Ustrezna raven vadbe zmanjša črevesno disbiozo in povečanje valerične kisline za izboljšanje nevroplastičnosti in kognitivnih funkcij po operaciji pri miših 3. del

MATERIALI IN METODE

Eksperimentalne protokole in postopke je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v Virginiji (Charlottesville, VA, ZDA; številka protokola: 3114).

Spomin je ena od sposobnosti, ki jo moramo pogosto uporabljati v vsakdanjem življenju. Lahko naredi ljudi pametnejše, bolj občutljive in bolj ugodne za kariero in medsebojne odnose. Zato si mnogi želijo izboljšati spomin. Med eksperimentalnimi protokoli in spominom obstaja povezava. Raziščimo to težavo.

Prvič, eksperimentalni protokoli lahko ljudem pomagajo izboljšati spomin. V poskusu morajo ljudje slediti določenim korakom, da dokončajo eksperimentalno operacijo. Ta aktivnost korak za korakom lahko človeške možgane spravi v stanje visoke pozornosti in koncentracije ter tako spodbuja delovanje možganskih funkcij. Obenem si morate zapomniti nekaj eksperimentalnih podatkov in eksperimentalnih korakov med eksperimentom, ki bodo prav tako izvajali spominsko funkcijo možganov. Z večkratno vadbo na ta način se bo vaš spomin postopoma izboljšal.

Drugič, čutna izkušnja med pomnjenjem je prav tako tesno povezana z zasnovo eksperimentalnega načrta. Pri poskusih si oblikovalci med poskusom pogosto zastavijo določene posebne naloge, tako da morajo udeleženci večkrat ponoviti isto operacijo, kot je pomnjenje in pisanje številk, pomnjenje in prepoznavanje barvnih blokov itd. Ta ponavljajoča se izkušnja lahko okrepi ljudi sposobnosti pozornosti in spomina, kar ljudem olajša predelavo teh informacij v dolgoročni spomin.

Poleg tega lahko v poskusih tudi uporaba reprezentativnih dražljajev (kot so slike, zvoki, vonjave itd.) prinese dobre rezultate. Ker lahko ti dražljaji sprožijo možgansko vznemirjenje in spominske procese ter s tem izboljšajo spominsko sposobnost ljudi. Hkrati se lahko ti dražljaji povežejo tudi z okoljem in situacijami v življenju, s čimer se zmanjša pojav ločevanja in naredi informacije lažje zapomniljive in bolj kohezivne.

Če povzamemo, eksperimentalni načrt igra ključno vlogo pri izboljšanju človeškega spomina. Z izvajanjem eksperimentov lahko ljudje uveljavljajo svoje kognitivne sposobnosti, izboljšajo raven spomina in hkrati spodbujajo delovanje možganov. Zato bi se morali še naprej učiti novih eksperimentalnih metod in sodelovati v več poskusih, da bi izboljšali naš spomin in bolj prispevali k naši karieri, odnosim in zdravju. Vidimo lahko, da moramo izboljšati spomin, in Cistanche deserticola lahko bistveno izboljša spomin, saj ima Cistanche deserticola antioksidativne, protivnetne in anti-aging učinke, ki lahko pomagajo zmanjšati oksidacijo in vnetne reakcije v možganih, s čimer ščitijo zdravje živčnega sistema. Poleg tega lahko Cistanche deserticola spodbuja tudi rast in popravilo živčnih celic ter tako izboljša povezljivost in delovanje nevronskih mrež. Ti učinki lahko pomagajo izboljšati spomin, sposobnost učenja in hitrost razmišljanja ter lahko tudi preprečijo razvoj kognitivnih motenj in nevrodegenerativnih bolezni.

Kliknite Spoznaj kratkoročni spomin, kako izboljšati

Vse poskuse na živalih je izvedel Vodnik Nacionalnega inštituta za zdravje za nego in uporabo laboratorijskih živali (publikacije NIH št. 80–23), revidiran leta 2011. Viri ključnih materialov so bili navedeni v tabeli ključnih virov v dodatnem materialu.

