Koristni učinki skupne frakcije feniletanoidnega glikozida, izolirane iz Cistanche Deserticola, na mikrostrukturo kosti pri podganah z ovariektomijo Ⅰ

Ta študija je bila zasnovana za oceno antiosteoporotičnega delovanja skupne frakcije feniletanoidnega glikozida, izolirane izC. deserticola(CDP) na podganah, povzročenih z ovariektomijo (OVX), kot tudi s tem povezanimi mehanizmi. Po 3 mesecih peroralnega dajanja jezmanjšana mineralna gostota kosti, serumski Ca in P pri podganah OVX so bili obnovljeni in poslabšani trabekularnimikroarhitektura kostije bil delno izboljšan z intervencijo CDP (60, 120 in 240 mg/kg), aktivnosti označevalcev kostne resorpcije so bile regulirane navzdol in bioaktivnost indeksa tvorbe kosti je bila regulirana navzgor; medtem se je vsebnost MDA zmanjšala, GSH pa se je povečal z zdravljenjem s CDP. Po sestavi je bilo identificiranih 8 feniletanoidnih glikozidnih spojinFied v CDP, s skupno vsebino kvantFied kot 50,3 % z uporabo metode HPLC. Mehansko gledano je CDP znižal ravni TRAF6, RANKL in RANK, s čimer je zatrl aktivacijo NF-, ki jo povzroča RANKL/RANK/TRAF6-κB in PI3K/AKT signalne poti in končno preprečevanje aktivnosti ključnih osteoklastogenih proteinov NFAT2 in c-Fos. Vsi zgornji podatki kažejo, da je bil CDP doberFiCial EFfvpliva na mikrostrukturo kosti pri ovariektomiranih podganah in ti nprFfučinki so lahko povezani z NF-κB in PI3K/AKT signalne poti, ki jih je sprožila vezava RANKL, RANK in TRAF6.

NARAVNE ORGANSKE CISTANCHE ZA RAST KOSTIJ

1. Uvod

Postmenopavzalna osteoporoza, za katero bo zbolela 1 od 3 žensk, starejših od 50 let, postaja glavna nevarnost za zdravje, ki prizadene več kot 200 milijonov žensk po vsem svetu [1]. V menopavzi močno znižanje ravni estrogena običajno povzroči prekomerno resorpcijo kosti, ki jo povzroči povečana osteoklastogeneza; nato ravnovesje med tvorbo kosti, ki jo povzročajo osteoblasti, in tvorbo kosti, ki jo povzročajo osteoklastiresorpcijo kostije motena, pospešena resorpcija kosti pa je nazadnje povzročila osteoporozo in celo zlom kolka ali hrbtenice [2]. Menili so, da se je diferenciacija osteoklasta sprožila, ko se je receptorski aktivator jedrnega faktorja kapa B (RANK) vezal na RANKL, ligand RANK. Vendar pa kombinacije RANK in RANKL ni mogoče aktivirati, razen če se ji pridruži faktor 6, povezan z receptorjem faktorja tumorske nekroze proteina (TRAF6) [3], čemur sledi stimulacija spodnjih signalnih poti, vključno s PI3K/AKT in NF-κB. . Končno je bilo regulirano izražanje jedrskega faktorja aktiviranih celic T c2 (NFAT2) in c-Fos [4], da se modulira diferenciacija osteoklasta in tudi resorpcija kosti. Tako so dejavniki in regulatorji, ki so neposredno ali posredno povezani z aktivacijo in diferenciacijo osteoklasta, veljali za ključne tarče za preprečevanje izgube kosti.

