Antinociceptivno delovanje Cistanche Salsa Stolons, ki raste v Republiki Kazahstan

Rastlinski material

Cistanche salsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,stoloni so bili zbrani v puščavi Moinkum, vas Bakanas, julija 2014 v Almatyju. Rastlinski material je identificirala dr. G. Sitpayeva z Inštituta za botaniko in fitointrodukcijo Ministrstva za izobraževanje in znanost Republike Kazahstan, kjer je bil deponiran pod številko 01-04/306.

Kemijska analiza

Stoloni odC. salsa(2 g) smo podvrgli mikrovalovni ekstrakciji. Sprva je bil material zmlet na 0.001–2.000 mm in nato postavljen v hermetično posodo za ekstrakcijo za 10 minut pri 100–1100 stopinjah z etanolom 80 odstotkov ( razmerje 1:10). Hidroetanolni ekstrakt (CSHE) smo analizirali s HPLC-MS. Surovi ekstrakt smo raztopili v metanolu (9,6 mg/ml) in filtrirali skozi 0,45mm teflonsko membrano pred analizo. Model tekočinskega kromatografa serije HP 1100 (podjetje Agilent Technologies, Inc., CA, ZDA), opremljen s pretočnim vakuumskim razplinjevalnikom, štirikanalno nizkotlačno gradientno črpalko in avtomatskoinjektor. Fenolne spojine smo kromatografsko ločili s kolono Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, napolnjen s polimerom oktadecilsilil silikagela (1.8μ). Kromatografska analiza je bila izvedena s pretokom mobilne faze 0.2ml/min, delovni tlak eluenta 175–200 kPa, temperatura pečice kolone 30 stopinj, 2 ml prostornine vzorca, gradientni način dovajanja eluenta: 0–36 min 10 odstotkov A – 90 odstotkov B; 36 min – 100 odstotkov B (eluent A: metanol, eluent B: 0,2-odstotna raztopina mravljinčne kisline). Detekcija je bila izvedena z UV pri valovnih dolžinah 254, 334, 350, 410, 450 in 550.nm. Za identifikacijo kemičnih spojin v ekstraktu smo uporabili primerjavo dobljenih retenzijskih časov, UV in masnih spektrov s tistimi referenčnih spojin. Kvantitativno analizo smo izvedli z uporabo standardnega verbaskozidain ehinakozid, analiziran pod enakimi kromatografskimi pogoji. Njihove umeritvene krivulje so omogočile izračun količine drug drugega fenilpropanoidaglikozida v etanolnem izvlečku te rastline. Metoda ni bila validirana.

Živali

Swiss Webster miši (20–25g, stari dva meseca) so bili uporabljeni v tej študiji (donirala Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brazilija). Živali so bile v standardnih pogojih (cikel svetlo-tema 12 ur, 22 ± 2 stopinji in 70–80-odstotna vlažnost. Hrana in vodaad libitum). Živali so prejemale samo vodo, da bi se izognili motnjam hrane pri absorpciji snovi 12h pred začetkom poskusov. Privajanje na laboratorijske razmere je potekalo vsaj 1 h pred vsakim testom. Vsi protokoli so bili izvedeni v skladu s Smernicami o etičnih standardih za preiskovanje eksperimentalne bolečine pri živalih in so upoštevali načela in smernice, ki jih je sprejel Državni svet za nadzorPoskusi na živalih (CONCEA), odobreni s straniBiomedicinski znanstveni inštitut/UFRJ, Etični odbor za raziskave na živalih, in prejel številko DFBCICB015-04/16. Vsi eksperimentalni protokoli so bili izvedeni med svetlobno fazo. Število živali na skupino je bilo minimalno in v skladu s pravili CONCEA. Na koncu vsakega poskusa so miši ubili s prevelikim odmerkom ketamina/ksilazina.

Zdravljenja

V tej študiji je bil CSHE ocenjen na 10, 30 in 100 mg/kg. Ekstrakt smo raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO, Fisher Biotech), da smo pripravili osnovno raztopino pri 100 °C. mg/ml. PBS je bil uporabljen kot razredčilo za pripravo različnih odmerkov. Rešitve, ki vsebujejo 10, 30 in 100mg/kg hidroetanolnega ekstraktaC. salsaso bili pripravljeni. Standardna uporabljena zdravila so bila morfin 2,5mg/kg (Merck, razredčeno v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS)), acetilsalicilna kislina 200mg/kg (Sigma Aldrich, raztopljen s 5M natrijevega hidroksida(NaOH) v 0,9-odstotni fiziološki raztopini) in kapsazepin 10 nMol na šapo. Fiziološka raztopina plus DMSO (v enaki koncentraciji kot pri najvišji obdelavi z ekstraktom) je bila dana negativni kontrolni skupini. Vsa zdravljenja (testirani ekstrakt in standardi) so bila uporabljena peroralno. Edina izjema je bil kapsazepin, ki so ga dajali z intraplantarno injekcijo.

