Očitna odsotnost navzkrižnega pogovora med skeletno mišico in ledvicami, odvisnega od BMAL1- pri miših

ZELIŠČNA FORMULACIJA ZA KRONIČNA LEDVIČNA BOLEZEN

Ključne besede: geni cirkadiane ure; delovanje ledvic; integrativna fiziologija

1. Uvod

Cirkadiani ritmi so pomembni v večini fizioloških procesov. Nadzor teh ritmov deloma posreduje centralna ura, ki se nahaja v suprahiazmatičnem jedru možganov, vendar periferne cirkadiane ure vplivajo tudi na ritme v fiziološki funkciji [1]. Molekularna ura je sestavljena iz povratne zanke transkripcija-prevajanje. Na kratko, jedrni proteini aril-hidrokarbon-receptor-jedrnemu-translokatorju podobni proteini (ARNTL; ali BMAL1) in cirkadiani lokomotorni izhodni cikli kaput (CLOCK) pozitivno uravnavajo transkripcijo genov Period in Cryptochrome; povratna informacija proteinov obdobja (PER) in kriptokroma (CRY) na in zavira aktivnost BMAL1/CLOCK (pregledano v [2,3]). Motnje cirkadiano nadzorovanih procesov so povezane s številnimi patologijami, vključno s srčno-žilnimi in ledvičnimi boleznimi [4,5]. Do danes navzkrižni pogovor med različnimi organskimi sistemi po ciljni cirkadiani motnji ni dobro razumljen. Ta študija se osredotoča na izbris jedrnega proteina ure BMAL1 v skeletnih mišicah in možne posledice, ki jih ima ta motnja ure na ledvicah.

Prej je bilo opisano, da ima mišji model BMAL1-inducible-knockout (iMS-BMAL1 KO), specifičen za skeletne mišice, značilnosti, podobne tistim pri staranju. Te miši kažejo spremenjeno hojo, zmanjšano mobilnost, mišično oslabelost in oslabljen privzem glukoze [6,7]. Bolezen ledvic je sinonim za staranje, saj razširjenost bolezni ledvic narašča skupaj s starostjo [8]. Druga značilnost, o kateri poročajo pri miših iMS-BMAL1 KO, je, da kažejo povečano kalcifikacijo tetive [6]. Vloga ledvic pri kislinsko-bazičnem ravnovesju in mineralni homeostazi neposredno povezuje zdravje kosti z boleznijo ledvic. Posledično smo domnevali, da bi miši iMS-BMAL1 KO lahko bile model za bolezen ledvic.

Cilj te študije je bil ugotoviti, ali motnje ure v skeletnih mišicah vodijo v ledvično disfunkcijo. Delecija BMAL1 v skeletnih mišicah povzroči povečanje vnetnih markerjev v ledvicah. Vendar se zdi, da iMS-BMAL1 KO ne vpliva niti na delovanje ledvic niti na histologijo ledvic. Ti podatki kažejo, da posledica motenj ure v skeletnih mišicah vodi do minimalnih sprememb v ledvicah pod testiranimi pogoji.

2. Materiali in metode

Živali. Mišji model, uporabljen v tej študiji, je bil ustvarjen z uporabo miši BMAL1 s floksiranim eksonom 8 [9], križanih s Cre-rekombinaznimi mišmi, specifičnimi za skeletne mišice (človeški skeletni aktin–Cre). Cre je bil aktiviran z injekcijami tamoksifena (izdelanega v 15 % etanolu v sončničnem olju) 5 tednov pred preučevanjem (2 mg/dan; 5 dni ip.), da se ustvari iMS BMAL1 KO. Kot kontrole so bile uporabljene miši Cre+ z vbrizganim nosilcem (15 % etanola v sončničnem olju). Samce deviških mladih miši so proučevali pri 17–19 tednih, stare miši pa pri 13–14 mesecih. Vse poskuse je izvedel Vodnik Nacionalnega inštituta za zdravje za nego in uporabo laboratorijskih živali, odobril in spremljal pa sta ga Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze na Floridi ter Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali pri Upravi za veterane Severne Floride/Južne Georgie. Miši so bile nameščene v prostorih z nadzorovano temperaturo (20–26 ◦C) in vlažnostjo, 12:12 ur svetlo-temno cikličnih prostorov. Miškam je bil omogočen ad libitum dostop do vode in standardne 18-odstotne beljakovinske hrane za glodavce (št. 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, ZDA), razen če je navedeno drugače.

Študija presnovne kletke. Kohorta mladih samcev miši (5 kontrolnih in 5 KS-BMAL1 KO) je bila v presnovnih kletkah za zbiranje urina in spremljanje vnosa hrane/vode [10]. Pripravljena je bila gelna dieta na osnovi praška (Envigo Teklad Custom Diet), ki je vsebovala 1 % agarja in je bila uporabljena v vseh zbirkah presnovnih kletk. Miši so imele 3 dni časa, da so se prilagodile na presnovne kletke pred začetkom odvzemov na kontrolni dieti ({{10}}.25% NaCl; 0.6% K; Envigo 99131). Po enem dnevu snemanja s kontrolno dieto so miši nato pet dni zdravili z dieto s pomanjkanjem kalija (0.25 % NaCl; 0,0001 % K; Envigo 99134). Vzorci urina so bili zbrani vsakih 12 ur ob koncu dnevne svetlobe in ponoči (Zeitgeberjev čas 0 in 12). Zabeleženi so bili izločanje urina, vnos hrane in vnos vode. Koncentracije elektrolitov v urinu so bile izmerjene s plamenskim fotometrom (model Cole-Parmer 2655- 00, Vernon Hills, IL, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Miši so bile evtanazirane in tkivo je bilo zbrano ob Zeitgeberjevem času 6.

Sestava telesa. Telesna sestava je bila kvantificirana pri zavestnih mladih mišjih samcih pred in pet dni po dajanju diete, osiromašene s kalijem. Meritve so bile izvedene pri Zeitgeberjevem času 4–6 z uporabo kvantitativnega magnetnoresonančnega analizatorja telesne sestave EchoMRI (Echo Medical Systems, Houston, TX, ZDA) [11].

Protokol za vnaprejšnjo fazo. Ločena kohorta starih mišjih samcev je bila posamično nameščena v kletkah, opremljenih s tekalnim kolesom z ad libitum dostopom do hrane (št. 2918, Harlan Teklad) in vode. Kletke so bile shranjene v svetlobno nadzorovani škatli s stalno izmenjavo zraka (Actimetrics, Wilmette, IL, ZDA). Urnik osvetlitve je bil vzdrževan v ciklu svetlo-temno 12:12 z uporabo zelenega LED (~ 200 luksov) svetlobnega vira. Po enem tednu izhodišča je temni cikel napredoval za 7 ur in miši so bile en teden vzdrževane na tem novem razporedu 12:12 h cikla svetlo-temno. Ta postopek je bil ponovljen drugič, da se je proizvedlo fazno napredovanje 14-h. Miši so bile evtanazirane ob Zeitbegerjevem času 2 v skupinah po 2–3 in tkivo je bilo zbrano 7–10 dni po drugem tednu napredovanja faze.

Specifičnost rekombinacije. Da bi potrdili specifičnost rekombinacije Bmal1, smo zaključili PCR z uporabo 40 ng genomske DNA skeletne mišice in primerjev za rekombinirane in nerekombinirane alele. (sprejšnji primer: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev primer: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, rekombinacijski primer: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Prednji in povratni primerji za floksirani alel Bmal1 dajejo produkt 431-bp. Drugi začetni primer 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 je bil vključen za odkrivanje rekombiniranega produkta, ki kaže pas pri 572 bp. Reakcijski produkti PCR so bili obdelani na 1,7 % agaroznem gelu in identifikacija genomskega pasu in za rekombinacijo specifičnega pasu je potrdila, da so bile vse živali, zdravljene s tamoksifenom, tkivno specifične KO, kot je opisano prej [7, 12].

Imunohistokemija. Po anesteziji z inhalacijskim izofluranom so bile desne ledvice zbrane in takoj prečno prerezane na pol, nato pa shranjene v perjodat-lizin-2% paraformaldehidu za približno 48 ur pri 4 ◦C. Tekočino smo nato spremenili v PBS za pripravo na obdelavo. Vzorci ledvic vsake živali so bili vdelani v parafin, 4-mikrometrske debele dele pa so bili izrezani in nameščeni na stekelca. Odrezke smo bodisi obarvali s hematoksilinom in eozinom ali obarvali s 3,30 -diaminobenzidin kromogenim substratom (vektor), da ciljamo na BMAL1 (D2L7G Cell Signaling; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, ZDA). Odseke smo opazovali s svetlobno mikroskopijo (Nikon E600, opremljen z digitalnim fotoaparatom Nikon DXM1200F, Melville, New York, NY, ZDA). Identifikatorji skupineodstranili z vsakega stekelca in pregledali ekspresijo BMAL1 ali pa stekelca ocenili za tubulno poškodbo z uporabo naslednjih meril: odstotek tubulov, ki so kazali znake tubularne nekroze, pomanjkanje roba s ščetkami, tubularna dilatacija in tvorba beljakovinskega odlitka.

inkubirano s sekundarnim protitelesom proti kuncem, konjugiranim s hrenovo peroksidazo. Po dodatnem 30-minutnem izpiranju s TBS-T je bila detekcija izvedena z uporabo reagenta SignalFire ECL (tehnologija celične signalizacije) s časom izpostavljenosti 30 s za slikanje. Denzitometrija je bila izvedena z uporabo Fijija, številčnost beljakovin pa je bila normalizirana na barvanje po Ponceauju.