Dejansko obstajajo nekatera klinična in sintetična hormonska nadomestna zdravila, kot je estradiol valerat, ki so učinkovita pri zdravljenju postmenopavzalne osteoporoze. Na žalost so nekateri od teh povečali tveganje za resne oblike raka, vključno z rakom dojke in endometrija [5], kar je omejilo njihovo klinično uporabo. Zato je treba izbrati druge alternative z učinkovitostjo in minimalnimi stranskimi učinki. Tradicionalna kitajska zdravila (TCM) ter izolirane bioaktivne spojine in frakcije [6–9] so se izkazala za učinkovita pri različnih boleznih, vključno s postmenopavzalno osteoporozo. Med temi bioaktivnimi komponentami in frakcijami so spojine feniletanoidnega glikozida (PhG) s potencialno učinkovitostjo veljale za obetavna sredstva za zdravljenje osteoporoze [10–12]. Strukture PhG so sestavljene iz aglikona cimetove kisline, hidroksi fenil etilne skupine, ki je združena z -glukopiranozo, apiozo, galaktozo, ramnozo ali ksilozo preko glikozidne vezi. Široko obstajajo v zdravilnih vrstah iz rodu Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma je ​​uradni TCM, ki je zapisan v kitajski farmakopeji, in poleg tega, da je pomemben TCM [14], je C deserticola tudi krepilno zelišče proti staranju z malo stranskimi učinki, ki so ga razvili v zdravilne pijače in hranilne tekočine, ki jih je odobril državna uprava za hrano in zdravila. Na podlagi zapisov kitajske farmakopeje so domorodci C. deserticola tradicionalno uporabljali za reševanje težav s pomanjkanjem ledvične esence, kot sta šibkost mišic in ledvena šibkost, feniletanoidne glikozidne spojine, vključno z ehinakozidom in acetonidom, pa so glavne bioaktivne sestavine v tej rastlini. V skladu s teorijo TCM o "kosti, ki upravlja ledvice", kostni sistem ureja ledvična esenca [15], težave, povezane s kostmi, kot je osteoporoza, pa bi se lahko pozdravile z zelišči ali spojinami, ki imajo aktivnost hranjenja ledvične esence. Zato smo domnevali, da je celotna frakcija feniletanoidnega glikozida, izolirana iz C. deserticola, vsaj delno koristna pri zdravljenju osteoporoze. Trenutni poskus je bil zato zasnovan za potrditev naše hipoteze z uporabo modela podgan z ovariektomijo (OVX); poleg označevalcev resorpcije in tvorbe kosti, ki jih je treba oceniti, so bili za raziskovanje glavnih mehanizmov antiosteoporotične bioaktivnosti uporabljeni tudi indeks antioksidacije ter RANKL/RANK/TRAF6- inducirane signalne poti PI3K/AKT in NF-κB .

2. Materiali in metode

2.1. Rastlinski materiali in priprava.

Skupaj 30 kg stebel Cistanche deserticola YC Ma je ​​bilo zbranih v okrožju Yongning septembra 2015 s koordinatami 106.026597 in 38.262816, Provinca Ningxia, Kitajska. Zelišče je identificiral dr. Lin Dong (Oddelek za farmakognozijo, Medicinska univerza Ningxia) in ustrezen primerek (št. 20150901) je bil ohranjen na oddelku farmacevtske analize. Najprej smo ekstrahirali 30.0 kg C. deserticola v prahu z uporabo refluksne metode s 70% etanolom kot topilom; razmerje med materialom in topilom je bilo nastavljeno na 1:10, čas refluksa pa je bil 2 uri 3-krat. Nato smo vse filtrate združili in kondenzirali pod znižanim tlakom pri 60 stopinjah C. Drugič, za predhodno ločitev smo uporabili kolone makroporozne smole AB-8 in različna razmerja etanola v vodi (0%, 20%, Za eluiranje smo uporabili 30 %, 40 %, 50 % in 60 %, vsak po 60 L). Tretjič, 40 % in 50 % eluente smo združili in dodatno očistili s ponavljajočimi se kolonami makroporozne smole AB-8 z eluenti 0 %, 20 %, 30 %, 40 % in 50 % etanola v vodi in vsak eluent je bil 12 L. Končno smo zbrali 40 % frakcijo in jo kondenzirali pod znižanim tlakom, da smo dobili 150 g bledo rumene usedline feniletanoidne glikozidne frakcije C. deserticola (CDP, dobitek je bil 0,5 %). Za poskuse in vivo je bilo za raztapljanje CDP uporabljeno 0,5 % topilo CMC-Na; peroralno dajanje živalim je bilo nastavljeno na 1 ml/100 g telesne teže; za in vitro Western blot analizo smo CDP raztopili z DMSO in nato razredčili z DMEM, da smo dobili končne koncentracije 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL in 0,001 mg/mL.

