Protivirusni nanodelci cinkovega oksida, posredovani s hesperidinom in in silico Primerjalna študija med protivirusnimi fenoli kot proti SARS-CoV-2

Za več informacij pošljite e-poštotina.xiang@wecistanche.com

Od januarja 2020 je Elsevier ustvaril center za vire COVID-19 z brezplačnimi informacijami v angleščini in mandarinščini o novem koronavirusu COVID-19. Središče z viri COVID-19 gostuje na Elsevier Connect, javnem spletnem mestu z novicami in informacijami podjetja. Elsevier s tem dovoli, da so vse njegove raziskave v zvezi s COVID-19-, ki so na voljo v centru za vire COVID-19 – vključno s to raziskovalno vsebino – takoj na voljo v PubMed Central in drugih javno financiranih repozitorijih, kot je WHO Podatkovna baza COVID s pravicami do neomejene ponovne raziskovalne uporabe in analiz v kakršni koli obliki ali na kakršen koli način z navedbo izvirnega vira. Ta dovoljenja Elsevier podeljuje brezplačno, dokler je center za vire COVID-19 aktiven.

POVZETEKKoronavirus 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV-2), ki je povzročil koronavirus (COVID-19), je virus, odgovoren za več kot 69.613.607 milijonov okužb in več kot 1.582.966 smrti po vsem svetu. Vsi ukrepi in protokoli zdravljenja so veljali le za podporo in ne za zdravljenje. Med sedanjo pandemijo koronavirusa je bilo iskanje farmacevtske ali tradicionalne komplementarne in integrativne medicine za pomoč pri preprečevanju, zdravljenju in okrevanju koristno. Ti fitofarmacevtski izdelki in nutracevtiki so lahko bolj ekonomični, dostopni, varni in imajo manj stranskih učinkov. To je in silico primerjalna študija desetih fenolnihprotivirusnoučinkovin proti SARS-CoV-2, kot tudi izolacija najaktivnejšega metabolita iz naravnih virov. Nato so bili pripravljeni tudi nanodelci cinkovega oksida (ZnO NP) z uporabo teh metabolitov kot reducenta. Vse testirane spojine so pokazale predvideno aktivnost proti SARS-CoV-2.Hesperidinje pokazal najvišjo oceno priklopa, kar nas je pripeljalo do tega, da smo ga izolirali iz pomarančnih lupin, njegovo strukturo pa smo potrdili s konvencionalno spektroskopsko analizo. Poleg tega je bila sinteza nanodelcev cinkovega oksida hesperidina označena z UV, IR, XRD in TEM. In vitro protivirusno delovanje hesperidina in ZnO NPs je bilo ovrednoteno proti virusu hepatitisa A kot primeru virusov RNA. Vendar sta NP ZnO in hesperidin pokazala protivirusno aktivnost proti HAV, vendar sta NP ZnO pokazala večjo aktivnost kothesperidin. Tako so hesperidin in z njim posredovani nanodelci ZnO pripravljena protivirusna sredstva, zato so potrebne nadaljnje študije proti SARS-CoV-2, da bi jih uporabili kot možno zdravljenje.

Ključne besede: SARS-CoV-2 Nutracevtiki Molekularno spajanje Nanodelci cinkovega oksida Hesperidin

1. Uvod

Trenutna pandemija COVID{0}} je do danes odgovorna za več kot 69 milijonov okužb in več kot 1,5 milijona smrti po vsem svetu, 2,3 milijona okužb in več kot 55000 smrti v Afriki ter več kot 119,{{9} } okužb in več kot 6000 smrti v Egiptu [1]. Pri večini posameznikov, okuženih s SARS-CoV-2, simptomi vključujejo blago do zmerno bolezen dihal, ki se lahko pozdravi brez posveta z zdravnikom. Vendar imajo posamezniki s kroničnimi boleznimi, kot so bolezni srca in ožilja, sladkorna bolezen, kronične bolezni dihal ali rak, večje tveganje za razvoj akutnih respiratornih simptomov. Prenos COVID-19 preprečujemo z vzdrževanjem socialne distance, umivanjem rok ali uporabo sterilizacije z alkoholom ter nedotikanjem obraza. Kjer se prenaša skozi kapljice sline iz nosu osebe, ko okuženi posameznik kašlja ali kihne [1]. Vsi ukrepi in protokoli so veljali le za podporne, ne pa tudi za zdravilne. Vendar pa obstaja veliko trenutnih kliničnih preskušanj, ki ocenjujejo potencialna zdravila [1]. Od trditve, da je COVID-19 globalna pandemija, je bilo treba poiskati farmacevtsko ali tradicionalno, komplementarno in integrativno medicino za pomoč pri preprečevanju, zdravljenju in okrevanju [2].

Naravni izdelki so neizkoriščeni viri spojin, ki jih je mogoče uporabiti pri preprečevanju in zdravljenju različnih bolezni. Poleg tega so naravne spojine pogosto služile kot cenejša in varnejša zdravila proti številnim boleznim, poročali so, da imajo številne prehranske spojineprotivirusne dejavnosti[3]. V zadnjem desetletju se je število novihprotivirusna zdravilapridobivanja iz naravnih virov se je močno povečalo. Naravni izdelki neposredno ali posredno pomagajo pri odkrivanju protivirusnih zdravil [4].