Živali in načrtovanje eksperimentov

Osem tednov stare samce miši C57BL/6 J, ki so tehtali 19–22 g, so namestili v prostor, kjer so vzdrževali stalne okoljske pogoje (temperatura 22–24 stopinj, 12-urni cikel svetloba/tema in 50 ± 10 % vlažnost) s prostim dostopom do hrane in vodo.

Vsem je bilo dovoljeno en teden aklimatizacije pred poskusi. V prvem poskusu so bili naključno razporejeni v naslednje skupine: (1) kontrolna skupina (ni bila izpostavljena anesteziji in operaciji), (2) skupina za vadbo (ki je izvajala 35–40 % največje zmogljivosti, vendar ni bila izpostavljena anesteziji in operaciji) , (3) kirurška skupina (izpostavljenost levi karotidni arteriji 15 minut pod anestezijo z izofluranom 2 uri) in (4) do (6) skupine Exe-l+Sur, Exe-m+Sur in Exe-h+Sur: vadba pri 35 –40%, 55–60% oziroma 75–80% maksimalne zmogljivosti in so bili podvrženi anesteziji in operaciji.

Živali so bile uporabljene za teste učenja in spomina, ki so se začeli 4 dni po operaciji (n=20) ali pa so bili njihovi možgani pobrani za biokemične teste 6 ur, 24 ur, 48 ur, 72 ur, 96 ur in 7 dni po operaciji (n=9 ali 14), za imunofluorescentno barvanje 48 ur in 19 dni po operaciji (n=6) in za Golgijevo barvanje 19 dni po operaciji (n=8).

Kri in iztrebki miši iz prvih 4 skupin so bili pobrani za merjenje SCFA 7 dni po operaciji (n=7) in za analize 16 S 3 in 7 dni po operaciji (n=8) ali ob konec 4-tedenskega protokola vadbe (n=8) ​​ali ob ustreznem času v prvih 2 skupinah (n=16). Miši za zbiranje tkiv so bile različne kohorte miši, ki so bile uporabljene za teste učenja in spomina. V drugem poskusu so bile miši naključno dodeljene (1) skupini Transcontrol+Sur in (2) skupini Trans-exe+Sur.

Miši v prvi skupini so prejele 500 ul fekalne raztopine iz kontrolne skupine z želodčno sondo in 600 ul s klistirjem enkrat na dan 7 zaporednih dni po zdravljenju z antibiotiki, da bi odstranili izvorno črevesno mikrobioto pri prejemnikih. Miši v drugi skupini so prejele 500 ul fekalne raztopine iz vadbenih miši z želodčno sondo in 600 ul s klistirjem enkrat na dan 7 zaporednih dni po zdravljenju z antibiotiki. Iztrebki prejemnikov so bili pobrani 14 dni po fekalni presaditvi za analizo 16 S. Miši so bile nato podvržene operaciji.

Učenje in spomin sta bila ocenjena od 4 dni po operaciji (n=15). Možgani so bili pobrani za biokemične študije kot v prvem poskusu (n=10). V tretjem poskusu so bile miši naključno dodeljene (1) skupini Transcontrol in (2) skupini Trans-control+Sur. Miši v obeh skupinah so prejele presaditev iztrebkov kontrolnih miši. Druga skupina je bila operirana 14 dni po fekalni presaditvi. Hipokampus je bil pobran 2 dni po operaciji za merjenje GDNF (n=10). V četrtem poskusu so bile miši naključno dodeljene (1) kontrolni skupini (naivne miši, ki niso bile izpostavljene nobenim poskusnim pogojem, opisanim v tej študiji), (2) skupina antibiotikov, ki je prejemala antibiotike 7 dni, in (3) transkontrolna skupina, ki je prejela presaditev iztrebkov iz kontrolnih miši.