Akutna bolečina zaradi formalina

Vbrizgali so raztopino 2,5-odstotnega formalina (37-odstotnega formaldehida) (20ul) v plantarnem predelu desne zadnje šape miši 60min po tretmaju (hidroetanolni izvlečekC. salsaali acetilsalicilna kislina 200 mg/kg ali morfin 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Živali so posamično postavili v prozorno stekleno komoro in zabeležili čas v sekundah, ki so ga porabile za lizanje šape po injiciranju formalina, ter ga analizirali v dveh ločenih obdobjih, zgodnji fazi nevrogene bolečine (0–5 min po injiciranju) in vnetna bolečina pozne faze (15–30 min po injiciranju).

Nocicepcija, ki jo povzroča kapsaicin

Ta test je temeljil na metodi, ki so jo opisali Sakurada et al. z nekaterimi modifikacijami (Sakurada et al., 1992). Kapsaicin (20 ul) C18H27št3(Galena, Campinas, SP) injicirali v plantarni predel zadnje desne tace miši (1,6 ug/tačko) eno uro po zdravljenju (hidroetanolni izvlečekC. salsaali kapsazepin 10 nMol/tačko). Živali so posamezno postavili v stekleno komoro in zabeležili trajanje (s) lizanja šap med 0 in 5min po injiciranju kapsaicina in nato analizirali.

Nocicepcija, ki jo povzroča glutamat

V metodi, ki so jo opisali Beirith et al. (2002), raztopina glutamata v PBS (20 ul) (l-glutaminsko kislino, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/tačko) so miši eno uro po zdravljenju vbrizgali v plantarni predel zadnje desne tace (hidroetanolni izvlečekC. salsaali morfin 2,5 mg/kg). Živali so posamezno postavili v stekleno komoro in zabeležili trajanje lizanja šape (v sekundah) med 0 in 15 min po injiciranju glutamata in nato analizirali.

Statistična analiza

Kemijski podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD petih poskusov. Vse farmakološke poskusne skupine so sestavljale najmanj šest miši. Analiza enosmerne variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnettov test, je omogočila vizualizacijo statistične pomembnosti med skupinami z uporabo programske opreme GraphPad Prism 5.0.pvrednosti so veljale za pomembne, ko so bile manjše od 0,05 (p < 0.05).

Diskusija

Skupno je bilo ugotovljenih deset fenilpropanoidnih glukozidovC. salsa(raste v Kazahstanu) ekstrakt hidroetanola. Ehinakozid (10,98 mg/g), akteozid (9,44 mg/g) in tubulozid B (7,94 mg/g) so bile glavne identificirane spojine. Pridobljeni podatki so bili povezani z razpoložljivo literaturo za vrsteCistancheki rastejo v različnih regijah Azije (Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). Ehinakozid in akteozid sta glavni sestavini, ki tvorita osnovo za standardizacijo zdravilnih vrstC. deserticolainC. tubulosa, uvrščen v Kitajsko farmakopejo leta 2005. Predlagamo, da bi te spojine lahko uporabili tudi za standardizacijoC. salsastolonov iz Kazahstana, saj so glavni v proučevanem ekstraktu hidroetanola.

Glede na farmakološke rezultate te študije je mogoče domnevati, da je CSHE učinkovito sredstvo proti nevrogeni bolečini in vnetju, kot so opazili v formalinskem testu. Kolikor nam je znanoC. salsani bilo nikoli preizkušeno v zvezi z njegovim antinociceptivnim delovanjem. Študija iz leta 2002 zC. deserticola(Lin et al., 2002) je pokazala, da je ta rastlina pokazala antinociceptivno in protivnetno delovanje pri testiranju na modelih, kot so popolno zvijanje, formalin in edem šape. Čeprav ni bilo nobenega poskusa, da bi raziskali glavne sestavine v ekstraktih, ki so bile aktivne, so menili, da sta ekstrakt butanola in vodna plast aktivni. Ni presenetljivo, da so ta topila na lestvici polarnosti, ki se ujema s fenilpropanoidomglikozidi, ki jih najdemo vC. salsa. Poleg tega so Lin in sodelavci ugotovili, da je antinociceptivno delovanjeC. deserticolaizvlečkov ni bilo posledica delovanja spojine na opiatni receptorali povezane z imunskim sistemom. V naši študiji je ekstrakt, bogat s fenilpropanoidom, pokazal aktivnost v obeh fazah formalinskega testa. Opažena aktivnost je bila dejansko posledica raziskane farmakološke tarče in ne morebitne motorične spremembe, kot je razvidno iz testa rota palice. Rezultati formalinskega testa kažejo na možnost nevrogene bolečine in bolečine, ki jo povzročivnetni mediatorji. Sprva smo se odločili raziskati pot nevrogene bolečine. Ker podobne spojine iz drugih predhodno raziskanih vrst niso pokazale aktivnosti opiatnih receptorjev, smo se odločili testirati druge modele, kot so modeli glutamata in kapsaicina.

