Koristni učinki skupne frakcije feniletanoidnega glikozida, izolirane iz Cistanche Deserticola, na mikrostrukturo kosti pri podganah z ovariektomijo

1. Uvod

Postmenopavzalna osteoporoza, za katero bo zbolela 1 od 3 žensk, starejših od 50 let, postaja glavna nevarnost za zdravje, ki prizadene več kot 200 milijonov žensk po vsem svetu [1]. V menopavzi močno znižanje ravni estrogena običajno povzroči prekomerno resorpcijo kosti, ki jo povzroči povečana osteoklastogeneza; takrat se poruši ravnovesje med tvorbo kosti, ki jo povzročijo osteoblasti, in resorpcijo kosti, ki jo povzročijo osteoklasti, in pospešenoresorpcijo kostinazadnje povzročil osteoporozo in celo zlom kolka ali hrbtenice [2]. Menili so, da se je diferenciacija osteoklasta sprožila, ko se je receptorski aktivator jedrnega faktorja kapa B (RANK) vezal na RANKL, ligand RANK. Vendar kombinacije RANK in RANKL ni mogoče aktivirati, razen če se ji pridruži faktor 6, povezan z receptorjem faktorja tumorske nekroze proteina (TRAF6) [3], čemur sledi stimulacija spodnjih signalnih poti, vključno s PI3K/AKT in NF-κB. Končno je bilo regulirano izražanje jedrskega faktorja aktiviranih celic T c2 (NFAT2) in c-Fos [4], da se modulira diferenciacija osteoklasta in tudi resorpcija kosti. Tako so dejavniki in regulatorji, ki so neposredno ali posredno povezani z aktivacijo in diferenciacijo osteoklasta, veljali za ključne tarče za preprečevanje izgube kosti. Dejansko obstajajo nekatera klinična in sintetična hormonska nadomestna zdravila, kot je estradiol valerat, ki so učinkovita pri zdravljenju postmenopavzalne osteoporoze. Na žalost so nekateri od teh povečali tveganje za resne oblike raka, vključno z rakom dojke in endometrija [5], kar je omejilo njihovo klinično uporabo. Zato je treba izbrati druge alternative z učinkovitostjo in minimalnimi stranskimi učinki. Tradicionalna kitajska zdravila (TCM) ter izolirane bioaktivne spojine in frakcije [6–9] so se izkazala za učinkovita pri različnih boleznih, vključno s postmenopavzalno osteoporozo. Med temi bioaktivnimi komponentami in frakcijami so spojine feniletanoidnega glikozida (PhG) s potencialno učinkovitostjo veljale za obetavna sredstva za zdravljenje osteoporoze [10–12]. Strukture PhG so sestavljene iz aglikona cimetove kisline, hidroksi fenil etilne skupine, ki je združena z -glukopiranozo, apiozo, galaktozo, ramnozo ali ksilozo preko glikozidne vezi. Široko obstajajo v zdravilnih vrstah iz rodu Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma je ​​uradni TCM, ki je zapisan v kitajski farmakopeji, in poleg tega, da je pomemben TCM [14], je C.deserticola tudi tonik proti staranju z malo stranskimi učinki, ki je bil razvit v zdravilno pijačo in hranilno tekočino, ki jo je odobril državna uprava za hrano in zdravila. Na podlagi zapisov kitajske farmakopeje so domorodci C. deserticola tradicionalno uporabljali za reševanje težav s pomanjkanjem ledvične esence, kot sta oslabelost mišic in ledvena šibkost, ter feniletanoidne glikozidne spojine, vključno zehinakozidin akteozid sta glavni bioaktivni sestavini tega zelišča. V skladu s teorijo TCM o "kosti, ki upravlja ledvice", kostni sistem ureja ledvična esenca [15], težave, povezane s kostmi, kot je osteoporoza, pa bi se lahko pozdravile z zelišči ali spojinami, ki imajo aktivnost hranjenja ledvične esence. Zato smo domnevali, da je celotna frakcija feniletanoidnega glikozida, izolirana iz C. deserticola, vsaj delno koristna pri zdravljenju osteoporoze. Trenutni poskus je bil zato zasnovan za potrditev naše hipoteze z uporabo modela podgan z ovariektomijo (OVX); poleg označevalcev resorpcije in tvorbe kosti, ki jih je treba oceniti, so bili za raziskovanje glavnih mehanizmov antiosteoporotične bioaktivnosti uporabljeni tudi indeks antioksidacije ter RANKL/RANK/TRAF6- inducirane signalne poti PI3K/AKT in NF-κB .

