Biomonitoring mikotoksinov v plazmi bolnikov z Alzheimerjevo in Parkinsonovo boleznijoⅡ

2. Rezultati in razprava

2.1. LC-MS/MS analiza

Zaradi različnih fizikalno-kemijskih lastnosti smo mikotoksine za kromatografsko ločevanje razdelili v dve skupini (glej razdelek o materialih in metodah). Naslednje slike (slike 1–4) prikazujejo ekstraponirane kromatograme mikotoksinov v kalibratorjih in vzorcu plazme (kodificiranem kot vzorci 1–4) pred in po encimski obdelavi. Kot je razvidno, se OTA pojavlja v vzorcih pred in po encimski obdelavi (slika 1; slika 3); medtem ko se STER pojavi šele po encimski obdelavi (slika 3). Nobeden od drugih analiziranih mikotoksinov ni bil odkrit v vzorcih plazme.

Vsaka od umeritvenih krivulj, uporabljenih pri kvantifikaciji mikotoksinov, je izpolnjevala merila, ki so bila predhodno opredeljena med validacijo metode. Primeri dobljenih umeritvenih krivulj za vsak mikotoksin so predstavljeni v tabelah S1 in S2. Ocenjena je bila tudi identiteta spojin: prehodi kvalifikacije (q) in kvantifikacije (Q) za vsak odkriti mikotoksin so bili opaženi pri vsakem od posameznikov in pozitivnih vzorcev ter dobljena relativna napaka (RE) med vrednostmi razmerja q/Q za vsak mikotoksin v kalibratorjih in vzorcih je bil manjši od 20 odstotkov [32]. Poleg tega se retencijski časi pri vzorcih in kalibratorjih niso razlikovali za več kot 2,5 odstotka [33] (1,3 odstotka za OTA pred in 1,6 odstotka po encimski obdelavi; 0,3 odstotka za OTB in 1,8 odstotka za STER).

2.2. Vzorci plazme

Skupno 93 subjektov, vključno s 25 zdravimi kontrolami (CNT) in 68 bolniki, je bilo izbranih iz nevrološke službe v bolnišnici San Pedro v La Rioji (Španija). Kontrolni darovalci so bili nepovezani spremljevalci bolnikov brez očitnih ali diagnosticiranih nevroloških bolezni. Bolnike smo razdelili po patologijah: 44 bolnikov s PB in 24 z AD.

Kliknite za cistanche tubulosa kapsule za Alzheimerjevo bolezen in Parkinsonovo bolezen

Diagnozo in napredovanje bolezni izbranih bolnikov so izvedli strokovnjaki nevrologi v skladu z lestvico Hoehn in Yahr (HY) za PD (tabela S3) in lestvico globalnega poslabšanja (GDS) za AD (tabela S4). Vsi bolniki z AD so že kazali klinične znake blagega kognitivnega upada ali demence (od 3 do 7 po lestvici GDS). Bolniki s PD so bili razdeljeni v dve skupini, saj je bilo napredovanje bolezni različno med bolniki s posamezniki, ki niso kazali oslabljenih posturalnih refleksov (1 in 2, lestvica HY), in drugimi, ki so že kazali oslabljene posturalne reflekse (od 2,5 do 3, lestvica HY).

Vendar pa je bila zaradi majhnega števila vzorcev statistična analiza bolnikov s PB izvedena kot ena skupina. Število preiskovancev, vključenih v vsako skupino in podskupino, je skupaj s spolom, starostnim razponom in napredovanjem bolezni navedeno v tabeli 1. Popolne posamezne informacije o preiskovancih, vključenih v študijo, so podane v dodatnem gradivu (tabeli S5 in S6).

2.3. Prisotnost mikotoksinov

Od 19 ocenjenih mikotoksinov so bili v vzorcih odkriti samo OTA, OTB in STER. OTA je bil prisoten pred in po zdravljenju z mešanico glukuronidaze/arilsulfataze, medtem ko je bil OTB zaznaven le pred in STER se je pojavil šele po encimskem zdravljenju. Opozoriti je treba, da je bila zaradi omejene količine nekaterih vzorcev ocena po encimski obdelavi možna le pri 74 od 93 zbranih vzorcev.