Zato lahko pregledovanje knjižnic naravnih spojin z računalniškimi metodami presejanja, kot je molekularno spajanje, prihrani čas in denar pri razvoju zdravil [3].

Po drugi strani so spojine, ki vsebujejo Znic (Zn), pokazaleprotivirusne lastnostiproti številnim virusom v skladu s fizikalnimi procesi, kot je pritrditev virusa, okužba z virusom in odstranjevanje ovoja. Poleg zaviranja virusne proteaze in polimeraze [5]. Na splošno je Zn bistveni element, ki ga najdemo v tkivih našega telesa, kot so mišice, možgani, koža in kosti. Je tudi bistvena sestavina različnih encimskih sistemov, ki sodelujejo pri presnovi ter biosintezi nukleinske kisline in beljakovin [5].

Opozoriti je treba, da telo ZnO NP lažje absorbira kot sam cink. ZnO NP se trenutno uporabljajo v prehrambeni industriji kot dodatki in v embalaži. Poleg tega je ameriška uprava za hrano in zdravila ZnO kategorizirala kot varno snov. Zato so ZnO NP privlačni za uporabo v biomedicinskih aplikacijah. Za NP ZnO so značilni nizki ekonomski stroški in nizka toksičnost, zato se NP ZnO lahko široko uporabljajo v biomedicinskih aplikacijah kot antibakterijsko, proti raku, antidiabetično, protivnetno, za dostavo zdravil in celjenje ran [6].

Nedavno so poročali, da spojine, ki vsebujejo Zn, kažejo aktivnost proti SARS-CoV-2 [7] Zato so zdravila, ki vsebujejo Zn, običajno predpisana v protokolih za zaščito pred COVID-19. Zato si zelena sinteza ZnO NP zasluži posebno pozornost.

V tem delu so številne fitofarmacevtske fenolne spojine iz pogosto uporabljenih zdravilnih rastlin in živil (nutricevtiki) podvržene molekularni študiji in silico, da bi raziskali protivirusno delovanje proti SARS CoV-2 glavni proteazi (Mpro) in eksperimentalno spojino z najvišjo oceno priklopa bo poleg posredovanih nanodelcev ZnO testiran proti virusu hepatitisa A (HAV), virusu RNA, podobnemu SARS− COV- 2.

2. Materiali in metode

2.1. Molekularno združevanje

Glavna proteaza (Mpro) je pomemben encim, ki ga kodira genom koronavirusa, z bistveno vlogo pri replikaciji virusa in procesu prepisovanja, zaradi česar je primerna tarča zdravil za SARS-CoV-2. Da bi razkrili mehanizem zaviranja izbranih polifenolnih spojin, kot so rutin, korilagin, diosmin, miricetin-3-O-ksilozil-(1→2)-ramnozid, epigalokatehin-3-O-galat,hesperidin, lyoniresinol, miricetin, naringenin in kvercetin 3-O-glukuronid v primerjavi s kristalno strukturo SARS-CoV-2 Mpro (6lu7) [8], ki so bili uporabljeni z ločljivostjo 2,1 Aᵒ. Uporabljali so ga za molekularno spajanje in silico. Ta protein je sestavljen iz dveh polipeptidov, znanih kot protomera A in B. Ta dimer ima kristalografsko simetrijo vzdolž dvojne osi. Vsebuje tri domene; domena I (ostanki 8–101), domena II (ostanki 102–184) z antiparalelno listnato strukturo in domena III (ostanki 201–303) ima pet vijačnic, razporejenih kot antiparalelne sferične skupine. Kjer je domena III povezana z domeno II z regijo dolge zanke (ostanki 185–200). SARS-CoV-2, Mpro, ima Cys-His sklopljeno katalitično aktivnost, kjer se mesto za vezavo substrata nahaja v razcepu med domeno I in domeno II [8], kot je prikazano na sliki 1. V trenutni študiji , je postopke molekularnega priklopa izvedla švicarska služba Swiss Dock [9]. Z uporabo EADock DSS, ki izvaja slepo priklop, in njegove energije CHARMM so bile ocenjene na mreži, kjer so bile najugodnejše energije ocenjene z FACTS in združene v gruče. Te skupine je mogoče vizualizirati in interpretirati z uporabo Chimera, kot je navedeno v literaturi [10].

2.2. Rastlinski materiali, ekstrakcija in izolacija

Pomarančne lupine (500 g) so bile kupljene v lokalni tovarni sokov. Pomarančne lupine (200 g) smo ekstrahirali z 2 L vroče destilirane vode do izčrpanosti. Ekstrakt smo filtrirali in uparili, da je postal bolj koncentriran pod vakuumom. Vodni ekstrakt smo porazdelili s CH2Cl2, ki mu je sledil butanol. Subfrakcijo butanola smo nanesli na liste filtrirnega papirja Whatman 3 MM z uporabo BAW kot eluenta [12,11], da smo dobili velik temno vijoličen pas pod ultravijolično (UV) svetlobo. Temno vijoličen trak smo izolirali in macerirali v metanolu, nato pa uparili pod vakuumom z uporabo rotacijskega uparjalnika. Posušen material smo nanesli na kolono Sephadex LH -20 z uporabo EtOH/H2O (1:1) kot eluenta, da smo dobili 120 mghesperidin.

