Ehinakozid retardi Celična senescenca človeških fibroblastičnih celic MRC-5

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Zdravilna učinkovina zdravila Cistanche: Kako zdravilo echinacoside anti-aging?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

V tej študiji so raziskali učinke ehinakozida, enega od fenilethanoidov, izoliranih iz stebla cistanches salse, kitajskega tradicionalnega zeliščnega zdravila na celice fibroblastičnega MRC-5 človeškega pljučnega zarodka. Aktivnost proliferacije celic je bila ovrednotena z zdravilom Alamar Blue, kar kaže, da lahko zdravljenje z ehinakozidom retardira senescenco. Rezultati citometrije pretoka kažejo, da bi ehinakozid lahko sprožil celice v fazi G1 za vstop v fazo S in G2 ter lahko izboljšal razgradnja ROS. Izsledki komotnega testa kažejo, da bi ehinakozid lahko zaščitil celice pred poškodbami DNK, deloma pa izoblikoval mehanizem njegovih učinkov. Vsi zgoraj navedeni rezultati kažejo, da ima echinacoside potencialno antisenescencijo.

Cistanche deserticola ima veliko učinkov, kliknite tukaj, da veste več

1. Uvod

Normalne celice, kulture in vitro proliferati za omejeno število podvojev prebivalstva ("Hayflflick limit") in vstopajo v fazo replikativnega senescence. Senescentne celice so v fazi G1 aretirale rast celic in spremenile morfologijo in presnovo, Vključno s celularnim povecanjem, povecanim lizosomom biogeneze, i izrazom aktivnosti višje -galaktozidaze na pH 6 (senescence-povezana -galaktozidaza, SA- - -Gal) (Hayflflick i Moorhead 1961; Dimri 1995). Kopičenje senescentnih celic prognosticira starostno upadanjetkivo/orgleFunkcije. Za dostop do načina zavlačevanja ali vzvratnega staranja prizadevanja za odkrivanje aktivnih snovi proti staranju še nikoli niso prenehala.Echinacosideje eden od fenilethanoidov, izoliranih iz stevCistanches salsa, kitajsko tradicionalno zeliščno zdravilo, ki ima potencialne biološke dejavnosti, tako kot antiserum inantifatigue(Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Poročali so tudi, da se in vitro obnaša kot močanbrezplačnoRadikalneSmetar(Facino et al. 1995) in razstavenevroprotektivneDejavnostiin vitro in in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside je lahko kandidat za snov proti staranju, dejavnost proti staranju pa je lahko ena od njenih bioloških lastnosti. Tako smo z ehinakozidom zdravili senescentno človeško pljučno fibroblastično celično linijo pljučnega zarodka MRC-5, saj smo pričakovali, da bi lahko retardirana ali obrnila senescenco.

2. Preiskave in rezultati

Prvič, v kulturni medij smo dodali echinacoside, da preverimo njegov vpliv na rast celic in celične cikle. Ugotovljeno je bilo, da se je sposobnost preživetja celic z izpostavljenostjo ehinakozidu očitno povečala glede na nadzor, saj se je koncentracija povečala (slika 1A), kar kaže, da je ehinakozid pomagal pri proliferatu občutljivih celic. Rezultat madeža SA- Gal je pokazal, da se je stopnja SA- -Gal po zdravljenju ehinakozida (podatki niso pokazali), kar kaže, da je bil del senescenčnih celic obrnjena iz senescence. Da bi potrdili, ali so senecentne celice po zdravljenju z ehinakozidom dejansko pognale na proliferat, je bila uvedena sodelavka citometrija, da bi preverili spremembo faze celične faze senežnega MRC-5 po zdravljenju z ehinakozidom. V naši študiji smo opazili, da se je s povečanjem koncentracije Echinacoside razmerje med celicami v obdobju G1 postopoma zmanjšalo. Nasprotno, v fazo S in G2 je bilo pogonjenih več celic (slika 1B). Kopičenje heterokromatskih focijev, povezanih s senescenco (SAHF), je še en specifični biomarker senescentnih celic (Shay in Wright 2001). Senescentne celice so prikazale ločila DNA foci, ki so bili vizualizirani z Hoechst majenjem (slika 1C). Nasprotno pa je bilo videti, da imajo celice MRC-5, zdravljene z ehinakozidom, manj SAHF.

Raven reaktivnih vrst kisika (ROS) se povečuje, ko se celice približujejo mejo Hayflflick (Hutter et al. 2002). Neprekinjeno zdravljenje celic s sub-smrtonosnimi stopnjami ROS ne samo poveča raven oksidativnih produktov škode, kot je lipofuscin (Sitte et al. 2001), ampak povzroča tudi trajno zastoj rasti, ki ga spremlja aktivacija zaviralnega pot p53 rasti (Toussaint et al. 2000). Zato ima ros na celični ravni ključno vlogo pri spodbujanju senescence. Fluorescenčna FL fluorescenčna deska DCFH-DA je bila uporabljena za merjenje vsebnosti ROS s sočlovekovo citometrijo. V primerjavi z nadzorom se je vsebnost ROS očitno zmanjšala v celicah, inkubnih z ehinakozidom (slika 2A). Ti rezultati kažejo, daehinakozidlahko delujejo kot anti-oksidant, znižujejo proizvodnjo ROS ali pospešijo odstranjevanje ROS.