Analitični rezultati, dobljeni za OTA, OTB in STER, so povzeti v tabeli 2. Zaradi potrditve identifikacijskih kriterijev (prehodi q in Q morajo biti prisotni in primerjani s kalibratorji RE za oba, razmerje q/Q in retencijski čas, ki bi moral biti < 20 odstotkov oziroma 2,5 odstotka), so bili za analizo obdelave podatkov uporabljeni vzorci z vrednostmi, večjimi ali enakimi LOD. Zato so bili izračuni izvedeni z uporabo substitucijske metode spodnje meje [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) v vzorcih, obdelanih pred encimsko obdelavo. Kar zadeva prisotnost OTA, so bili v vseh skupinah najdeni vzorci pod LOD. Najvišja raven OTA (8,81 ng/mL) je ustrezala 66-letni ženski v kontrolni skupini. Kar zadeva kontrolno populacijo, sta bila OTA in OTB prisotna v 92 odstotkih oziroma 24 odstotkih vzorcev.

Ti rezultati so v skladu z nedavno študijo, izvedeno v Navarri, sosednji regiji v Španiji. V tej študiji je bil OTA prisoten v 97,3 odstotka in OTB v 10 odstotkih vzorcev (n=438) [35], izmerjenih z isto metodo, kot je bila uporabljena v trenutni študiji [36]. V tej študiji so srednje vrednosti OTA (2,15 ng/mL) nekoliko nižje od tistih, izmerjenih v Navarri (2,87 ng/mL). Ravni OTA so se gibale od LOD do 8,81 ng/mL, medtem ko se je v vzorcih iz Navarre koncentracija OTA gibala med LOD in 19,9 ng/mL (z vzorcem, ki je dosegel 45,7 ng/mL pri 66-letni ženski).

Glede na spol in tudi v skladu s študijo Navarra [35] je bilo mogoče opaziti, da so bile povprečne vrednosti OTA pred encimskim zdravljenjem običajno višje pri moških kot pri ženskah v vseh skupinah. Čeprav je odstotek OTA-pozitivnih vzorcev v skladu s prejšnjimi študijami, izvedenimi v Španiji, so povprečne in najvišje ravni OTA v populaciji CNT te študije in nedavne študije Navarra [35] višje od tistih v prejšnjih študijah iz Španije .

Ker so bili ti podatki pridobljeni pred letom 2011, naši podatki podpirajo potrebo po nadaljnjem biomonitoringu ravni mikotoksinov v splošni populaciji. Kot smo že opazili [35], je bil OTB prisoten v nekaj vzorcih in se je vedno pojavljal sočasno z OTA (razen pri enem človeku CNT). Presenetljivo je, da OTB ni bil zaznan v skupini AD. OTB je deklorirani analog OTA in ni bil izmerjen v doslej izvedenih študijah biomonitoringa pri ljudeh.

OTB je lahko prisoten v človeških vzorcih, saj je znano, da je prisoten v nekaterih živilskih matricah, kot je vino [37], lahko pa je tudi človeški metabolit OTA [38]. Na žalost je v tej študiji nemogoče razlikovati med možnimi viri OTB ali vedeti, ali je lahko odsotnost OTB v skupini AD posledica drugačnega vzorca uživanja hrane pri bolnikih ali drugačnega metabolizma zaradi bolezni ali če je to posledica majhnega števila analiziranih vzorcev. Analiza podatkov po encimski obdelavi je pokazala, da je OTA še vedno zaznana (89 odstotkov vzorcev).