Glutamat je ekscitatorni nevrotransmiterki ima pomembno vlogo pri modulaciji bolečine v celotnem perifernem in centralnem živčnem sistemu. To delovanje posredujejo od liganda odvisni ionotropni glutamatni receptorji(iGluRs) in metabotropnih glutamatnih receptorjev. iGluR-je lahko razdelimo naN-metil-d-aspartat (NMDA) in -amino-3-hidroksi-5-metilizoksazol-4-propionska kislina (AMPA) (Kolber, 2015). Raziskave so pokazale, da pri antagoniziranju receptorjev NMDA in AMPA s ketaminom inkainateopazimo antinocicepcijski učinek. Vendar pa so antagonisti, ki so doslej ciljali na te receptorje, povzročili znatne neželene učinke, zato je bila izvedena nova raziskava, osredotočena na mGluR, v upanju, da bo zdravilo, posredovano prek tega receptorja, povzročilo manj stranskih učinkov (Palazzo et al., 2014). Rezultati testiranja CSHE so pokazali, da je bilo to zdravljenje učinkovito pri zmanjševanju bolečine, ki jo povzroča glutamat. Še vedno pa ni znano, ali je ta učinek posredovan preko ionotropnih in/ali metabotropnih receptorjev. Morfin je eno od razpoložljivih zdravil, ki učinkuje na glutamatergični prenos (Deyama et al., 2007).). V literaturi je navedeno, da aktivacija glutamatnega receptorja poveča odziv TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Iz tega razloga je možno, da je učinek, opažen za CSHE, posledica aktivnosti na TRPV1 in ne nujno neposrednega odziva na glutamatne receptorje.

Naslednji korak te raziskave je bila izvedba testa lizanja šape z uporabo kapsaicina kot protibolečinskega sredstva, ki je agonist receptorja TRPV1. Rezultati so pokazali, da je CSHE dejansko zmanjšal bolečino prek receptorja TRPV1.

V primeru CSHE smo skoraj pri vseh testiranih metodologijah opazili, da je odmerek 30 mg/kg dosegel boljše rezultate kot 100 mg/kg. To je lahko posledica nasičenosti raztopine, ki vodi do oborjenih spojin in dejansko manjše količine zdravil, ki so biološko razpoložljive.

Potrditev ugotovljene kemične sestave za kazahstanski izvleček CSHE je bil pomemben korak, saj je bilo antinociceptivno/protivnetno delovanje glavnih sestavin, prisotnih v njem, že nekako potrjeno. Na primer, ehinakozid je bil uveljavljen kot ena od učinkovin, odgovornih za antinociceptivno delovanjeEchinaceae(Hostettmann, 2003). Tudi prejšnja študija Schapovala in sodelavcev (Schapoval et al., 1998) je izpostavila akteozid kot eno glavnih učinkovin v etanolnem ekstraktu, pripravljenem zStachytarpheta cayennensisocenjeno z edemom šape in modeli vročih plošč. Tudi Backhouse in sodelavci (Backhouse et al., 2008) menijo, da je akteozid aktivno načeloBuddlejaglobosaz uporabo več modelov ocenjevanja bolečine, vključno s formalinskim testom. Zdaj se razvijajo nove formulacije z uporabo najsodobnejšega znanja za povečanje stabilnosti in podaljšanje antinociceptivnega delovanja akteozida (Isacchi et al., 2016).

Zaključek

V stolonih Kazahstanca je bilo identificiranih deset snovi fenolne naraveC. salsas HPLC/MS analizo. Te spojine bi lahko bile odgovorne za antinociceptivno aktivnost, opaženo v eksperimentalnih modelih, izvedenih tukaj. Glede na to, da je na ozemlju Kazahstana rodCistancheje zastopana predvsem po vrstahC. salsa, lahko priporočamo njegovo nabiranje in standardizacijo z uporabo ehinakozida in akteozida kot standardnih spojin, da pridobimo kakovostne surovine za tradicionalno kitajsko medicino.