2. Materiali in metode

2.1. Rastlinski materiali in priprava.

Skupaj 30 kg stebel Cistanche deserticola YC Ma je ​​bilo zbranih v okrožju Yongning septembra 2015 s koordinatami 106.026597 in 38.262816, Provinca Ningxia, Kitajska. Zelišče je identificiral dr. Lin Dong (Oddelek za farmakognozijo, Medicinska univerza Ningxia), ustrezen primerek (št. 20150901) pa je bil ohranjen na Oddelku za Farmacevtska analiza. Najprej smo ekstrahirali 30.0 kg C. deserticola v prahu z uporabo refluksne metode s 70% etanolom kot topilom; razmerje med materialom in topilom je bilo nastavljeno na 1 : 10, čas refluksa pa je bil 2 uri 3-krat. Nato smo vse filtrate združili in kondenzirali pod znižanim tlakom pri 60 stopinjah C. Drugič, za predhodno ločitev smo uporabili kolone makroporozne smole AB-8 in različna razmerja etanola v vodi (0%, 20%, Za eluiranje smo uporabili 30 %, 40 %, 50 % in 60 %, vsak po 60 L). Tretjič, 40 % in 50 % eluente smo združili in dodatno očistili s ponavljajočimi se kolonami makroporozne smole AB-8 z eluenti 0 %, 20 %, 30 %, 40 % in 50 % etanola v vodi in vsak eluent je bil 12 L. Končno smo zbrali 40 % frakcijo in jo kondenzirali pod znižanim tlakom, da smo dobili 150 g bledo rumene usedline feniletanoidne glikozidne frakcije C. deserticola (CDP, dobitek je bil 0,5 %). Za poskuse in vivo je bilo za raztapljanje CDP uporabljeno 0,5 % topilo CMC-Na; peroralno dajanje živalim je bilo nastavljeno na 1 ml/100 g telesne teže; za in vitro Western blot analizo smo CDP raztopili z DMSO in nato razredčili z DMEM, da smo dobili končne koncentracije 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL in 0,001 mg/mL. 

NARAVNI izvleček CISTANCHE ZA RAST KOSTIJFENILETANOIDNI GLIKOZIDI 75 % EHINAKOZID 30 % AKTEOZID 12 %

2.2. Kemikalije in topila.

Estradiolvalerat (EV) je bil iz Delpharm Lille SAS, Francija; alkalna fosfataza (ALP), kostni gla-protein (BGP), kisla fosfataza, odporna na tartrat (TRAP), in deoksipiridinolin (DPD) navzkrižno povezani kompleti ELISA podjetja Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Šanghaj, Kitajska, 201605; kompleti reagentov za malondialdehid (MDA, 20181221), super oksid dismutazo (SOD, 20121218) in glutation (GSH, 20181221) iz Inštituta za biološko inženirstvo Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kitajska; Kompleti ELISA za navzkrižno povezavo nedotaknjenega parathormona (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonina (2L9ISN7AIU) in z estrogenom povezanega receptorja alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) podjetja Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Kitajska; reagentni komplet katepsin K ELISA proizvajalca BioVision, Amerika, 1l300141; primarna protitelesa RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kinaza p85 alfa (AC09021266) , AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411) in sekundarna protitelesa proti kunčjim IgG, konjugiranim s hrenovo peroksidazo, iz ZSGB-BIO, Kitajska, 136080; komplet za analizo celotnega proteina BCA in komercialni komplet za odkrivanje tvorbe oste oklasta in fetalnega govejega seruma ter Dulbeccov modificiran Eagleov medij (DMEM) iz HyClone, Logan, UT, ZDA; membrana iz poliviniliden fluorida (PVDF) podjetja Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ZDA; penicilin in streptomicin iz Gibco, Rockville, MD, ZDA. Vsi drugi uporabljeni kemični agensi so bili stopnje AR.

2.3. HPLC kvantifikacija CDP.

Za identifikacijo in kvantifikacijo sestave CDP je bil uporabljen HPLC instrument Agilent 1220. Pogoji kromatografije so bili naslednji: kolona C18 (TSK-GEL, 4,6.id × 250 mm, 5 μm); gradientna elucija je vsebovala topili A (acetonitril) in B (voda, ki vsebuje 0,5 % ocetne kisline) (0-10 min: 17-20 % A; 10-30 min: 20-25 % A; in 30-40 min: 25-30% A); valovna dolžina detekcije je bila 333 nm; sobna temperatura; hitrost pretoka je bila 1,0 ml/min; volumen injekcije vzorca je bil 5 μL. Identificiranih je bilo osem PhG spojin, in sicer cistanozid F, ehinakozid, 6'-acetilakteozid, cistanozid C, cistanozid A, akteozid, 2'-acetilakteozid in izoakteozid; z uporabo ustreznih referenčnih snovi in ​​zunanje standardne metode smo vsebnost zgornjih 8 PhG kvantificirali z analizo HPLC (slika 1).