2.2. Kemikalije in topila.

Estradiolvalerat (EV) je bil iz Delpharm Lille SAS, Francija; alkalna fosfataza (ALP),kostni gla-protein(BGP), kisle fosfataze, odporne proti tartratu (TRAP), in deoksipiridinolinskih (DPD) navzkrižnih kompletov ELISA podjetja Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Šanghaj, Kitajska, 201605; kompleti reagentov za malondialdehid (MDA, 20181221), super oksid dismutazo (SOD, 20121218) in glutation (GSH, 20181221) iz Inštituta za biološko inženirstvo Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kitajska; Kompleti ELISA za navzkrižno povezavo nedotaknjenega parathormona (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonina (2L9ISN7AIU) in z estrogenom povezanega receptorja alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) podjetja Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Kitajska; reagentni komplet katepsin K ELISA proizvajalca BioVision, Amerika, 1l300141; primarna protitelesa RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 kinaza p85 alfa (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411) in sekundarna protitelesa proti kunčjim IgG, konjugiranim s hrenovo peroksidazo, iz ZSGB-BIO, Kitajska, 136080; komplet za analizo celotnega proteina BCA in komercialni komplet za odkrivanje tvorbe oste oklasta in fetalnega govejega seruma ter Dulbeccov modificiran Eagleov medij (DMEM) iz HyClone, Logan, UT, ZDA; membrana iz poliviniliden fluorida (PVDF) podjetja Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ZDA; penicilin in streptomicin iz Gibco, Rockville, MD, ZDA. Vsi drugi uporabljeni kemični agensi so bili stopnje AR.

2.3. HPLC kvantifikacija CDP.

Za identifikacijo in kvantifikacijo sestave CDP je bil uporabljen HPLC instrument Agilent 1220. Pogoji kromatografije so bili naslednji: kolona C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradientna elucija je vsebovala topili A (acetonitril) in B (voda, ki vsebuje 0,5 % ocetne kisline) (0-10 min: 17-20 % A; 10-30 min: 20-25 % A; in 30-40 min: 25-30% A); valovna dolžina detekcije je bila 333 nm; sobna temperatura; hitrost pretoka je bila 1,0 ml/min; volumen injekcije vzorca je bil 5 μL. Identificiranih je bilo osem PhG spojin, in sicer cistanozid F, ehinakozid, 6'-acetilakteozid, cistanozid C, cistanozid A, akteozid, 2'-acetilakteozid in izoakteozid; z uporabo ustreznih referenčnih snovi in ​​zunanje standardne metode smo vsebnost zgornjih 8 PhG kvantificirali z analizo HPLC (slika 1).

Slika 1: HPLC prstni odtis CDP. V tej frakciji je bilo najdenih osem feniletanoidnih glikozidnih spojin, skupna vsebnost pa je bila kvantificirana kot 50,7%. Spojine in njihove vsebnosti so bile naslednje: (1) akteozid F (3,6 %), (2) ehinakozid (8,8 %), (3) cistanozid A (5,0 %), (4) akteozid (13,3 %), (5) izoakteozid (3,3 %), (6) akteozid C (3,6 %), (7) 2'-acetilakteozid (9,9 %) in (8) 6'-acetilakteozid (3,2 %).