Multipleksni imunski testi. Kortikalne in medularne regije so bile izrezane iz polovice ledvic pri starih mišjih samcih. Tkivo smo homogenizirali bodisi v 300 µL (korteks) ali 250 µL (medula) pufra (1 % koktajl zaviralcev proteaze–fosfataze (Thermo Scientific) 1 % 1 M etilendiamintetraocetne kisline, 0,1 % Tween 20 v fosfat- pufrirana fiziološka raztopina). Koncentracijo beljakovin za vsak vzorec je določil BCA (Pierce, Thermo Scientific). Homogenati so bili izmerjeni v dvojniku za izbrane analite z uporabo komercialnih kompletov za multipleks imunotest (MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K in MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma) na MILLIPLEX® Sistem Analyzer 3.1 xPONENT (Luminex 200, Austin, TX, ZDA) z analizo podatkov prek programske opreme MILLIPLEX Analyst. Povprečni življenjepisi znotraj testa so bili<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Izolacija ledvičnih mitohondrijev in respirometrija. Sveže ledvično kortikalno tkivo smo secirali iz miši po napredovanju faze. Mitohondrije smo izolirali z uporabo Mitochondria Isolation Kit for Tissue (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Koncentracijo beljakovin v mitohondrijskem pripravku smo določili z uporabo BCA Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific). Mitohondrijsko dihanje izolata je bilo določeno v dvojniku v predhodno kalibrirani ksilografski komori, vzdrževani pri 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Avstrija), ki je vsebovala respiracijski pufer (MiR05; 0).5 mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM laktobionske kisline, 20 mM tavrina, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-saharoze in 1 g/L BSA v bistvu brez maščobnih kislin, pH 7,1) [13]. Koncentracijo kisika v dihalnem pufru smo vzdrževali med nasičenostjo zraka (~200 µM) in 50 µM. Stopnja porabe kisika (OCR; ρmol O2/s/mg mitohondrijskih beljakovin) je bila izmerjena z uporabo naslednjega protokola titracije zaviralca razdruževanja substrata (SUIT) (koncentracije reagentov, navedenih v oklepaju, so končne znotraj komor): (1) PUŠČANJE (L ) dihanje je bilo ocenjeno po stimulaciji cikla TCA s substrati, povezanimi z NADH, piruvatom (5 mM), malatom (2 mM) in glutamatom (10 mM) za podporo pretoka elektronov skozi kompleks I (CI) transportnega sistema elektronov (ETS; E). ); (2) oksidativno fosforilacijo (OXPHOS; P) smo stimulirali z adenozin difosfatom (ADP; 2,5 mM) in zabeležili kot PCI; (3) dodatek sukcinata (10 mM) je podprl konvergentni tok elektronov skozi kompleksa I in II ETS (PCI+II); (4) kakovost mitohondrijskega pripravka je bila ocenjena s testiranjem celovitosti mitohondrijske zunanje membrane z dodajanjem citokroma c (10 µM); (5) ločilni karbonil cianid 4-(trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP; 0,5 µL-koraki 0,1 mM osnovne raztopine) je bil titriran postopoma, dokler ni bilo doseženo največje nevezano dihanje in zabeleženo kot največja zmogljivost ETS (ECI+ II); (6) dodatek rotenona (0,5 µM) je zaviral kompleks I ETS, preostali OCR pa je bil zabeležen kot največja zmogljivost ETS, ki jo podpira substrat kompleksa II (ECII); (7) dodatek antimicina A (2,5 µM) je zaviral kompleks III ETS in s tem ves transport elektronov do kompleksa IV, preostali OCR pa je bil zabeležen kot preostala, nemitohondrijska poraba kisika (ROX) in odštet od vseh predhodnih OCR ; (8) poraba kisika je bila nato ponovno stimulirana z dodatkom N,N,NO,N0 -tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorida (TMPD; 0,5 mM; v prisotnosti askorbata (2 mM), da se prepreči nenadzorovana avtooksidacija TMPD) kot umetni substrat za zmanjšanje citokroma c; (9) stopnja oksidacije kemičnega ozadja v prisotnosti TMPD/askorbata je bila ocenjena z dodajanjem kompleksnega IV inhibitorja natrijevega azida (100 mM) in je bila odšteta od predhodnega toka, kar je povzročilo največjo zmogljivost aktivnosti citokrom c oksidaze (ECIV). Podatki o porabi kisika so bili pridobljeni in analizirani z uporabo DatLab proti 7.4 (Oroboros Instruments). Razmerja nadzora pretoka (FCR) so bila izračunana kot poraba kisika v katerem koli danem stanju dihanja glede na največjo zmogljivost ETS (ECI+II).

Pretočna citometrija. Pljučno tkivo je bilo prebavljeno in analiza pretočne citometrije je bila izvedena, kot je opisano prej [14].

Statistične analize. Grafični podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Za analizo razlik med štirimi skupinami je bila uporabljena dvosmerna ANOVA s ponavljajočimi se meritvami, kadar je bilo to mogoče. Sidakov test večkratnih primerjav je bil uporabljen za primerjavo skupin miši s skupinami za zdravljenje. Za primerjavo obeh skupin je bil uporabljen Studentov t-test. Analiza je bila izvedena s programsko opremo GraphPad Prism različice 9.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ZDA).

Statistična pomembnost je bila definirana kot p < 0,05.

Podporna služba Wecistanche:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950