Slika 1: HPLC prstni odtis CDP. V tej frakciji je bilo najdenih osem feniletanoidnih glikozidnih spojin, skupna vsebnost pa je bila kvantificirana kot 50,7%. Spojine in njihove vsebnosti so bile naslednje: (1) akteozid F (3,6 %), (2) ehinakozid (8,8 %), (3) cistanozid A (5,0 %), (4) akteozid (13,3 %), (5) izoakteozid (3,3 %), (6) akteozid C (3,6 %), (7) 2'-acetilakteozid (9,9 %) in (8) 6'-acetilakteozid (3,2 %).

2.4. Protokol poskusov na živalih.

Skupno 60 samic odraslih podgan Sprague-Dawley, starih 3 mesece, je bilo izbranih iz centra za testiranje na živalih medicinske univerze Ningxia, s povprečno začetno telesno težo približno 234 ± 25 g. Podgane so bile 1 teden nameščene v standardnem okolju brez specifičnih patogenov, da so se prilagodile. Nato so bile vse podgane samo anestezirane (kloralhidrat, 100 mg/kg, ip) ali navidezno ovariektomizirane (SHAM) ali oba oba odstranjena jajčnika in nato naključno razdeljeni v 5 podskupin: peroralno zdravljene z vehiklom (0,5 % CMC- Na) je bil nastavljen kot modelna skupina (OVX), estradiol valerat (1 mg/kg/dan) kot pozitivna skupina (EV) in 60, 120 in 240 mg/kg/dan CDP kot nizek (CDPL), skupine z zmernim (CDPM) in visokim (CDPH) odmerkom. Vsem podganam so dajali peroralno dnevno in je trajalo 3 mesece, pri čemer so odmerek prilagajali vsaka 2 tedna, kar je bilo odvisno od spremembe celotne telesne teže. Zadnji dan poskusa na živalih je bil 24-urni urin pridobljen z uporabo presnovnih kletk; serum smo zbrali iz femoralne arterije anesteziranih podgan; desna stegnenica, golenica in vsi organi so bili secirani in shranjeni pri -80 stopinji C za nadaljnjo analizo. Poskuse na živalih, ki smo jih izvedli, je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Medicinske univerze Ningxia.

2.5. Določanje mineralne gostote kosti in mikro-CT analiza.

Najprej je bil uporabljen dvoenergijski rentgenski absorptiometrični aparat (Lunar, ZDA) za oceno skupne mineralne gostote kosti desne stegnenice vsake podgane; drugič, ista stegnenica je bila uporabljena za oceno 3D slike mikroarhitekture trabekularne kosti z uporabo mikro-CT skenerja (GE, Amerika). Izotropna ločljivost je bila nastavljena na 14 μm, da bi dobili idealno 3D sliko; območje interesa (ROI) je bilo izbrano z nastavitvijo istih koordinat v rastni plošči stegnenice vsakega vzorca; in morfometrične parametre kosti, vključno s trabekularno ločitvijo (Tb.Sp), trabekularnim številom (Tb.N), trabekularno debelino (Tb.Th), vsebnostjo mineralov v kosteh (BMC), mineralno gostoto tkiva (TMD) in vsebnostjo mineralov v tkivu (TMC). ) so bili pridobljeni z analizo ROI.

Slika 2: Učinki OVX in 12-tedenskega zdravljenja s CDP ali EV na celotno mineralno gostoto kosti v desni stegnenici podgan, ki so ocenjeni z uporabo rentgenske absorpciometrije z dvojno energijo (n=10/skupino). Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 in ∗∗∗p < 0 001 v primerjavi s skupino OVX; ###p < 0 001 proti skupini SHAM.

Slika 3: Slike mikro-CT skeniranja mikroarhitekture desne stegnenice podgan, zdravljenih s CDP; prikazane fotografije so bile reprezentativne za 4 različne podgane v vsaki skupini: (A) skupina OVX; (B) skupina SHAM; (C) skupina EV; (D) skupina CDPH; (E) skupina CDPM; (F) Skupina CDPL. Izmerjeni parametri vključujejovsebnost mineralov v kosteh(BMC), vsebnost mineralov v tkivu (TMC), mineralna gostota tkiva (TMD), trabekularna separacija (Tb.Sp), trabekularno število (Tb.N) in debelina trabekule (Tb.Th). Podgane OVX so pokazale opazno zmanjšanje površine mikroarhitekture in trabekularnega števila. Podgane, zdravljene s CDP, in podgane, zdravljene z EV, so delno obrnile zgoraj omenjene ugotovitve v enaki meri po 12 tednih zdravljenja. Vse vrednosti so bile predstavljene kot povprečje ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 in ∗∗∗p < 0 001 v primerjavi s skupino OVX; ###p < 0 001 proti skupini SHAM.