Učenje in spomin sta bila ocenjena 19 dni po zaključku fekalne presaditve (26 dni po zaključku zdravljenja z antibiotiki v skupini z antibiotiki) (n=12). V petem poskusu so bile miši naključno dodeljene (1) kontrolni skupini, (2) trans-kontrolna skupina, ki je prejela presaditev iztrebkov iz kontrolnih miši, in (3) trans-kirurška skupina, ki je prejela transplantacijske ordinacije iz operacijskih miši. 

Fekalna presaditev je bila izvedena, kot je opisano v drugem poskusu. Iztrebki prejemnikov so bili pobrani 14 dni po fekalni presaditvi za analizo 16 S (n=10). Učenje in spomin sta bila ocenjena 4 dni po odvzemu fekalnega vzorca (n=17). V šestem poskusu so miši naključno razvrstili v (1) skupino z operacijo in fiziološko raztopino, ki je enkrat prejela 200 µl normalne fiziološke raztopine (NS) z intraperitonealno injekcijo teden 4 tedne in nato operacija, (2) vadba plus fiziološka raztopina plus kirurška skupina, ki je prejela 200 µl NS z intraperitonealno injekcijo enkrat na teden med 4-tednom vadbe pri 35–40 % največji zmogljivosti in nato operacija (3 ) vadba plus valerijanska kislina in kirurška skupina, ki je prejela valerijansko kislino (200 mg/kg v 200 µl) z intraperitonealno injekcijo enkrat na teden med 4-tednom vadbo pri 35–40 % maksimalne zmogljivosti in nato operacijo.

Injekcija je bila dana zjutraj na prvi dan vadbe v tednu. Ena dodatna injekcija je bila izvedena na dan operacije. Vedenjski (n=13) in biokemični (n=10) rezultati so bili ocenjeni kot v tem drugem poskusu. V sedmem poskusu je 13-teden star (težak 23–27 g) samec C57BL/ 6 J miši je bilo naključno dodeljenih (1) kontrolni skupini, (2) skupini NS, ki je prejela 4 µl NS z intracerebroventrikularnimi injekcijami enkrat na dan 4 zaporedne dni, in (3) skupini valerijanske kisline, ki je prejela 4 mg/kg v 4 µl intracerebroventrikularno injekcijo enkrat na dan 4 zaporedne dni. Levi in ​​desni cerebroventrikel sta bila injicirana po izmeničnem urniku. Učenje in spomin sta bila ocenjena 4 dni po injiciranju (n=15).

V osmem poskusu so miši naključno razvrstili v (1) skupino z operacijo in dimetil sulfoksidom (DMSO), ki je prejemala DMSO z intracerebroventrikularno injekcijo enkrat na dan 4 zaporedne dni, z začetkom na dan operacije, (2) skupino s operacijo in antagonistom C3ar, ki je prejemala antagonist C3ar (SB290157). ) z intracerebroventrikularno injekcijo enkrat na dan 4 dni z začetkom na dan operacije, (3) vadba plus DMSO plus kirurška skupina, ki je prejela DMSO z intracerebroventrikularno injekcijo enkrat na dan 4 zaporedne dni z začetkom na dan operacije po 4-tedenski vadbi pri 35 –40 % maksimalne zmogljivosti in (4) vadba plus agonist C3ar plus kirurška skupina, ki je prejemala C3aragonist z intracerebroventrikularno injekcijo enkrat na dan 4 zaporedne dni, z začetkom na dan operacije po 4-tedenski vadbi pri 35–40 % maksimalne zmogljivosti . Vedenjski testi so se začeli 4 dni po operaciji, kot je navedeno zgoraj (n=15).