2.3. Jedrska magnetna resonanca (NMR)

Spektri 1H-jedrske magnetne resonance (NMR) so bili posneti na Bruker Avance III, 400 MHz NMR spektrometer in 100 MHz za 13C NMR. Kemični premiki 1H (δ) so bili izmerjeni v ppm glede na TMS in 13C-NMR kemični premiki na dimetil sulfoksid-d6 in pretvorjeni v lestvico TMS z dodajanjem 39,5.

2.4. Sinteza nanodelcev cinkovega oksida (ZnO NPs)

s 500 mg cinkovega acetata, raztopljenega v 50 ml bi-destilirane vode in segrevamo v vreli vodni kopeli 20 minut. V reakcijo smo nato dodali pet kapljic amonijevega hidroksida, da smo pH dvignili na 12, kjer je nastala oborina ZnO NPs. Zmes smo pustili pol ure za popolno redukcijo cinkovega acetata v ZnO NP. Nastalo oborino smo centrifugirali pri 8000 obratih na minuto, čemur je sledilo dvakratno pranje z bi-destilirano vodo in dvakratno pranje z etanolom, da smo po sušenju z zamrzovanjem dobili bele pelete ZnO NP.

2.5. Karakterizacija kovinskih nanodelcev

2.5.1. UV-vis spektralna analiza

Pripravke NP ZnO smo pregledali z UV spektrofotometrom, Shimadzu, UV-1601 (Shimadzu Corporation, Japonska). UV spektri so bili posneti med 200−400 nm.

2.5.2. FT-IR analiza

Funkcionalne skupine sintetiziranih nanodelcev cinkovega oksida in hesperidinske spojine smo karakterizirali s spektrometrom FTIR 6100 (Jasco, Japonska) v območju 4000 – 400 cm−1.

2.5.3. Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM)

Morfologijo in velikost delcev ZnO NP, posredovanih s hesperidinom, sta določili s TEM (JEOL-JEM-1011, Japonska). Kapljice suspenzije nanodelcev so bile postavljene na z ogljikom prevlečeno bakreno mrežo in topilo je bilo uparjeno pri sobni temperaturi pred snemanjem slike TEM.

2.5.4. Rentgenska difrakcija (XRD)

Rentgenski difrakcijski vzorec ZnO NP, posnet z rentgenskim difraktometrom PANLYTICAL z uporabo Cu K sevanja valovne dolžine 1d706; =0.1541 nm v območju skeniranja 21d703;=20− 70∘.

2.6. Ocena protivirusne aktivnosti

Protivirusni pregled je bil izveden z uporabo testa inhibicije plakov v Regionalnem centru za mikologijo in biotehnologijo (RCMB, Univerza Al Azhar, Kairo, Egipt).

2.6.1. Celična linija sesalcev

Celice Vero, pridobljene iz ledvic afriške zelene opice, so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC, Manassas, VA, ZDA).

Celice Vero so bile razmnožene v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM), dopolnjenem z 10 odstotki toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma (FBS), pufrom HEPES, 1 odstotkom L-glutamina in 50 ug/ml gentamicina. Vse celice so bile kultivirane pri 37 ◦C v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2 in dvakrat subkultivirane po 7 dni [14].

2.6.2. Ocena citotoksičnosti

hesperidina in ZnO NP smo dodali po 24 urah po implantaciji. Serijske dvakratne razredčitve testiranih vzorcev (začetek od 3000 ug/mL do 2 ug/mL) so bile dodane konfluentnim celičnim monoslojem, razporejenim v mikrotitrske plošče z 96-vdolbinami z ravnim dnom (Falcon, Jersey, NJ, ZDA). ) z uporabo večkanalne pipete. Mikrotitrske plošče smo inkubirali pri 37 ◦C v navlaženem inkubatorju s 5 odstotki CO2 za obdobje 2 dni. Za vsako koncentracijo preiskovanih vzorcev smo uporabili tri vdolbinice. Kontrolne celice smo inkubirali brez testnih vzorcev in z ali brez DMSO.

Po inkubacijskem obdobju je bil donos živih celic določen s kolorimetričnim testom MTT [15]. Razmerje med preživelimi celicami in koncentracijo testiranih vzorcev je bilo narisano, da bi dobili krivulje preživetja celične linije Vero po obdelavi s specifičnimi spojinami. 50-odstotna citotoksična koncentracija (CC50), koncentracija, ki je potrebna za povzročitev toksičnih učinkov v 50 odstotkih nedotaknjenih celic, je bila ocenjena iz grafičnih prikazov krivulje odmerek-odziv za vsako koncentracijo z uporabo programske opreme GraphPad Prism (San Diego, CA. ZDA). Največja netoksična koncentracija [MNTC] vsakega hesperidina in ZnO NP je bila določena in uporabljena za nadaljnje biološke študije.

2.6.3. Širjenje virusa

Citopatogeni sev HAV HM175 (ATCC VR-1402) HAV je bil razmnožen in testiran v konfluentnih celicah Vero [16]. Infektivne viruse smo prešteli z določitvijo 50-odstotnega infektivnega odmerka tkivne kulture z osmimi vdolbinicami na razredčino in 20 μL inokuluma na vdolbinico z uporabo metode Spearman-Karber [17].