Poleg tega, kot smo že opazili pri zdravih darovalcih Navarre [35], se je STER pojavil v večini vzorcev (88 odstotkov), medtem ko OTB ni bil več odkrit. Pri primerjavi prisotnosti OTA pred in po encimskem zdravljenju je bil odstotek pozitivnih vzorcev pred encimskim zdravljenjem pri CNT večji kot pri bolnikih; medtem ko se je po encimskem zdravljenju prisotnost OTA zmanjšala za CNT, medtem ko se je povečala pri bolnikih z AD in PD. Nekateri avtorji podpirajo hipotezo, da lahko konjugati OTA nastanejo med človeškim metabolizmom [39–41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) v 88 odstotkih analiziranih vzorcev. Ti podatki podpirajo hipotezo, da STER-glukuronidi nastajajo med človeškim metabolizmom [35,42].

2.4. Statistična analiza

Glede na analitične rezultate so bili statistični izračuni izvedeni le za OTA in STER. OTB ni bil vključen v statistično analizo, ker je bilo samo 12 vzorcev (13 odstotkov) večje ali enako LOD. Hipoteza o normalni porazdelitvi (Shapiro–Wilkov test) je bila zavrnjena, zato so bili za statistično obravnavo uporabljeni neparametrični testi, ki ne vključujejo nobene predpostavke porazdelitve. STER je bil odkrit šele po encimski obdelavi, zato je bila statistična analiza za STER opravljena na 74 razpoložljivih rezultatih, dobljenih po encimski razgradnji. Po drugi strani sta bila za OTA na voljo dva nabora podatkov rezultatov, tisti, pridobljen s podatki obdelave pred encimsko obdelavo, in tisti, pridobljen po encimski obdelavi (tj. OTA pred in po).

Zaradi nepopolnosti OTA po naboru podatkov (74 zapisov) je bilo odločeno, da se izvedejo statistični izračuni z upoštevanjem samo OTA pred naborom podatkov (93 zapisov). Za potrditev odločitve o izključitvi OTA po naboru podatkov je bil izveden Wilcoxonov test ujemajočih se parov s predznakom, da bi raziskali morebitne razlike med seznanjenimi rezultati OTA pred in po naborih podatkov.

Preizkus ni pokazal nobene pomembne razlike pri uporabi vrednosti OTAbefore in OTAafter celotne skupine prebivalstva (n=74, z=−1,438, p-vrednost=0.1503), kar potrjuje da celoten nabor podatkov OTAbefore ustreza statističnim ocenam. Kot smo že omenili, ni na voljo nobenih prejšnjih študij, ki bi spremljale mikotoksine v vzorcih plazme bolnikov s PD ali AD. Zato je bil za zajem vseh možnih razlik in povezav ravni koncentracije OTA in STER med skupinami in podskupinami izveden Wilcoxonov test vsote rangov ali Kruskal–Wallisov test za primerjavo več spremenljivk.

Poleg tega so bile raziskane morebitne statistično pomembne razlike z delitvijo skupin po spolu in bolezni (bolniki s PD in AD), pri čemer so upoštevali tudi stopnjo bolezni (lestvica HY ali GDS). Povzetek vseh razlik, ki so bile statistično značilne (p-vrednost < 0.050) pri primerjavi porazdelitev OTA ali STER med skupinami, med CNT in skupino bolnikov (kot celoto ter kot skupini PD in AD), med spolov in med skupinami v vsakem spolu in spolni spremenljivki, so prikazani v tabeli 3.

Ugotovljeno je bilo, da so razlike med ravnmi porazdelitve OTA statistično pomembne pri primerjavi skupine CNT, PD in AD, vendar to razliko (p-vrednost=0.0447) vodi primerjava PD/AD (p- vrednost=0.0114), pri čemer je PD skupina bolnikov, za katero so značilne višje vrednosti. Pri obravnavi stopnje bolezni pri primerjavi porazdelitev podskupine 1 PD in podskupine 2 PD ni bilo opaziti nobene razlike, kar kaže, da v skupini PD stopnja bolezni ne vpliva na razliko v porazdelitvi. Pri primerjavi spolov je primerjava ravni OTA pri moških in ženskah dala statistične razlike bodisi pri vseh preiskovancih bodisi v skupini bolnikov (PD plus AD), pri čemer so moški vedno kazali višje ravni kot ženske.