V devetem poskusu so miši naključno razporedili v (1) kontrolno skupino, (2) kirurško skupino, (3) kirurško skupino plus GDNF, ki je prejela GDNF z intracerebroventrikularno injekcijo, ko so imeli operacijo, in (4) operacijo plus toplotno inaktiviran GDNF skupina, ki je prejela toplotno inaktiviran GDNF z intracerebroventrikularno injekcijo, ko so imeli operacijo. Hipokampi so bili pobrani 48 ur po operaciji za študijo ELISA (n=12). Po enem tednu aklimatizacije so bile uporabljene stare miši (18-mesečni samci miši C57BL/6 J), ki so tehtali 30–36 g tri študije. V prvem poskusu so bile stare miši naključno razporejene v (1) kontrolno skupino, (2) vadbeno skupino, v kateri so miši imele 4-tedensko vadbo s 35–40 % največje zmogljivosti, (3) operacijsko skupino in (4) skupina Exe+Sur, v kateri so miši imele 4-tedensko vadbo s 35–40 % največje zmogljivosti pred operacijo. Živali so bile uporabljene za teste učenja in spomina, ki so se začeli 4 dni po operaciji (n=12) ali pa so bili njihovi možgani pobrani za biokemične teste 48 ur po operaciji (n=10 ali 12), za imunofluorescentno barvanje po 48 urah in 19 dni po operaciji (n=6), za Golgistaining pa 19 dni po operaciji (n=8).

Kri in iztrebki miši iz 4 skupin so bili pobrani za merjenje SCFA 7 dni po operaciji (n=7) in za analize 16 S 3 in 7 dni po operaciji (n=8) ali na koncu 4-tedenskega protokola vadbe ali ob ustreznem času v prvih 2 skupinah (n=16). Miši za zbiranje tkiv so bile različne kohorte, ki so bile uporabljene za teste učenja in spomina. V drugem poskusu so bile stare miši naključno dodeljene (1) skupini Trans-Old Control+Sur in (2) skupini Trans-Old Exe+Sur. Te miši so bile operirane 14 dni po fekalni presaditvi, kot je opisano v drugi poskus mladih odraslih miši. Učenje in spomin sta bila ocenjena od 4 dni po operaciji (n =10).

V tretjem poskusu so bile stare miši naključno dodeljene skupini (1) operacija in NS; (2) skupina vadba plus NS plus operacija; in (3) vadba plus valerijanska kislina plus kirurška skupina. Te miši so prejele kondicionirano vadbo in valerijansko kislino, kot je opisano v šestem poskusu mladih odraslih miši. Vedenjski rezultati so bili testirani z začetkom 4 dni po operaciji (n=11). Zgoraj opisane velikosti vzorcev (n) so predstavljale število živali, ki so bile randomizirane v vsako skupino/stanje. To število živali je bilo vsota vsaj 3 ponovitev vsakega poskusa. Živali so bile naključno porazdeljene v skupine na podlagi računalniško ustvarjenih tabel naključnosti v vsakem poskusu.

Določitev maksimalne zmogljivosti vadbe in vadba

Pred operacijo so {{0}}teden in 18-mesece stare miši izpostavili 4-tedenski aerobni vadbi na tekalni stezi po določitvi največje vadbene zmogljivosti posameznih miši. Ta določitev je bila izvedena na podoben način kot prej opisan [47, 48]. Na kratko, miši so bile prvi dan aklimatizirane na tekalni stezi z začetnimi nastavitvami udarne mreže pri 25 V, 0,3 mA in 2 Hz ter hitrostjo in naklonom nič za 10 minut. Hitrost tekalne steze je bila nato povečana na 10 cm/s z naklonom, nastavljenim na 50 za 10 minut. Nato sta bila hitrost in naklon tekalne steze povečana na 15 cm/pesek 100 za 5 minut.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50 % časa v omrežju; in/ali (3) pomanjkanje motivacije za ročno draženje. Ko je bilo izpolnjeno eno ali več teh meril, je bila miška takoj odstranjena z zadevne steze. Naslednji dan so miši tekle na isti tekalni stezi s polovico povprečne največje hitrosti (35 cm/s pri mladih miših ali 30 cm/s pri starih miših) in 100 naklona, ​​dokler niso ponovno dosegle enega od kriterijev izčrpanosti, in trajanje neprekinjena vadba je bila zabeležena kot največja vadbena zmogljivost vsake miši. Po teh dveh protokolih so bile miši nameščene ločeno 30 minut, da bi se izognili opaznemu agresivnemu vedenju po vadbi.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3 % celotnega časa v 3 zaporednih dneh bi bili izključeni.