3. Rezultati in razprava

Deset prehranskih fenolnih spojin smo izbrali glede na njihovo razpoložljivost in razširjenost kot farmacevtske dozirne oblike, pridobljene iz naravnih prehranskih virov hrane.

Ti nutracevtiki so bili diosmin, rutin, naringenin, kvercetin 3-oglukuronid, miricetin 3-O-ksilozil-(1→2)-ramnozid, miricetin, epigalokatehin-3-O-galat, korilagin in lyoniresinol. Hesperidin, diosmin in rutin so široko dostopni v farmacevtskih trgovinah pod različnimi trgovskimi imeni in jih je mogoče pridobiti iz različnih naravnih hranilnih živil, za katera poročajo, da imajo protivirusne lastnosti, na primer, hesperidin iz lupine citrusov naj bi imelprotivirusno delovanje[18]. Na podlagi presejanja in silico je bilo tudi predvideno, da bo hesperidin ciljal na mesto interakcije med SARS-CoV-2 Spike in receptorji ACE2 ter tako blokiral vstop virusa v človeške pljučne celice. Zato bi lahko bil hesperidin obetavno profilaktično zdravilo proti COVID-19 [19].

Poleg tega so poročali o naringeninu iz olupkov citrusov kot protivirusnem sredstvu proti virusu Zika [20], rutin [21] pa je pokazal znatne protivirusne rezultate [19]. Epigalokatehin-3-O-galat zelenega čaja imaprotivirusni učinkiproti številnim virusom DNA in RNA [22]. Corilagin preprečuje poškodbe jeter z zaviranjem replikacije HCV in modulacijo oksidativnega stresa [23]. Za miricetin in njegove glikozilirane derivate so poročali o delovanju proti HIV [24]. Poleg tega so poročali, da ima več lignanovprotivirusnolastnosti [25].

3.1. Molekularno združevanje

V trenutni raziskavi so poskušali interpretirati in podpreti eksperimentalne ugotovitve v zvezi z zaviralnim mehanizmom glavne proteaze COVID-19. Deset polifenolnih spojin je bilo priklopljenih s pomočjo švicarskega priklopnega strežnika, kjer so bili za te polifenole uporabljeni pristopi, ki temeljijo na receptorjih. Kristalna struktura Covid-19 proteaze 6lu7, ki ima obliko srca, z dvema dimerjema enakih podenot in dvema aktivnima mestoma. zaviralec širokega spektra bi moral ciljati na aktivno mesto His 41 in Cys 148 koronavirusa prednikov netopirjev, kot v vnosu PDB 4yoi. Ta študija je pojasnila način vezave fenolnih spojin na kristalno strukturo 6lu7 s pomočjo molekularnega priklopa (slika 2). Študija priklopa je potrdila, da lahko hesperidin tvori elektrostatične interakcije z ostanki THR 25, LEU 27, His 41 in Gly143, medtem ko tvori interakcijo pi-stacking s TYR 118, kot je navedeno v tabeli 1.

Večina polifenolnih spojin je pokazala inhibicijsko aktivnost v razcepljenem območju med domeno II, III (ostanki 185–200) in domeno In, kot je prikazano na sliki 2, medtem ko so bile v tabeli 1 polifenolne spojine navedene glede na njihovo vezno energijo. Razmerje RMSD z izvornim načinom vezave (polna sposobnost (modra, leva X-os)) in energijo (preprosta sposobnost (rdeča, desna y-os)) je bilo prikazano na sliki A (dobavna datoteka) . Način priklopa za hesperidin je bil prikazan na (sliki B za SARS-CoV-2 Mpro in sliki C za proteinazo HAV 3C [26], kristalna struktura 2HAL), miricetinu (sliki D,1,2), diosminu (Sliki E 1,2), epigalokatehin-3-O-galat (Sliki F1,2), rutin (Sliki G1,2), kvercetin 3-O-glukuronid (Sliki H 1,2), korilagin (sliki I1,2), miricetin (sliki J1,2), naringenin (sliki L1,2) in lioniresinol (sliki M1,2), v dodatni datoteki.

3.2. Izolacija in identifikacija hesperidina

Ker je hesperidin pokazal najvišjo oceno priklopa, smo ga tukaj izolirali iz živilskih odpadkov (pomarančne lupine) in ovrednotili njegovo protivirusno delovanje proti HAV (eden od virusov RNA).

Butanolno frakcijo iz vodnega ekstrakta pomarančnih lupin smo nanesli na liste filtrirnega papirja Whatman z uporabo BAW kot eluenta, pri čemer smo opazili velik temno vijoličen pas flavonoidne narave na preparativni papirni kromatografiji. Elucija glavnega temno vijoličnega pasu z metanolom je privedla do izolacije čiste spojine, katere identiteta je bila potrjena z 1 H, 13C, da je hesperidin [27], kot sledi: 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 δ 5,50 (dd, J=12.2, 3.4 Hz, 1H, H-2), 2.78 (dd, J =3.24 Hz & 17.16, 1H, H{{22} }ax), 3,26 (dd, J=17.16, 8,22 Hz, 1H, H-3eq), 6,14 (brs, 1H, H-6), 6,12 (brs, 1H , H-8), 4,97 (d, J =7,2 Hz, 1H, H-1′′), 4,53 (s, 1H, H-1′′ ), 1,09 (d, J=6.2, 3H, CH3 ramnoze).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) 8 78,89 (C-2), 42,74 (C{{64}) }), 197,48 (C-4), 163,50 (C-5), 96,85 (C-6), 165,60 (C-7), 96,00 (C{{79} }), 162,96 (C-9), 103,79 (C-10), 131,35 (C-1′), 118,42 (C-2′), 146,92 (C{{ 94}}'), 148,43 (C-4'), 112,50 (C-5'), 114,60 (C-6'), 56,15 (O-Me), 99,91 (C{ {109}}′′), 73,45 (C-2′′), 76,73 (C-3′′), 70,06 (C-4′′), 75,98 (C{{121 }}′′), 66,50 (C-6′′), 101,06 (C-1′′), 70,73 (C-2′′), 71,17 (C{{133 }}'''), 72,53 (C-4''), 68,78 (C-5''), 18,29 (CH3 ramnoze; C-6''').

3.3. Nastajanje nanodelcev ZnO

Dodatek raztopine cinkovega acetata raztopini hesperidina v vodni kopeli, segreti na 80 ◦C, čemur je sledil dodatek nekaj kapljic amoniaka, je povzročil precipitacijo ZnO NP [13].

3.3.1. UV analiza

Največji absorpcijski vrh za ZnO NP, sintetiziran preko hesperidina, je pokazal vrh pri 335 nm (slika 3a), kar potrjuje nastanek ZnO NP [28]. ZnO na nanometru ima krajše valovne dolžine v primerjavi s standardnim vzorcem absorpcije ZnO, kar je v skladu s poročili, da imajo materialni oksidi običajno krajše valovne dolžine in da imajo materiali na nanometru krajše valovne dolžine [29].

3.3.2. FT-IR analiza ZnO NP in hesperidina

FT-IR spektri (slika 3b) pripravljenih ZnO NP in hesperidina so bili zbrani v območju spektralne širine od 400 do 4000 cm−1. Kjer so pokazali vrhove za O–H skupine, ki se raztezajo v vodi okoli 3546,04, 3478,29 in 3421,80 cm − 1 predstavljajo O–H skupine hesperidina in okoli 3382,99 cm− 1 za ZnO NP. Aromatske dele smo potrdili z raztezanjem ogljikove dvojne vezi pri 2918,50 cm−1. Upogibne vibracije alkoholnega –CO–H, potrjene s prisotnostjo vrha pri 1096,12 cm−1. Značilni pasovi razteznih načinov ZnO NP so dodeljeni pri 542,9 in 891,2 cm−1 [13,30].

3.3.3. Analiza TEM

Analiza TEM je bila izvedena na transmisijskem elektronskem mikroskopu z nizko ločljivostjo in visoko ločljivostjo in je pokazala nastanek heksagonalnih ZnO NP z velikostjo delcev od 20 do 30 nm, slika 4.

3.3.4. XRD analiza

Pojav ZnO NP in preiskavo njihovih strukturnih značilnosti je potrdila rentgenska difrakcija (XRD), slika 5. ZnO NP, ki jih posreduje flavonoid hesperidin, so pokazali vrhove z vrednostmi 2θ, ugotovljenimi pri 31,618◦, 34,334◦, 36,161◦, 47,504 ◦, 56.440◦, 62.727◦, 66.245◦, 67.864◦ in 68.925◦, kar ustreza (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) in (201). Ti vrhovi so bili usklajeni s tistimi na podatkovni kartici (00− 003-0888).

Velikost kristalov ZnO NPs je bila izračunana na 27,73 nm. Ti podatki so zelo podobni meritvam TEM. Za izračun velikosti kristala uporabimo Scherrerjevo enačbo

Velikost kristala {{0}} (0,9 x λ)/(dcosθ)

Θ=2θ/2, d=polna širina pri polovici največje intenzitete vrha (v Rad), λ =0.154060 nm

3.4. Protivirusno delovanje

3.4.1. Vrednotenje citotoksičnosti proti celicam Vero

Dva vzorca hesperidina in ZnO NP sta pokazala 50-odstotno celično citotoksično koncentracijo (CC50)=620.8 ± 34,6 oziroma 243,7 ± 12,7 ug/mL. Kot je prikazano na sl. K. & L., dop. in vrednosti so bile navedene v tabelah C in D. Nato so te spojine testiraliprotivirusni učinkiproti HAV pri največji netoksični koncentraciji (MNTC) z uporabo metode testiranja plakov, prikazane na sliki M. (dodatna datoteka).

3.4.2. Aktivnost proti HAV

Poročali so, da imajo flavonoidi protivirusno delovanje in vivo in in vitro [31]. Poročali so, da je mehanizem delovanja nekaterih flavonoidov proti virusu HIV (tudi virusu RNA) posledica zaviranja fosforilacije proteinov, ki jo posredujejo citokini. Upoštevati je treba tudi, da je fosforilacijsko signaliziranje, posredovano s citokini, povečano pri okužbi s COVID-19, kar vodi do fosforilacije številnih citoskeletnih proteinov. Zato lahko flavonoidi, ki vključujejo hesperidin, zavirajo fosforilacijo beljakovin, kar posledično vodi do močnega protivirusnega delovanja in preprečevanja okužb drugih celic [32]. Poročali so tudi, da imajo ZnO NP protivirusno delovanje [32,33].

Poročali so, da spojine, ki vsebujejo Zn, vplivajo na različne stopnje virusnih replikacijskih ciklov, kot so inaktivacija virusa, inhibicija odstranjevanja prevleke virusa, transkripcija virusnega genoma, prevajanje virusnih beljakovin in procesiranje poliproteinov. Opozoriti je treba tudi, da je aktivnost odvisna od vrste virusa in koncentracije spojin, ki vsebujejo cink [34].

V naši študiji so bile konfluentne monosloje celic Vero okužene s fiksnimi razredčinami virusa HAV. Po inkubaciji smo inokulum odstranili in nadomestili z MEM brez seruma, ki je vseboval 1,5 odstotka karboksimetil celuloze. Celice so bile nato inkubirane, kar je omogočilo virusu, da tvori plake. Celice smo fiksirali 2 uri pri 25 ◦C s formaldehidom, ki smo ga dodali neposredno v medij do koncentracije 5 odstotkov. Fiksne celice smo temeljito sprali z vodo, preden smo jih 30 minut obarvali z raztopino, ki je vsebovala 1 odstotek kristalno vijolične in 10 odstotkov etanola. Po izpiranju z vodo smo prešteli število plakov in izračunali virusne titre (štetja). Protivirusni učinki dveh testiranih vzorcev, hesperidina in ZnO NP proti HAV pri največji necitotoksični koncentraciji (MNCC), so prikazani v tabeli B (dodatna datoteka). Nanodelci cinkovega oksida so pokazali večjo aktivnost kot hesperidin pri relativno nizkih koncentracijah zaradi velike površine in majhne velikosti delcev, kar je povečalo aktivnost nanodelcev cinkovega oksida. Iz tabele B, slike T, (dodatna datoteka). Tako hesperidin kot ZnO NP sta pokazala protivirusno aktivnost proti virusu hepatitisa A (HAV) z odstotki 44,75 in 58,83 odstotka pri največji necitotoksični koncentraciji in EC50 enakih 72,4 oziroma 176,3 ug/mL, kot je prikazano v tabelah A in B (dodatna datoteka).

4. Sklepi

Trenutna pandemična bolezen COVID-19 je odgovorna za veliko obolevnosti in umrljivosti po vsem svetu. Fenolne spojine prehranskih in fitofarmacevtskih izdelkov, ki jih preučujemo v naši študiji, kažejo dobre rezultate priklopa in bi lahko bile idealna tarča za zdravljenje SARS-CoV-2. Hesperidin, ki je bil izoliran iz živilskih odpadkov pomarančne lupine, je med drugimi testiranimi spojinami pokazal najvišjo oceno priklopa (-8,84 Kcal/mol) proti glavni proteazi SARS-CoV-2. Hesperidin je sposoben redukcije cinkovih ionov za pripravo ZnO NP s šesterokotno obliko in velikostjo delcev približno 25 nm. S hesperidinom posredovani ZnO NPs kažejo večjo protivirusno aktivnost kot sam hesperidin z odstotki 44,75 in 58,83 odstotka pri največji necitotoksični koncentraciji. Za iskanje varnih, poceni in možnih zdravil za pandemično bolezen SARS-CoV-2 je treba opraviti več študij za hesperidin, druge prehranske dodatke, fitofarmacevtske spojine in njihove ZnO NP.

Avtorski prispevki Gouda H. Attia, Yasmin S. Moemen, Mahmoud Youns, Ammar M. Ibrahim, Randa Abdou, Mohamed A. El Raey Gouda H. Attia in Mohamed A. El Raey oblikujejo rokopis. Gouda H. Attia, Ammar M. Ibrahim in Mohamed A. El Raey so izvedli kromatografsko ločitev in razjasnili strukturo čistega izoliranega hesperidina. Gouda H. Attia, Randa Abdou in Mohamed A. El Raey so izvedli zeleno sintezo ZnO NP in opišite njegove značilnosti. Yasmin S. Moemen je izvedla vse študije molekularnega združevanja in Mohamed A. El-Raey predlaga protein.

Mahmoud Youns in Randa Abdou sta opravila protivirusne in citotoksične teste ter analizo podatkov. Vsi avtorji so bili odgovorni za pripravo in pisanje končne različice rokopisa ter odobritev končnega rokopisa.

financiranje

Za to delo niso prejeli nobenih sredstev.

Raziskovalna etika

Nadalje potrjujemo, da je bil kateri koli vidik dela, zajetega v tem rokopisu, ki je vključeval človeške bolnike, opravljen z etično odobritvijo vseh ustreznih organov in da so takšne odobritve priznane v rokopisu.

Odobritev IRB je bila pridobljena (potrebno za študije in serije 3 ali več primerov)

Pisno soglasje za objavo potencialno identifikacijskih informacij, kot so podrobnosti o primeru in fotografije, je bilo pridobljeno od pacienta(-ov) ali njihovega zakonitega skrbnika(-ov).

Izjava o konkurenčnem interesu

Avtorji ne poročajo o izjavah o interesih.

Zahvala

Hvaležni smo dekanatu za znanstvene raziskave, Univerza Najran, KSA, za zagotovitev sredstev za izvedbo tega projekta (NU/MID/18/024).

Dodatek A. Dodatni podatki

Dodatno gradivo v zvezi s tem člankom je na voljo v spletni različici na DOI: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.111724.

Gouda H. Attiaa,b , Yasmine S. Moemenc , Mahmoud Younsd , Ammar M. Ibrahime ,  Randa Abdouf,g , Mohamed A. El Raeyh, *  

a Oddelek za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza Najran, Najran, Savdska Arabija
b Oddelek za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza Kafr El-Shiekh, Kafr El-Shiekh, Egipt
c Oddelek za klinično patologijo, Nacionalni inštitut za jetra, Univerza Menoufia, Menoufia, Egipt
d Oddelek za biokemijo in molekularno biologijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza Helwan, Kairo, Egipt
e Visoka šola za uporabno medicinsko znanost, Univerza Najran, Najran, Savdska Arabija
f Oddelek za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza Umm Al-Qura, Makkah, Savdska Arabija
g Oddelek za farmakognozijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza Helwan, Kairo, Egipt
h Oddelek za fitokemijo in rastlinsko sistematiko, Farmacevtski oddelek, Nacionalni raziskovalni center, Dokki, Kairo, Egipt

Reference

[1] Svetovna zdravstvena organizacija, Koronavirusna bolezen SZO (COVID-19), 2020 (dostopano 22. oktobra 2020), https://www.worldometers. info/koronavirus/#države.

[2] J. Hunter, S. Arentz, J. Goldenberg, G. Yang, J. Beardsley, D. Mertz, S. Leeder, Protokol hitrega pregleda: cink za preprečevanje ali zdravljenje COVID-19 in drugi okužbe dihalnih poti, povezane s koronavirusom, Integr. Med. Res. 9 (2020), 100457. [3] GJ Kotwal, Protivirusni nutracevtiki iz soka granatnega jabolka (Punica granatum), v Handb. Nutracevtiki, let. I, CRC Press, 2009, str. 338–346.

[4] L.-T. Lin, W.-C. Hsu, C.-C. Lin, Protivirusni naravni izdelki in zeliščna zdravila, J. Tradit. Dopolnjujejo. Med. 4 (2014) 24–35.

[5] A. Kumar, Y. Kubota, M. Chernov, H. Kasuya, Potencialna vloga dodatka cinka pri profilaksi in zdravljenju COVID-19, Med. Hipoteze (2020), 109848.

[6] J. Jiang, J. Pi, J. Cai, Napredek nanodelcev cinkovega oksida za biomedicinske aplikacije, Bioinorg. Chem. Appl. (2018), https://doi.org/10.1155/2018/ 1062562.

[7] AJW Te Velthuis, SHE van den Worm, AC Sims, RS Baric, EJ Snijder, MJ van Hemert, Zn2 plus zavira aktivnost RNA polimeraze koronavirusa in arterivirusa in vitro, cinkovi ionoforji pa blokirajo razmnoževanje teh virusov v celični kulturi, PLoS Patog. 6 (2010), e1001176.

[8] Z. Jin, X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Struktura M pro iz SARS- CoV-2 in odkritje njegovih zaviralcev, Nature (2020) 1–5.

[9] A. Grosdidier, V. Zoete, O. Michielin, SwissDock, spletna storitev za združevanje beljakovin in majhnih molekul, ki temelji na EADock DSS, Nucleic Acids Res. (2011), https://doi.org/10.1093/nar/gkr366.

[10] A. Kucukelbir, FJ Sigworth, HD Tagare, Kvantifikacija lokalne ločljivosti zemljevidov gostote krio-EM, Nat. Metode 11 (2014) 63–65.

[11] HH Barakat, M. El-Raey, SA Nada, I. Zeid, M. Nawwar, Konstitutivni fenoli in hepatoprotektivna aktivnost listov Eugenia supra-axillaris, EJ Chem. 54 (2011) 313–323.

[12] SM Osman, WA El Kashak, M. Wink, MA El Raey, Novi derivati ​​izorhamnetina iz Salsola imbricata Forssk. Listi z izrazitim protivnetnim delovanjem, Pharmacogn. mag. 12 (2016) S47.

[13] GH Attia, HS Alyami, MAA Orabi, AH Gaara, MA El Raey, Protimikrobna aktivnost srebrovih in cinkovih nanodelcev, posredovana z zeleno čašo jajčevca, Int. J. Pharmacol. 16 (2020) 236–243.

[14] P. Vijayan, C. Raghu, G. Ashok, SA Dhanaraj, B. Suresh, Protivirusna aktivnost zdravilnih rastlin Nilgiris, Indian J. Med. Res. 120 (2004) 24–29.

[15] T. Mosmann, Hitri kolorimetrični test za celično rast in preživetje: uporaba pri testih proliferacije in citotoksičnosti, J. Immunol. Metode 65 (1983) 55–63.

[16] W. Randazzo, J. Piqueras, J. Rodríguez-Díaz, R. Aznar, G. S´ anchez, Izboljšanje učinkovitosti viabilnosti-qPCR za selektivno odkrivanje infektivnega HAV v vzorcih hrane in vode, J. Appl. Microbiol. 124 (2018) 958–964.