Akumulirane reaktivne vrste kisika (ROS) povzročajo izjemno okvaro makromolekulov v celicah, vključno z beljakovinami, DNK in telomeri (Kovtun et al. 2007). Poškodbe oksidacijske DNK sprožijo p53-odvisno rastno aretacijo G1 po izrazu p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) in senescence celic pri normalnih ljudeh fibroblasti. Uporabili smo test komota za merjenje poškodbe DNK in popravila. Velikost drobcev DNK in število prelomov določata selitev in vzorec videnega komata. Vsebnost REPNE DNK (produkt dolžine repa in vsebnost repne DNK) se poveča s poškodbami. Naši rezultati kažejo, da lahko predhodna obdelava z ehinakozidom delno spodbuja popravilo poškodb DNK, vsaj zaščiti celice pred DNA lezijami, ki jih povzroča H2O2 (slika 2B). Na podlagi teh dejstev sklepamo, da ima echinacoside anti-senescence aktivnost vsaj v celicah MRC-5. Rezultati naše študije kažejo, da lahko ehinakozid zmanjša kopičenje ROS, zaščiti celice pred poškodbami DNK, spodbuja celice MRC-5 iz faze G1 v faze S in G2 ter tako izboljša razmnoževanje celic. Na splošno bi lahko učinke ehinakozida na celice MRC-5 razdelili na dva vidika: za spodbujanje razmnoževanja celic in zmanjšanje kopičenja ROS. Čeprav natančni mehanizem senescence celic še vedno ni znan in mreža urejanja celičnih ciklov ostaja sporna, smo dokazali, da lahko ehinakozid ščiti celice pred oksidativnimi poškodbami. Zato ugibamo, daehinakozidbi lahko bil dober kandidat za urejanje senescence, čeprav je natancen mehanizem še vedno odprto vprašanje in so v teku nadaljnje študije.

3. Eksperimentalni

3.1 Celična kultura in zdravljenje

Fibroblastična celična linija človeškega zarodka MRC-5 (Inštitut za biokemijo in celično biologijo, SIBS, CAS) je bila vzdrževati v spremenjenem minimalnem esencialnem mediju (Gibco/BRL) in je bila dopolnjena z 10% serumom plodnega goveda. Celice MRC-5 po več celičnih prehodih opravijo replikativno senescenco, ocenjeno s upočasnitvijo presnove in ukinitvijo delitve v 7 dneh. Vse kulture so bile sejane v gostoti celic 104/cm2, razen če ni bilo drugače navedeno in so lahko 7 dni razmnoževanje, neomajano. Različne koncentracije ehinakozida so bile dodane 48 h pred pregledom s topilom kot nadzorom, razen če ni navedeno drugače. Koncentracija DMSO v kulturah je bila manjša od 0,3 % (v/v). Za zdravljenje s H2O2 so bile celice inducljene z 250M H2O2 12 h.

3.2. Preživetje

Celice so bile kulturene in obdelane z ehinakozidom na 96 ploščah. Pred odkrivanjem je bil mediju dodan 10% Alamar BlueTM in inkubator 4 h. Absorbanca je bila izmerjena s spektrohotometrom.

3.3 Analiza citometrije pretoka

Za merjenje vsebnosti DNK in znotrajcelijskih ravni ROS so uvedli citometrijo pretoka z uporabo propidijevega jodida oziroma DCFH-DA. Celice so bile prevlečene z gostoto 105cel/10 ml celične raztopine v posodah premera 100 mm in dopolnile z ehinakozidom 48 h po sejanju celic. Po 48 h zdravljenju so celice po centrifugacijah nabirali in prali v PBS, Potom se reauspended in PBS solution with 0,1% RNase and 50 g/ml propidium jodide or culture medium containing 10 M DCFH-DA for 30 min. DNA or ROS contents were then determined by FL fluorescence-actived cell sorting on a Beckman Coulter Flow Cytometry System. Podatke je analizirala programska oprema MultiCycle.

3.4. Bojevniki iz hoechsta

Celice so bile kulturne in zdravljene z ehinakozidom 48 h na plošči z 96 dobro. Medij je bil odstranjen, Celice so bile izpiranje s PBS, nato fiksno s 4% formaldehida v PBS za 20 min, sledilo je s pomivanje s PBS enkrat, in maža z Hoechst bodi 10 min. Slike so bile ujete.

3.5 Enocelična gelna elektroforeza (komota)

Komot je bil izveden kot poroča (Olive in Banath 2006). Posamezne slike komota so bile analizirane s programsko opremo CometScore. Priznanje: To delo so finančno podprli Nacionalni program osnovnih raziskav (973 Project) Kitajske (št. 2007CB507406), Nacionalna fundacija za naravoslovje Kitajske (št. 30572341) in Sklad za medicinske vede Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008).