Slika 4: Učinki OVX in 12-tedenskega zdravljenja s CDP ali EV na urin in serumski Ca in P ter PTH in kalcitonin podgan (n=10/skupino). Vsi podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 in ∗∗∗p < 0 001 v primerjavi s skupino OVX; # p < 0 05, ##p < 0 01 in ###p < 0 001 v primerjavi s skupino SHAM.

2.6. Biokemijski test seruma in urina.

Aktivnosti serumskega katepsina K, TRAP, SOD in GSH ter vsebnosti serumskega PTH, kalcitonina, ERR, MDA, BGP in urinskega DPD so bile določene z uporabo ustreznih reagentnih kompletov po navodilih proizvajalca in raven alkalne fosfataze (ALP) ter vsebnost kalcija (Ca) in fosforja (P) v serumu in urinu smo ocenili z avtomatsko napravo (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, ZDA).

2.7. Western blot analiza.

Osteoklaste smo inducirali z uporabo celic RAW 264.7, dodanih s faktorjem, ki spodbuja kolonijo makrofagov (MCSF) in RANKL. Na kratko, 1 × 107 celic RAW 264.7 smo gojili v 6-plošči z vdolbinicami v prisotnosti 30 ng/mL MCSF in 25 ng/mL RANKL. Po 6 dneh indukcije so dozorele osteoklastne celice identificirali z metodo, obarvano s TRAP, z ustreznim kompletom, nato pa jih obdelali s CDP (0.1, 0.01 in 0,001 mg/mL 24 h; nato smo celice lizirali z liznim pufrom, ki je vseboval 0,5 mmol fenilmetilsulfonil fluorida, inhibitorje proteaze in fosfataze. Lizat smo nato ločili z uporabo 10 % SDS-PAGE in ga prenesli na PVDF membrano, ki smo jo testirali z AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos in -aktinom ( 1 : 400) po 2-urnem blokiranju s 5 % nemastnim mlekom. Iste membrane smo odstranili in ponovno testirali z zgornjimi 9 ustreznimi protitelesi, nato pa jih je na koncu zaznala programska oprema Image Lab. Poskuse smo ponovili trikrat.

2.8. Statistična analiza.

Vsi podatki, pridobljeni iz poskusov in vivo in in vitro, opisani kot povprečje ± SD, so bili analizirani z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Dunnettov test (programska oprema SPSS 22.0, SPSS, ZDA); p < 0 05 je bil statistično pomemben.

3. Rezultati

3.1. Kemijska sestava CDP.

Z metodo HPLC osemfeniletanoidne glikozidne spojinev tej frakciji, kot prikazuje slika 1. Z uporabo standardnih referenc in zunanje standardne metode smo spojine in njihove vsebnosti identificirali in kvantificirali, kot sledi: (1) akteozid F (3,6 %), (2) ehinakozid (8,8 %), (3)cistanozidA (5.0%), (4) akteozid (13,3%), (5) izoakteozid (3,3%), (6) akteozid C (3,6%), (7) 2′-acetilakteozid (9,9% ) in (8) 6'-acetilakteozid (3,2 %). Celotna vsebnost teh osmih komponent je bila kvantificirana kot 50,7 %.

NARAVNI IZVLEČEK CEVKE CISTANCHEZA RAST KOSTIJFENILETANOIDNI GLIKOZIDI 75 % EHINAKOZID 30 % AKTEOZID 12 %

3.2. Učinki CDP na mineralno gostoto kosti in mikroarhitekturo trabekule.

Celotna mineralna gostota kosti pri podganah v različnih podskupinah je prikazana na sliki 2. Pri podganah v modelu OVX so opazili trend zmanjševanja vsebnosti mineralne gostote kosti v primerjavi s podganami v skupini SHAM (p < {{ 1}}). Vse podgane, zdravljene s CDP, so pokazale znatno povečano mineralno gostoto kosti za 11,2 %, 12.0% oziroma 10,7% (p < 0 01) v primerjavi s podganami iz modelne skupine OVX. Poleg tega je skladno s podatki o skupni mineralni gostoti kosti mikro-CT rekonstrukcija in histomorfometrična določitev stegnenice pokazala, da so podgane v skupini OVX pokazale očitno poslabšanje trabekularne arhitekture, kar dokazuje opazno zmanjšano število in površina trabekule. kot tudi izrazito povečan Tb.Sp v primerjavi s podganami skupine SHAM. Zdravljenje s CDP je preprečilo z OVX povzročeno poslabšanje trabekularne arhitekture; kot prikazuje slika 3, so bile vrednosti BMC, TMC in Tb.N znatno povečane, površina Tb.Sp pa se je opazno zmanjšala, medtem ko se zdi, da na vrednosti TMD in Tb.Th operacija OVX ni bistveno vplivala in naša CDP poseg.