2.4. Protokol poskusov na živalih.

Skupno 60 samic odraslih podgan Sprague-Dawley, starih 3 mesece, je bilo izbranih iz centra za testiranje na živalih medicinske univerze Ningxia, s povprečno začetno telesno težo približno 234 ± 25 g. Podgane so bile 1 teden nameščene v standardnem specifičnem okolju brez patogenov, namenjenem aklimatizaciji. Nato so bile vse podgane samo anestezirane (kloralhidrat, 100 mg/kg, ip) ali navidezno ovariektomizirane (SHAM) ali oba oba odstranjena jajčnika in nato naključno razdeljeni v 5 podskupin: peroralno zdravljene z vehiklom (0,5 % CMC- Na) je bil nastavljen kot modelna skupina (OVX), estradiol valerat (1 mg/kg/dan) kot pozitivna skupina (EV) in 60, 120 in 240 mg/kg/dan CDP kot nizek (CDPL), skupine z zmernim (CDPM) in visokim (CDPH) odmerkom. Vsem podganam so dajali peroralno dnevno in je trajalo 3 mesece, pri čemer so odmerek prilagajali vsaka 2 tedna, kar je bilo odvisno od spremembe celotne telesne teže. Zadnji dan poskusa na živalih je bil 24-urni urin pridobljen z uporabo presnovnih kletk; serum smo zbrali iz femoralne arterije anestetiziranih podgan; desna stegnenica, golenica in vsi organi so bili razrezani in shranjeni pri -80 stopinjah C za nadaljnjo analizo. Poskuse na živalih, ki smo jih izvedli, je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Medicinske univerze Ningxia.

2.5. Določanje mineralne gostote kosti in mikro-CT analiza.

Najprej je bil uporabljen dvoenergijski rentgenski absorptiometrični aparat (Lunar, ZDA) za oceno skupne mineralne gostote kosti desne stegnenice vsake podgane; drugič, ista stegnenica je bila uporabljena za oceno 3D slike mikroarhitekture trabekularne kosti z uporabo mikro-CT skenerja (GE, Amerika). Izotropna ločljivost je bila nastavljena na 14 μm, da bi dobili idealno 3D sliko; območje interesa (ROI) je bilo izbrano z nastavitvijo istih koordinat v rastni plošči stegnenice vsakega vzorca; in morfometrične parametre kosti, vključno s trabekularno ločitvijo (Tb.Sp), trabekularnim številom (Tb.N), trabekularno debelino (Tb. Th), vsebnostjo mineralov v kosteh (BMC), mineralno gostoto tkiva (TMD) in vsebnostjo mineralov v tkivih (TMC) ) so bili pridobljeni z analizo ROI.

2.6. Biokemijski test seruma in urina.

Aktivnosti serumskega katepsina K, TRAP, SOD in GSH ter vsebnosti serumskega PTH, kalcitonina, ERR, MDA, BGP in urinskega DPD so bile določene z uporabo ustreznih reagentnih kompletov po navodilih proizvajalca in raven alkalne fosfataze (ALP) ter vsebnost kalcija (Ca) in fosforja (P) v serumu in urinu smo ocenili z avtomatsko napravo (Ciba-Corning 550 Diagnostic Corp., Oberlin, OH, ZDA).

2.7. Western blot analiza.

Osteoklaste smo inducirali z uporabo celic RAW 264.7, dodanih s faktorjem, ki spodbuja kolonijo makrofagov (MCSF) in RANKL. Na kratko, 1 × 107 celic RAW 264.7 smo gojili v 6-plošči z vdolbinicami v prisotnosti 30 ng/mL MCSF in 25 ng/mL RANKL. Po 6 dneh indukcije so dozorele osteoklastne celice identificirali z metodo, obarvano s TRAP, z ustreznim kompletom, nato pa jih obdelali s CDP (0.1, 0.01 in 0,001 mg/mL 24 h; nato smo celice lizirali z liznim pufrom, ki je vseboval 0,5 mmol fenilmetilsulfonil fluorida, inhibitorje proteaze in fosfataze. Lizat smo nato ločili z uporabo 10 % SDS-PAGE in ga prenesli na PVDF membrano, ki smo jo testirali z AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos in -aktinom ( 1 : 400) po 2-urnem blokiranju s 5 % nemastnim mlekom. Iste membrane smo odstranili in ponovno testirali z zgornjimi 9 ustreznimi protitelesi, nato pa jih je na koncu zaznala programska oprema Image Lab. Poskuse smo ponovili trikrat.

2.8. Statistična analiza.

Vsi podatki, pridobljeni iz poskusov in vivo in in vitro, opisani kot povprečje ± SD, so bili analizirani z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Dunnettov test (programska oprema SPSS 22.0, SPSS, ZDA); p < 0 05 je bil statistično pomemben.

Podporna služba Wecistanche

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Nakupujte za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop