iz tkiv in s kolorimetrom izmerili vsebnost melanina. melaninske lise so se zmanjšale v odsekih tkiva, obarvanih po Fontana-Massonu. LEV so bolj učinkovito zavirali proizvodnjo melanina kot zaviralec TYR arbutin, ki je bil uporabljen kot pozitivna kontrola.

Če povzamemo, te ugotovitve kažejo, da je uporaba EV, pridobljenih iz naravnih snovi, za obvladovanje hiperpigmentacije izvedljiv prihodnji pristop za farmacevtsko industrijo. Poleg tega se pričakuje, da bodo električna vozila, pridobljena iz rastlin, s prednostmi majhnosti, nizke toksičnosti, visoke absorpcije in okoljske varnosti naslednja generacija terapevtskih dostavnih sistemov za zdravljenje drugih bolezni. Predvsem EV rastlinskega izvora imajo dobre antimelanogene učinke na rekonstruirano človeško kožno tkivo (podobno človeški povrhnjici), kar je osnova za prihodnja klinična preskušanja.

Cistanche dodatek

Materiali in metode

1. Izolacija D. morbifera LEV in SUV

Sveže liste in stebla so zbirali na otoku Poge, Guandao-gun in Jeollanam-do. EV smo izolirali iz 50 g listov oziroma stebla z mletjem z uporabo ekstraktorja in prehajanjem nastalega soka skozi filtrirni papir ter centrifugiranjem pri 10,000 × g 10 minut. Velike ostanke smo odstranili s filtriranjem supernatanta skozi 0,22 μm membrano, čemur je sledilo centrifugiranje s centrifugalnim filtrom Amicon Ultra-4 PL 100 K (Merck Millipore. Darmstadt, Nemčija), da smo koncentrirali EV s centrifugiranjem vzorcev pri 5000 × g 10 minut pri 4 stopinjah. Po centrifugiranju je bila koncentracija beljakovin EV določena z uporabo kompleta za analizo beljakovin bis kinolinske kisline (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA).

2. Karakterizacija velikosti izoliranih električnih vozil

Hidrodinamična velikost izoliranih EV je bila izmerjena z dinamičnim sipanjem svetlobe (DLS), tehniko, ki se uporablja za določanje porazdelitve velikosti majhnih delcev v suspenziji, z uporabo sistema Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK). Zbrane EV so postavili v celico s konstantno temperaturo pri 20 stopinjah. Porazdelitev velikosti delcev in z-povprečje, uporabljeno za določitev hidrodinamične porazdelitve velikosti delcev, sta bila določena z merjenjem avtokorelacijske funkcije intenzivnosti sipanja. Izolirane EV smo razredčili z vodo brez mehurčkov in jih nato podvrgli analizi sledenja nanodelcev (NTA) (Nanosight; z uporabo 488 nm laserja pri 25 stopinjah).

3. Analiza električnih vozil s transmisijsko elektronsko mikroskopijo

5 μL raztopine vzorca smo naložili na ogljikov film, prevlečen z bakreno mrežo, za analizo s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM). Po 1-minutni adsorpciji vzorca so bile mreže sprane s kapljico čiste vode in nato 1 minuto negativno obarvane z 1-odstotnim uranil acetatom. Odvečno madež smo odstranili s filtrirnim papirjem in mrežice posušili na zraku. Vzorci so bili posneti v fokusu med 0.8 - 1.5 μm z uporabo transmisijskega elektronskega mikroskopa JEM- 1400 Plus (JEOL Ltd., Tokio, Japonska), opremljenega s pištolo Lab6, ki deluje pri 120 kV . Slike so bile posnete s kamero UltraScan OneView CMOS (Gatan, Pleasanton, CA, ZDA).

Cistanche tubulosa

4. Priprava liposomov

Mešanice liposomov smo pripravili z uporabo razmerja 95:5 (mol/mol) DMPC (1,2-stearoil-sn-glicerol-3-fosfoholina) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, ZDA) z DSPE-mPEG (1,2-stearoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamin-[metoksi(polietilen glikol)- 2000] (Avanti polarni lipidi) za pripravo liposomskih mešanic kot lipidnih membran. hidrofobno fluorescentno barvilo 1,1-dioktadecil-3,3,3',3'-tetrametilindokarbocianin perklorat (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, ZDA) smo zmešali z EV, 725,49 ug DMPC, 151,64 ug DSPE-PEG in 15 ug DiI.Po uparjenju organskega topila smo membrano, ki je vsebovala lipid in mešanico DiI, hidrirali z 1 ml fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS).Nato smo z uporabo ekstruderja (Avanti Polar) pripravili liposome velikosti 100 nm. Lipidi).

5. Celična kultura in testi viabilnosti

Celice melanoma B16BL6 so bile gojene v alfa-minimalnem esencialnem mediju (alfa-MEM), ki je vseboval 10 odstotkov fetalnega govejega seruma (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, ZDA) in 1 odstotek penicilina/streptomicina (Lonza, Basel, Švica) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) v kulturi. Celice smo inkubirali pri 37 stopinjah v navlaženi atmosferi s 5 odstotki CO2. 100 μL celic melanoma B16BL6 je bilo inokuliranih v 96-plošče z vdolbinicami (5 × 104 celic/vdolbinico) za teste viabilnosti celic. Po 24-urni inkubaciji smo celice 24 ur obdelali z LEV in SEV v koncentracijah 1, 5 oziroma 10 µg/mL. Koncentracije liposomov in arbutina so bile 10 µg/mL oziroma 70 µg/mL za vse poskuse. V vsako vdolbinico smo nato dodali 10 µL reagenta EZ-Cytox (Daeil Lab Service, Seul, Koreja). Plošče smo inkubirali 1 uro. Plošče smo nato nežno pretresli in nato izmerili absorbanco pri 450 nm z uporabo encimskega markerja (BioTek, Winooski, VT, ZDA).

REFERENCE

[1] Meredith P, Sarna T. Fizikalne in kemijske lastnosti eumelanina. Pigment Cell Res. 2006; 19 (6): 572–594.

[2] Grimes PE. Melazma: etiološki in terapevtski vidiki. Arch Dermatol. 1995; 131 (12): 1453–1457.

[3] Todd MM, Rallis TM, Gerwels JW, et al. Primerjava treh laserjev in tekočega dušika pri zdravljenju sončnih lentiginov: randomizirano, kontrolirano, primerjalno preskušanje. Arch Dermatol. 2000;136(7):841–846.

[4] Kawalek AZ, Spencer JM, Phelps RG. Kombinirani excimer laser in lokalni takrolimus za zdravljenje vitiliga: pilotna študija. Dermatol Surg. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiaens M, Ter Huurne J, Gruis N, et al. Gen za receptor-1-melanokortina je glavni gen za pege. Hum Mol Genet. 2001; 10 (16): 1701–1708.

[6] Pillaiyar T, Manickam M, Jung SH. Zmanjšanje regulacije melanogeneze: odkrivanje zdravil in terapevtske možnosti. Drug Discov danes. 2017; 22 (2): 282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC et al. Učinki hidrokinona in njegovih glukozidnih derivatov na melanogenezo in antioksidacijo: biološka varnost kot sredstva za beljenje kože. J Dermatol Sci. 2009; 55 (3): 179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Hidrokinon in njegovi analogi v dermatologiji – možno tveganje za zdravje. J Cosmet Dermatol. 2005;4(2):55–59.

[9] Picardo M, Carrera M. Nova in eksperimentalna zdravljenja kloazme in druge hipomelanoze. Dermatol Clin. 2007; 25 (3): 353–362.

[10] Shin JW, Park KC. Trenutna klinična uporaba sredstev za depigmentacijo. Dermatol Sin. 2014;32(4):205–210.

[11] Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C, et al. Antimelanogene lastnosti grških rastlin. Novo sredstvo za depigmentacijo iz lesa Morus alba. Molekule. 2017; 22 (4): 1–14.

[12] Park SA, Park J, Park CI, et al. Celična antioksidativna aktivnost in belilni učinki izvlečkov listov Dendropanax morbifera. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Chatatikun M, Yamauchi T, Yamasaki K, et al. Antimelanogeni učinek listov Croton roxburghii in Croton sublyratus v celicah B16F10, stimuliranih z -MSH. J Tradit Complement Med. 2019; 9 (1): 66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H, et al. Mulberrozid F, izoliran iz listov Morus alba, zavira biosintezo melanina. Biol Pharm Bull. 2002; 25 (8): 1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. P-kumarinska kislina, ki zavira tirozinazo, iz listov ginsenga. Phytother Res. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Novi pristopi v zeliščni kozmetiki. J Cosmet Dermatol. 2008;7(2):89–95.

[17] Ganesan P, Choi DK. Trenutna uporaba nanokozmecevtikov na osnovi fitokompoundov za lepotno in kožno terapijo. Int J Nanomedicine. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Takahashi M, Kitamoto D, Asikin Y, et al. Liposomi, ki vsebujejo izvleček gela listov aloe vere, bistveno povečajo proliferacijo in sintezo kolagena v celičnih linijah človeške kože. J Oleo Sci. 2009; 58 (12): 643–650.

[19] Bose S, Du Y, Takhistov P, et al. Optimizacija formulacije in lokalna dostava kvercetina iz nanosistemov na osnovi trdnih lipidov. Int J Pharm. 2013;441(30):56–66.

[20] Ngan CL, Basri M, Tripathy M, et al. Intervencija kože s fulerenom integrirano nanoemulzijo pri strukturni regeneraciji in regeneraciji kolagena proti staranju kože. Eur J Pharm Sci. 2015;70(5):22–28.

[21] Mitri K, Shegokar R, Gohla S et al. Lipidni nanoprevozniki za dermalno dostavo luteina: priprava, karakterizacija, stabilnost in učinkovitost. Int J Pharm. 2011;414 (1–2):267–275.

[22] Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. Oblikovanje in formulacija optimiziranih mikroemulzij za dermalno dostavo resveratrola. Evid Based Complement Alternat Med. 2015; 2015: 1–10.

[23] Zhang M, Viennois E, Xu C, et al. Užitni nanodelci rastlinskega izvora kot nov terapevtski pristop proti boleznim. Tkivne pregrade. 2016;4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. Analogi N-hidroksi-N′-feniltiosečnine in N-hidroksi-N′-fenil sečnine kot zaviralci tvorbe tirozinaze in melanina. Bioorg Med Chem Lett. 2008; 18 (12): 3607–3610.

[25] Kobayashi T, Hearing VJ. Neposredna interakcija tirozinaze s Tyrp1 za tvorbo heterodimernih kompleksov in vivo. J Cell Sci. 2007; 120 (24): 4261–4268.

[26] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Signalne poti v melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. Selektivna znižana regulacija gena TYRP1 družine tirozinaze z inhibicijo aktivnosti melanocitnega transkripcijskega faktorja, MITF. Nucleic Acids Res. 2002; 30 (14): 3096–3106.

[28] Oh MJ, Hamid MA, Ngadiran S, et al. Ekstrakt Ficus deltoidea (Mas cotek) je pokazal antimelanogeno delovanje s preprečevanjem aktivnosti tirozinaze in vitro in z zaviranjem izražanja gena tirozinaze v celicah melanoma B16F1. Arch Dermatol Res. 2011; 303 (3): 161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ, et al. Antimelanogena aktivnost fitosfingozina prek modulacije signalne poti transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo. J Dermatol Sci. 2017;87(1):19–28.

[30] Toyofuku K, Wada I, Valencia JC, et al. Okulokutani albinizem tipa 1 in 3 sta retencijski bolezni ER: mutacija tirozinaze ali Tyrp1 lahko vpliva na predelavo mutantnih in divjih proteinov. Faseb J. 2001; 15: 2149–2161.

[31] Xue L, Li Y, Zhao B, et al. TRP-2 posreduje pigmentacijo barve dlake pri ovčji koži. Mol Med Rep. 2018; 17: 5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q, et al. Medvrstna komunikacija med rastlinskimi in mišjimi črevesnimi celicami prek eksosomom podobnih nanodelcev užitnega rastlinskega izvora. Mol Nutr Food Res. 2014; 58 (7): 1561–1573.