Skupine, ki niso izvajale vadbe, so bile v istem nizu poskusov kot skupine, ki so izvajale vadbo, vsak dan postavljene na negibljivo tekalno stezo za približno 30–40 minut. Prejeli so 10 udarcev za skupno 5 s, kar je povprečna količina udarcev, ki so jih miši v vadbeni skupini prejele vsak dan med bivanjem na negibljivi tekalni stezi. Če niz poskusov ni imel vadbene skupine, nobena miš v nizu poskusov ni prejela šokov.

Zdravljenje z antibiotiki

Da bi olajšali kolonizacijo presajene mikrobiote, so miši prejemnice enkrat dnevno 7 zaporednih dni zdravili z antibiotiki, da bi odstranili njihovo prvotno črevesno mikrobioto, kot smo opisali mi in drugi [11, 36]. Na kratko, po čiščenju z 10 % magnezijevim sulfatom (200 ul/10 g, dvakrat v 3-urnih presledkih) z želodčno sondo prvi dan so miši C57BL/6 J prejele amoksicilin/klavulansko kislino (200 mg/kg), metronidazol ( 200 mg/kg) in cefazolin (2 g/kg) z želodčno sondo in klistir (v 300 ul za želodčno gavažo in 400 ul NS za klistir) zjutraj enkrat na dan 7 zaporednih dni ter amoksicilin/klavulanska kislina (20 mg/kg ), metronidazol (20 mg/kg) in cefazolin (300 mg/kg) v 200 ul NS dnevno z intraperitonealno injekcijo istih 7 dni (od 16.00 do 17.00). Da bi preprečili bakterijsko navzkrižno kontaminacijo, so ravnanje z mišmi ter vsakodnevno menjavo kletk in steklenic za vodo izvajali tehniki, ki so nosili čisto obleko in rokavice s prezračevano kapuco. Iztrebke teh miši so pobrali 24 ur po zadnjem zdravljenju za 16 S analize za določitev učinka.

Fekalna presaditev

Sveže fekalne pelete, zbrane v 30 minutah po odvajanju črevesja od kontrolnih miši, miši takoj po zaključku 4-tedenske vadbe, miši 2 do 8 dni po operaciji, smo razredčili s 100 mg/ml sterilne fiziološke raztopine. Vse fekalne pelete 7 –10 donorjev z vsakim poskusnim pogojem je bilo zmešanih in skupaj ponovno suspendiranih v fiziološki raztopini. Na kratko, fekalne snovi so vrtinčeno mešale 5 minut in jih nato spustile skozi 70 μm najlonsko celično cedilo, da so odstranili neprebavljeno hrano in delce. Miši prejemnice so prejele 500 ul ustrezne fekalne raztopine z želodčno sondo zjutraj in 600 ul s klistirjem popoldne od 24 ur po zadnjem odmerku antibiotikov 7 zaporednih dni. Presajene miši so vzdrževali 2 tedna po fekalni presaditvi, preden so bile podvržene fekalnemu zbiranju za analize 16 S in operacijo.

Anestezija in kirurgija

Operacija je bila izpostavljenost levi karotidni arteriji, kot smo opisali prej [6]. Na kratko, miši so anestezirali z 2 % izoflurana in med postopkom vzdrževali spontano dihanje z obrazno masko, oskrbljeno z 100 % kisika. Rektalno temperaturo smo spremljali in vzdrževali pri 37 stopinjah s pomočjo grelne odeje. 2- cm sredinski rez na vratu in disekcija mehkega tkiva z 1- cm dolgo izpostavljenostjo skupne arterije sta bila izvedena brez kakršnih koli poškodb vagusnega živca, potem ko je bila miš vsaj 20 minut anestezirana z izofluranom. Rano smo nato izprali in zaprli s 4–0 kirurškim šivom. Kirurški poseg je bil izveden v sterilnih pogojih in je trajal približno 15 minut pri mladih miših in 12 minut pri starih miših. Skupno trajanje splošne anestezije je bilo 2 uri. Po operaciji so vse živali prejele subkutano injekcijo 3 mg/kg bupivakaina. Med anestezijo niso opazili odziva na ščipanje prstov na nogi.