[17] RM Pinto, JM Diez, A. Bosch, Uporaba celične linije karcinoma debelega črevesa CaCo-2 za in vivo pomnoževanje in odkrivanje enteričnih virusov, J. Med. Virol. 44 (1994) 310–315.

[18] Z. Ding, G. Sun, Z. Zhu, Kratko sporočilo Hesperidin zmanjša poškodbo pljuč, ki jo povzroča virus influence A (H1N1) pri podganah, s svojim protivnetnim učinkom, Antivir. Ther. 23 (2018) 611–615.

[19] C. Wu, Y. Liu, Y. Yang, P. Zhang, W. Zhong, Y. Wang, Q. Wang, Y. Xu, M. Li, X. Li, Analiza terapevtskih ciljev za SARS- CoV-2 in odkrivanje potencialnih zdravil z računalniškimi metodami, Acta Pharm. greh B (2020).

[20] AHD Cataneo, D. Kuczera, AC Koishi, C. Zanluca, GF Silveira, TB de Arruda, AA Suzukawa, LO Bortot, M. Dias-Baruffi, WA Verri, Flavonoid citrusov naringenin poslabša in vitro okužbo ljudi celic z virusom Zika, Sci. Rep. 9 (2019) 1–15.

[21] Y.-J. Lin, Y.-C. Chang, N.-W. Hsiao, J.-L. Hsieh, C.-Y. Wang, S.-H. Kung, F.-J. Tsai, Y.-C. Lan, C.-W. Lin, Fisetin in rutin kot zaviralci proteaze 3C enterovirusa A71, J. Virol. Metode 182 (2012) 93–98.

[22] K. Kaihatsu, M. Yamabe, Y. Ebara, Protivirusni mehanizem delovanja epigalokatehin-3-O-galata in njegovih estrov maščobnih kislin, Molecules 23 (2018) 2475.

[23] BU Reddy, R. Mullick, A. Kumar, G. Sharma, P. Bag, CL Roy, G. Sudha, H. Tandon, P. Dave, A. Shukla, A natural small molecule inhibitor corilagin blocks replication HCV in modulira oksidativni stres za zmanjšanje poškodb jeter, Antiviral Res. 150 (2018) 47–59.

[24] JT Ortega, AI Su´ arez, ML Serrano, J. Baptista, FH Pujol, HR Rangel, Vloga glikozilnega dela derivatov miricetina pri aktivnosti proti HIV-1 in vitro, AIDS Res. Ther. 14 (2017) 1–6.

[25] RB Teponno, S. Kusari, M. Spiteller, Nedavni napredek v raziskavah lignanov in neolignanov, Nat. Prod. Rep. 33 (2016) 1044–1092.

[26] J. Yin, MM Cherney, EM Bergmann, J. Zhang, C. Huitema, H. Pettersson, LD Eltis, JC Vederas, MNG James, Episulfidni kation (tiiranijev obroč), ujet v aktivno mesto proteinaze HAV 3C inaktiviran z zaviralci ketonov na osnovi peptidov, J. Mol. Biol. 361 (2006) 673–686.

[27] VM Chari, M. Jordan, H. Wagner, PW Thies, 13C-NMR študija strukture acil-linarina iz Valeriane wallichii, Phytochemistry 16 (1977) 1110–1112.

[28] N. Srinivasan, C. Rangasami, JC Kannan, Sintezna struktura in optične lastnosti nanodelcev cinkovega oksida, Int J Appl Eng Res. 10 (2015) 343–345.

[29] S. Fakhari, M. Jamzad, H. Kabiri Fard, Zelena sinteza nanodelcev cinkovega oksida: primerjava, Green Chem. Lett. Rev. 12 (2019) 19–24.

[30] N. Bala, S. Saha, M. Chakraborty, M. Maiti, S. Das, R. Basu, P. Nandy, Zelena sinteza nanodelcev cinkovega oksida z uporabo ekstrakta listov Hibiscus subdariffa: učinek temperature na sintezo, proti -bakterijsko delovanje in antidiabetično delovanje, RSC Adv. 5 (2015) 4993–5003.

[31] H. Zakaryan, E. Arabyan, A. Oo, K. Zandi, Flavonoidi: obetavne naravne spojine proti virusnim okužbam, Arch. Virol. 162 (2017) 2539–2551.

[32] M. Bouhaddou, D. Memon, B. Meyer, KM White, VV Rezelj, MC Marrero, BJ Polacco, JE Melnyk, S. Ulferts, RM Kaake, The global phosphorylation landscape of SARS-CoV-2 okužba, celica 182 (2020) 685–712.

[33] H. Ghaffari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarraei, F. Bokharaei-Salim, M. Zahmatkeshan, M. Farahmand, D. Javanmard, SJ Kiani, M. Esghaei, Inhibicija okužbe z virusom gripe H1N1 z nanodelci cinkovega oksida: druga nastajajoča uporaba nanomedicine, J. Biomed. Sci. 26 (2019) 1–10.

[34] SA Read, S. Obeid, C. Ahlenstiel, G. Ahlenstiel, Vloga cinka pri protivirusni imunosti, Adv. Nutr. 10 (2019) 696–710.