Zato se porazdelitve OTA ne razlikujejo, če primerjamo CNT in skupine bolnikov, vendar se zdi, da bi spol lahko deloval kot gonilo razlik v porazdelitvi ravni OTA bolj kot diagnoza bolezni. Poleg tega pri testiranju razlik v distribucijah OTA za moške in ženske ločeno med skupinami (CNT, PD, AD) test ni pokazal nobene razlike.

Statistična analiza ravni STER med CNT in skupino bolnikov je pokazala statistično različne porazdelitve (p-vrednost < 0.0001), pri čemer so bile vrednosti CNT nižje. Skupina CNT/PD/AD je pokazala statistično različne porazdelitve (p-vrednost=0.0001), razlika pa je bila potrjena tudi s primerjavo CNT/PD in CNT/AD (p-vrednost < 0,0001 v obeh primerih), z mediana nižje vrednosti v skupini AD.

Zato je bila na ravneh STER porazdelitev skupine CNT vedno drugačna v primerjavi z bolniki in skupinami bolezni. Pri primerjavi porazdelitev po spolu med moškimi in ženskami je bila poudarjena kakršna koli statistična razlika, ravni STER v posameznih skupinah moških in žensk so bile različne v vseh primerjavah (CNT/PD/AD, CNT/skupina bolnikov, CNT/PD, CNT/AD), moški in ženske v skupini CNT pa so bili vedno nižji kot v skupinah bolnikov.

To nakazuje, da lahko diagnoza bolezni vpliva na porazdelitev ravni STER. Razlike med ravnmi koncentracije OTA in STER so bile raziskane tudi s primerjavo porazdelitve obeh skupin bolnikov (PD in AD) pri vsakem spolu (pri moških in ženskah) in primerjavo lestvice bolezni, GDS v skupini bolnikov z AD in lestvice HY pri skupina bolnikov z AD in nobene statistične razlike. Niti porazdelitev OTA niti STER nista pokazali nobene razlike tudi pri primerjavi lestvice HY kot binarne spremenljivke HY_d=0 (1. podskupina PD, lestvica HY v območju 1–2) in HY{{6 }}d=1 (2. podskupina PD, lestvica HY v razponu 2,5–3).

Tako je pri primerjavi vedenja porazdelitve OTA in STER natančno ugotovljeno, da so razlike OTA znotraj spola (z M > W) in znotraj skupin bolnikov (PD > AD), pri vseh primerjavah pa se je pokazala izrazita statistična razlika. Kar zadeva STER, so razlike v porazdelitvah zabeležene za primerjavo CNT in skupine bolnikov (skupina bolnikov > CNT), vse ocene pa so vedno testirale statistično razliko. Po drugi strani pa dva raziskana mikotoksina nista poudarila nobene razlike z raziskovanjem znotraj podskupin bolnikov in/ali stopnje bolezni.

Kolikor nam je znano, ni na voljo nobenih drugih študij za primerjavo ravni mikotoksinov pri bolnikih z nevrodegenerativnimi boleznimi. Vendar pa so nekateri avtorji predlagali, da je treba dodatno oceniti vlogo mikotoksinov pri poslabšanju kliničnih manifestacij motenj avtističnega spektra [43,44].

Avtorji so dejansko poudarili statistično pomembne razlike pri primerjavi mikotoksinov (DON, DOM-1 v urinu in AFM1, OTA in FB1 v plazmi) med avtističnimi in kontrolnimi skupinami otrok. Rezultati te študije so tudi v skladu z novejšo študijo naše skupine [45], v kateri je bilo ugotovljeno, da so pojavnost OTA in koncentracije v plazmi višje pri otrocih iz kontrolne skupine kot pri otrocih z avtističnim spektrom ali motnjami pozornosti in hiperaktivnostjo.