Intracerebroventrikularne injekcije

Kot je opisano zgoraj, so nekatere skupine miši prejele intracerebroventrikularno injekcijo. Na kratko, te miši so bile postavljene v stereotaktični okvir glave v ležečem položaju. Mesto injiciranja je bilo locirano kot: 1.00 mm mediolateralno, −0.3 mm anteroposteriorno od Bregme in −2,5 mm dorzoventralne globine. Miši na operaciji in skupini GDNF so prejele intracerebroventrikularno injekcijo 1{{ 20}} ug/kg rekombinantnega mišjega GDNF v 3 ul fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS), kot je opisano v prejšnjih študijah [6, 26], miši v skupini GDNF, inaktivirane s kirurškim posegom, pa so prejele injekcijo toplotno denaturiranega (5 min 1000C) ) Rešitev GDNF. Miši na operaciji in skupina antagonistov C3ar so prejele 10 ug/kg SB290157 v 3 ul PBS, ki je vseboval 5 % DMSO, 0 h, 24 h, 48 h in 72 h po operaciji. Miši v vadbeni skupini z agonistom C3ar in operacijski skupini so prejele 1 ug/kg agonista C3ar v 3 ul PBS, ki je vseboval 5 % DMSO, istočasno kot za SB290157. Miši v skupini z valerijansko kislino v šestem poskusu so prejemale 4 mg/kg valerijanske kisline v 4 µl 4 zaporedne dni.

Vedenjsko testiranje

Učenje in spomin sta bila ovrednotena s prepoznavanjem novih predmetov in Barnesovim testom labirinta. Vsi vedenjski testi so bili izvedeni ob 10:00 zjutraj − 5:00popoldne v zvočno izolirani sobi. Miši, uporabljene v testih učenja in spomina, niso bile uporabljene za nobene biokemijske študije, da bi se izognili učinkom teh testov.

Preizkus prepoznavanja novih predmetov

Kot smo mi in drugi opisali prej [20, 49, 50], smo miši 4 dni po operaciji dali v komoro na odprtem polju za 5 minut za navaditev. Test je bil izveden na naslednji način. Dva ista predmeta sta bila na dan učenja postavljena v sosednja kota komore. Miši so dali v komoro s hrbti obrnjenimi proti predmetom in jim pustili, da prosto raziskujejo komoro 5 minut. Žival je bila izločena, če je bil skupni čas raziskovanja na dveh objektih<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Barnesov labirint

Sedem dni po operaciji so živali podvrgli Barnesovemu labirintu, da bi preizkusili njihovo prostorsko učenje in spomin, kot smo že opisali [6, 49]. Barnesov labirint je krožna platforma z 20 enakomerno razporejenimi luknjami (SDInstruments, San Diego, CA). Ena od lukenj je bila povezana s temno komoro, ki se je imenovala tarčna škatla. Test se je začel s postavitvijo živali v sredino Barnesovega labirinta. Averzivni hrup (85 dB) in močna svetloba (200 W) na platformo sta bila uporabljena za spodbujanje miši, da najdejo to škatlo. Po 4-dnevnem usposabljanju je bil njihov referenčni spomin testiran 5. dan in 12. dan. Med obdobjem ni bil opravljen noben test. od 5. do 12. dne. Zakasnitev vstopa v ciljno polje med vsakim poskusom je zabeležil sistem za video sledenje ANYMaze (SD instrumenti).

For more information:1950477648nn@gmail.com