Slika 5: Učinki OVX in 12-tedenskega zdravljenja s CDP ali EV na serumske aktivnosti TRAP, katepsina K, DPD, ALP in BGP podgan OVX (n=10/skupino). Vse vrednosti so bile predstavljene kot povprečje ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 in ∗∗∗p < 0 001 v primerjavi s skupino OVX; # p < 0 05, ##p < 0 01 in ###p < 0 001 v primerjavi s skupino SHAM.

3.3. Učinki CDP na biokemične parametre urina in seruma.

Kot prikazuje slika 4, so bili pri podganah modelne skupine OVX zaznani pomembni trendi zniževanja ravni P v urinu in vsebnosti kalcitonina v serumu, kar je bilo skoraj 30 % in 60 % manj kot pri podganah SHAM (p < 0 001 ), medtem ko med skupinama OVX in SHAM niso opazili očitnih naraščajočih ali padajočih trendov ravni Ca in serumskega Ca v urinu ter serumskega P in serumskega PTH. Zdravljenje s CDP je pomembno preprečilo izgubo serumskega P in Ca pri podganah OVX, kar dokazujejo ravni serumskega P in Ca, ki so se znatno povečale (p < 0 05) v primerjavi s podganami iz modelne skupine OVX. Poleg tega so opazili povečane, a nestatistično pomembne trende kalcitonina tako v skupinah z nizkim kot visokim odmerkom CDP v primerjavi z modelno skupino OVX.

Slika 6: Učinki OVX in 12-tedenskega zdravljenja s CDP ali EV na izražanje ERR, telesno težo ter težo maternice in vagine podgan (n=10/skupino). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 in ∗∗∗p < 0 001 v primerjavi s skupino OVX; ###p < 0 001 proti skupini SHAM.

3.4. Učinki CDP na tvorbo kosti in markerje za resorpcijo kosti.

Ugodni učinki CDP na indeks tvorbe kosti ter inhibicijski vpliv naresorpcijo kostioznačevalci so bili opisani na sliki 5. V zvezi z označevalci tvorbe kosti operacija ovariektomije skoraj ni vplivala na ravni serumskega BGP, kar dokazujejo nepomembne spremembe, opažene v vseh zdravljenih skupinah, medtem ko so bile statistično pomembne izboljšave serumske ALP dosežene tako pri nizkih (6 0 mg/kg) in zmernih (120 mg/kg) odmerkov intervencijskih skupin CDP v primerjavi s podganami skupine SHAM (p < 0 01). Kar zadeva indeks kostne resorpcije, so bile ravni serumskega katepsina K in DPD ter TRAP pri podganah modelne skupine OVX znatno povečane za približno 75,0 %, 41,4 % oziroma 21,0 % v primerjavi s podganami SHAM. in pri zdravljenju s CDP, zlasti z nizkim odmerkom 60 mg/kg, so bile lastnosti katepsina K in DPD ter TRAP v modelni skupini OVX opazno inhibirane za 67,3 %, 41,4 % oziroma 25,9 %, kot v primerjavi s podganami v modelni skupini OVX.

NARAVNA CEVKA CISTANCHE ZA RAST KOSTIJFENILETANOIDNI GLIKOZIDI 75 % EHINAKOZID 30 % AKTEOZID 12 %

3.5. Učinki CDP na vagino in maternico ter celotno telesno težo.

Nepomembne razlike v začetni teži celotnega telesa podgan so opazili pred zdravljenjem v šestih skupinah (slika 6). Vendar je operacija ovariektomije privedla do znatnega povečanja končne telesne teže podgan v modelni skupini OVX, ki znaša skoraj 36.0%, medtem ko se je mokra teža maternice in vagine drastično zmanjšala za skoraj 9{{4} }.0 % oziroma 60,0 % v primerjavi s podganami SHAM (p < 0 001). Čeprav vsebnost ERR ni pokazala pomembne razlike med skupinama OVX in SHAM, so vse zdravljene skupine, vključno s CDP in EV, znatno povečale raven ERR. Poleg tega se je pri zdravljenju z EV zgoraj omenjena pridobitev celotne telesne teže ter izguba teže vagine in maternice pri podganah OVX delno obrnila (p < 0 001), vendar intervencija CDP nanje ni vplivala.

3.6. Učinki CDP na ravni serumskega MDA, SOD in GSH.

Med skupinama modela SHAM in OVX ni bilo statistično pomembne razlike v lastnostih serumskega SOD in GSH; kot je prikazano na sliki 7, je med zgornjima skupinama mogoče opaziti trend naraščanja GSH. Poleg tega se je raven serumskega MDA močno povečala za skoraj 50 % pri podganah iz skupine modela OVX v primerjavi s podganami SHAM. Zdravljenje s CDP ni vplivalo na aktivnost SOD, medtem ko je bila lastnost GSH znatno izboljšana s posegom CDP, CDP pa je opazno znižal raven MDA za 33,9 % oziroma 42,4 % pri odmerkih 60 oziroma 240 mg/kg ( p < 0 001).

3.7. Učinki CDP na ravni izražanja beljakovin.

Naši podatki, prikazani na sliki 8, kažejo, da je zdravljenje s CDP znatno zmanjšalo ravni beljakovin TRAF6, RANK in RANKL v primerjavi s kontrolo. Nižje signalne poti, vključno z NF-κB, so bile potlačene, PI3K/AKT pa je bil stimuliran z intervencijo CDP, kar dokazuje izražanje znižane regulacije NF-κB-p65, medtem ko sta bila PI3K p85 in AKT1 regulirana navzgor. Posledično se je izražanje NFAT2 znatno zmanjšalo, c Fos pa se je povečal po zdravljenju s CDP v koncentraciji 0.001-0.1 mg/mL. Predlagani mehanizem je opisan na sliki 9, kjer je CDP znižal ravni RANKL in RANK, kar je zmanjšalo količine vezave tega liganda z njegovim receptorjem. Povezava RANKL z RANK se je dodatno zmanjšala z znižanjem regulacije TRAF6, čemur je sledila supresija spodnjih poti, vključno s potjo NF-κB. V nasprotju s tem je bila stimulirana signalna pot PI3K/AKT, kar je končno vodilo do zmanjšanja izražanja NFAT2 in povečanja ravni c-Fos.

4. Razprava

Feniletanoidni glikozidiso naravno prisotne vodotopne komponente, ki so široko prisotne v kraljestvu zdravilnih rastlin [11]. Doslej so spojine feniletanoidnih glikozidov pritegnile vedno več raziskovalcev zaradi njihove očitne vloge pri zdravljenju različnih človeških bolezni in nepravilnosti [13]. Številne antiosteoporotične bioaktivne frakcije in spojine, vključno s polifenolnimi in feniletanoidnimi glikozidi, so bile identificirane in izolirane iz več deset naravnih zdravilnih zelišč [5, 10, 12, 16, 17]

Slika 8: Učinki različnih koncentracij CDP na proteinske ekspresije TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF- κBIA (f), NFAT2 (g), in c-Fos (h) (n=3/skupino); ekspresija proteina je bila normalizirana na -aktin, kvantitativni podatki vsakega signalnega proteina pa so bili prikazani kot odstotki vrednosti kontrole. Podatki so bili opisani kot povprečje ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 in ∗∗∗p < 0 001 v primerjavi s kontrolno skupino.

C. deserticola je znana kot "puščavski ginseng", kar nakazuje varnostni profil te užitne tradicionalne kitajske medicine [18, 19]. Kot splošno krepilno zelišče in naravna zdrava hrana, ki se že dolgo uporablja v azijskih državah, je C. deserticola izkazala koristno funkcijo za povečanje moči ledvic. Ugotovljeno je bilo, da se TKM, ki se tradicionalno uporablja za poživljanje in ohranjanje ledvične esence, običajno uporablja za zdravljenje osteoporoze, in vitro in in vivo objavljeni podatki so dokazali antiosteoporotično delovanje C. deserticola [20–23], in sestavine feniletanoidnega glikozida, vključno z ehinakozidom in akteozidom, so glavne bioaktivne sestavine, ki obstajajo v tej užitni zdravilni rastlini; vse to je nakazovalo, da ne samo ehinakozid in akteozid sam, ampak tudi druge komponente feniletanoidnega glikozida, ki jih vsebuje C. deserticola, niso bili odgovorni za antiosteoporotične lastnosti te rastline. V naši pričujoči študiji je bila uporabljena ugodna varnostna makroporozna smola za izolacijo in obogatitev frakcije feniletanoidnega glikozida iz C. deserticola in z uporabo metode HPLC osem glavnih komponent feniletanoidnega glikozida, in sicer akteozid F, ehinakozid, cistanozid A, akteozid, izoakteozid, akteozid C, 2'-acetilakteozid in 6'-acetilakteozid so bili najdeni v frakciji izoliranega fenilletanoidnega glikozida, vsebnosti pa so bile 3,6 %, 8,8 %, 5,0 %, 13,3 %, 3,3 %, 3,6 %. 9,9 % oziroma 3,2 %. Dokazano je, da ima ehinakozid, ena glavnih učinkovin, zabeleženih pri C. deserticola [14], antiosteoporotično delovanje; vendar je bil odmerek 270 mg/kg tako visok, da je omejil njegovo nadaljnjo klinično uporabo [24]. V trenutnih poskusih je bila na podganah OVX uporabljena skupna frakcija feniletanoidnega glikozida z nižjim odmerkom 60-240 mg/kg telesne teže/dan, vsebnost identificiranih sestavin pa je bila skoraj 50-odstotna čista v tej frakciji z uporabo metoda HPLC.

Dobro je bilo znano, da lahko OVX povzroči osteoporozo, in podgana OVX je veljala za klasičen in primeren model za simulacijo postmenopavzalne osteoporoze pri ljudeh. Istočasno so po operaciji ovariektomije opazili znatno zmanjšanje mineralne gostote kosti, trabekularne kostne mikroarhitekture, mokre teže maternice in nožnice ter ravni estrogena ter očitno izboljšanje resorpcije kosti in telesne teže, od tega v delno zaradi izgube estrogena [25]. Naši dosedanji podatki so jasno pokazali, da je OVX dejansko povzročil postmenopavzalno osteoporozo in jo vedno spremlja močan upad kakovosti kosti, mikroarhitekture kosti ter mokre teže maternice in nožnice. Ker je EV splošno hormonsko nadomestno sredstvo, ki se uporablja v klinični praksi, je bil uporabljen kot pozitivna kontrola v našem poskusu in vivo, pridobljena telesna teža in teža atrofirane maternice ter poslabšana mineralna gostota kosti in mikroarhitektura trabekularne kosti so bili pričakovano obrnjena z dodatkom EV. Za razliko od pozitivne kontrole zdravljenje s CDP ni vplivalo na zmanjšano vaginalno in maternično težo ter na pridobljeno celotno telesno težo podgan v modelni skupini OVX, kar je pomenilo, da lahko CDP poveča tvorbo kosti, ne da bi povzročil stranske učinke. na organska tkiva telesa in maternice. Čeprav so bile ravni ERR znatno uravnane z zdravljenjem s CDP, je bilo tako kot učinek fitoestrogena, da niso opazili stranskih učinkov na organska tkiva maternice in vagine. Poleg tega je zdravljenje s CDP znatno okrepilo kakovost kosti pri podganah OVX, ki se je poslabšala zaradi operacije ovariektomije.

Poleg tega so bile ravni P in Ca v urinu in serumu podgan OVX uporabljene tudi za odraz antiosteoporotičnega učinka, koncentracije Ca in anorganskega P pa so bile običajno odvisne od ravni kalcitonina in PTH [26]. V tej študiji, čeprav ni znatnega upadanja ali naraščajočih trendov v ravni izločanja Ca z urinom,

Slika 9: Domnevni molekularni mehanizem: CDP bi lahko preprečil izgubo kosti pri podganah OVX z RANKL/RANK/TRAF6-inducirano inaktivacijo NF-κB in aktivacijo poti PI3K/AKT ter stimulacijo c-Fos in supresijo NFAT2 , kar dokazuje znižana regulacija ravni izražanja TRAF6, RANKL, RANK, NF-κBIA in NFAT2, medtem ko so bili c-Fos, AKT in PI3K znatno povečani z zdravljenjem s CDP v primerjavi s kontrolno skupino

Dobljeni so bili serumski P, serumski Ca in PTH pri podganah iz modelne skupine OVX, opažene pa so bile pomembne ravni P in kalcitonina v urinu (p < 0 001). V skladu z objavljenimi podatki, da je pomanjkanje estrogena, povzročeno z operacijo ovariektomije, vedno povzročilo znižano raven kalcitonina v krvi, je ta zmanjšan serumski kalcitonin končno privedel do povečane ravni PTH, kjer je veljalo, da je Ca glavni regulator izločanja PTH. Ker koncentracija PTH ni pokazala pomembne razlike med skupinama OVX in SHAM v tej študiji, tudi raven Ca v serumu in urinu ni pokazala očitnih sprememb med zgornjima skupinama. Vendar pa je bila pridobljena znatno zmanjšana težnja na ravni kalcitonina med skupinama OVX in SHAM, posledično pa se je vsebnost P v urinu OVX močno zmanjšala. Verjamemo, da lahko zgornji podatki pojasnijo kontradiktorni pojav, zakaj izločanje ravni Ca z urinom pri podganah OVX ni pokazalo očitnih sprememb v primerjavi s podganami SHAM, ta pojav pa je lahko povezan tudi s povečano stopnjo kostne premene [27] . Po zdravljenju s CDP so bile ravni P in Ca v serumu opazno povečane, vsebnost P v urinu pa je bila znižana pri podganah OVX, kar je odražalo, da CDP ne more samo preprečiti izločanja kostnih mineralnih elementov, temveč tudi povečati serumsko vsebnost teh elementov in tako posredno zavira izgubo kostne mase.

Poleg tega so bili za razlago osnovnih antiosteoporotičnih mehanizmov CDP uporabljeni tudi označevalci tvorbe in resorpcije kosti ter antioksidativni encimi, vključno s SOD in GSH. Podobno kot v objavljenih podatkih je raven ALP pri podganah v modelni skupini OVX pokazala nestatistično pomemben naraščajoči trend, kar kaže na pospešeno stopnjo kostne premene pri postmenopavzalni osteoporozi [10]. Vendar pa se je po zdravljenju s CDP (60, 120 in 240 mg/kg/dan) lastnost ALP bistveno izboljšala. Dobro je bilo znano, da je OVX povzročil močno znižanje ravni estrogena, kar običajno vodi do prekomerne resorpcije kosti in oksidativnega stresa [28], kar dokazujejo ravni TRAP, katepsina K in DPD ter MDA, ki so bile izrazito povečane pri podganah Skupina modelov OVX. Vendar so bila ta poslabšanja delno izboljšana s posredovanjem CDP. Poleg tega je zdravljenje podgan OVX s CDP (60 in 240 mg/kg) pokazalo znatno povečanje aktivnosti GSH (p < 0 05). Zgornji rezultati so nakazali, da je CDP pokazal terapevtski učinek na osteoporozo, ki jo povzroča OVX, in ti učinki so bili tako s povečanjem tvorbe kosti in zaviranjem resorpcije kosti kot tudi izboljšanjem kostnega antioksidantnega sistema.

Aktivacija RANK z njegovim ligandom RANKL je stimulirala ekspresijo NFAT2 in c-Fos prek signalizacije PI3K/AKT in NF-κB [29]. Izkazalo se je, da je NF-κB bistvenega pomena za osteoklastogenezo, saj bi motnja NF-κB lahko povzročila oslabljeno diferenciacijo osteoklastov z osteoporotičnim fenotipom, NF-κB pa je povečal ekspresijo c-Fos in znižal NFAT2 med osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL/RANK/TRAF. Za oceno koristnega vpliva CDP na osteoklastogenezo, ki jo posreduje NFAT2 in c-Fos, so analizirali ravni izražanja RANKL in RANK. Pričakovano je CDP znatno zaviral NFAT2 in stimuliral ravni c-Fos z znižanjem izražanja RANKL in RANK. Medtem pa RANK sam ni imel intrinzične lastnosti kinaze, razen če se mu pridruži TRAF6, da sproži signalizacijo navzdol [3]. CDP je tudi zmanjšal izražanje TRAF6, kar je povzročilo znatno zmanjšanje vezavnih količin RANKL in RANK. Domnevni antiosteoporotični mehanizem CDP na podganah OVX je pokrival zgornje signalne poti, regulatorji pa so bili opisani na sliki 9. Na kratko, CDP je znižal ravni TRAF6, RANKL in RANK, s čimer je zatrl spodnje signalne poti, vključno s PI3K/AKT in NF-κB, ki sproži RANKL/RANK in končno zmanjša izražanje in aktivnosti ključnih osteoklastogenih proteinov NFAT2 in c-Fos. Zato je več namigov podatkov nakazalo koristen učinek CDP na metabolizem kosti pri podganah OVX predvsem prek poti PI3K/AKT in NF-κB, ki jih posreduje RANKL/RANK/TRAF6-.

5. Zaključek

Če povzamemo, skupni feniletanoidni glikozidi, izolirani iz C. deserticola, so pokazali znatne ugodne učinke na postmenopavzalno osteoporozo pri podganah OVX, terapevtski potencial pri zatiranju izgube kosti pa je bil predvsem s spodbujanjem tvorbe kosti in zaviranjem resorpcije kosti ter izboljšanjem kostnega antioksidanta sistem; mehanizmi so lahko povezani z RANKL/RANK/TRAF6-inducirano aktivacijo NF-κB in inaktivacijo PI3K/AKT ter stimulacijo c-Fos in supresijo NFAT2, končno pa je bila inhibirana diferenciacija osteoklasta.

NARAVNA CEVKA CISTANCHE ZA RAST KOSTIJFENILETANOIDNI GLIKOZIDI 75 % EHINAKOZID 30 % AKTEOZID 12 %