Kar zadeva vpliv spola in glede na rezultate te študije, so bile v večini objavljenih študij plazemske ravni OTA pri moških višje kot pri ženskah [46]; čeprav Warensjö et al. (2020) pri švedskih mladostnikih [47] in Coronel et al. (2011) [48] niso ugotovili razlik v plazemskih ravneh OTA med moškimi in ženskami. Za oceno razmerja med ravnmi OTA in STER v plazmi ter starostno spremenljivko je bil izračunan Spearmanov rang korelacijski koeficient (rho).

Vsi rho s statistično pomembnostjo (vrednosti p < 0.050) so povzeti v tabeli 4. Na splošno so bile ugotovljene šibke negativne in pozitivne korelacije: OTA in STER šibko korelirata s starostjo. Zlasti ravni OTA padajo s starostjo (negativne korelacije, rho < 0), vrednost rho pa se poveča, ko je izbrana skupina PD ali skupina moških; poleg tega je vrednost rho še višja, če so izbrane vrednosti moških v skupini PD. Nasprotno pa so korelacije STER pozitivne in statistično značilne, če je izbrana skupina žensk.

Za prikaz opaženih korelacij sta na sliki 5 prikazana raztresena grafa OTA/moški v skupini bolnikov s PD in STER/ženske pri vseh osebah. Prikazujeta razpršeni graf dveh spremenljivk za toksine in starost, prilagojena črta pa pomaga vizualizirati korelacija.

Mehanizem Cistanchejevega zdravljenja Parkinsonove bolezni in Alzheimerjeve bolezni

Cistanche je tradicionalno kitajsko zelišče, ki se že vrsto let uporablja zaradi potencialnih koristi za zdravje. V zadnjih študijah je bilo ugotovljeno, da ima lahko Cistanche nevroprotektivne učinke in je lahko učinkovit pri zdravljenju Alzheimerjeve bolezni (AD) in Parkinsonove bolezni (PD).

Mehanizem Cistanche pri učinkovitem zdravljenju AD in PD se pripisuje njegovim aktivnim sestavinam, kot so ehinakozid, akteozid in cistanozidi. Te spojine naj bi imele antioksidativne in protivnetne lastnosti, ki lahko zmanjšajo oksidativni stres in vnetja v možganih, ki so povezana z razvojem in napredovanjem nevrodegenerativnih bolezni.

Cistanche lahko tudi spodbuja rast živčnih celic in izboljša kognitivno funkcijo s povečanjem ravni možganskega nevrotrofičnega faktorja (BDNF), beljakovine, ki ima ključno vlogo pri rasti in vzdrževanju nevronov. Poleg tega se je pokazalo, da Cistanche zmanjšuje -amiloidne plake, ki so značilne za Alzheimerjevo bolezen, in zmanjšuje kopičenje -sinukleina v možganih, ki je povezan s Parkinsonovo boleznijo.

Na splošno so potencialne terapevtske koristi zdravila Cistanche pri zdravljenju AD in PD obetavne, vendar so potrebne nadaljnje študije za pojasnitev natančnih mehanizmov delovanja in potrditev njegove učinkovitosti in varnosti v kliničnih okoljih.

se nadaljuje...

Beatriz Arce-López 1, Lydia Alvarez-Erviti 2, Barbara De Santis 3, María Izco 2, Silvia López-Calvo 4, Maria Eugenia Marzo-Sola 4, Francesca Debegnach 3, Elena Lizarraga 1, Adela López de Cerain 5,6, Elena González-Peñas 1,† in Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Oddelek za farmacevtsko tehnologijo in kemijo, raziskovalna skupina MITOX, Fakulteta za farmacijo in prehrano, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​Španija; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Laboratorij za molekularno nevrobiologijo, Center za biomedicinske raziskave La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3. nadstropje, 26006 Logroño, Španija; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Nacionalni referenčni laboratorij za mikotoksine in rastlinske toksine, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Italija; barbara.desantis@iss.it (BDS); francesca.debegnach@iss.it (FD)

4 Servicio de Neurología, bolnišnica San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, Španija; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain