CaWRKY30 pozitivno uravnava imunost paprike z usmerjanjem CaWRKY40 proti inokulaciji z bakterijo Ralstonia Solanacearum prek modulacije genov, povezanih z obrambo. 1. del

Povzetek:

Mreža transkripcijskih faktorjev WRKY (TF) je sestavljena iz podskupine WRKY TF, ki ima ključno vlogo pri uravnavanju imunosti rastlin. Vendar pa funkcije omrežja WRKY TF ostajajo nejasne, zlasti pri nemodelnih rastlinah, kot je poper (Capsicum annum L.). Ta študija je funkcionalno označila CaWRKY30—član skupine III Pepper WRKY proteina—za odpornost popra proti okužbi z Ralstonia solanacearum. CaWRKY30 je bil odkrit v jedru in njegove ravni transkripcijske ekspresije so bile znatno povečane z inokulacijo R. solanacearum (RSI), foliarno uporabo etilena (ET), abscizinske kisline (ABA) in salicilne kisline (SA). Z virusom povzročeno utišanje genov (VIGS) CaWRKY30 je povečalo ranljivost paprike za RSI.

Poleg tega je utišanje CaWRKY30 s strani VIGS ogrozilo HR podobno celično smrt, ki so jo sprožili RSI in znižani geni, povezani z obrambo, kot so CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1 in CaWRKY40. Nasprotno pa je prehodna čezmerna ekspresija CaWRKY30 v listih paprike sprožila HR podobno celično smrt in povečala obrambno povezane markerske gene. Poleg tega je prehodna čezmerna ekspresija CaWRKY30 povečala transkripcijske ravni CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 in CaWRKY40.

Po drugi strani pa je prehodna čezmerna ekspresija CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 in CaWRKY40 povečala nivoje transkripcijske ekspresije CaWRKY30. Rezultati kažejo, da na novo označen CaWRKY30 pozitivno uravnava odpornost paprike proti napadu Ralstonia, ki ga ureja sinergistično posredovano signaliziranje s fitohormoni, kot so ET, ABA in SA, in transkripcijsko asimilacijo v mreže WRKY TF, ki jih sestavljajo CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 in CaWRKY40 . Skupaj bodo naši podatki olajšali razlago osnovnega mehanizma preslušavanja med imunostjo paprike in odzivom na RSI.

Transkripcijski faktorji imajo ključno vlogo v imunskem sistemu, saj nadzorujejo regulacijo izražanja genov in tvorbo specifičnih vrst celic. Sledi razmerje med transkripcijskimi faktorji in imunostjo:

1. Transkripcijski faktor - NF-κB: NF-κB je ključni transkripcijski faktor, ki sodeluje pri uravnavanju adaptivnih imunskih odzivov celic T in B celic. Aktivacija NF-κB lahko spodbudi vnetni odziv, imunski odziv in celično apoptozo.

2. Transkripcijski faktorji – STAT: STAT so transkripcijski faktorji, ki posredujejo signalizacijo nosilca in celične odzive. STAT se lahko aktivirajo, igrajo ključno vlogo pri aktiviranih celicah T in celicah B ter sodelujejo v procesih, kot so proliferacija, diferenciacija in aktivacija imunskih celic.

3. Transkripcijski faktor – AP-1: AP-1 je družina transkripcijskih faktorjev, ki sodelujejo pri uravnavanju različnih celičnih funkcij in imunskih odzivov. Aktivacija AP-1 lahko spodbuja procese, kot so celična proliferacija, diferenciacija in transformacija, ter vzdržuje protivirusne in imunske odzive.

4. Transkripcijski faktorji – CEBP: CEBP so velika družina transkripcijskih faktorjev, vključno s CEBP , , , itd. v različnih tkivnih celicah. V imunskem sistemu CEBP sodeluje pri aktivaciji makrofagov in sproščanju citokinov ter pri diferenciaciji in aktivaciji celic B in celic T.

Transkripcijski faktorji skupaj igrajo pomembno vlogo pri imunosti, saj sodelujejo pri uravnavanju in vzdrževanju aktivnosti imunskega sistema v različnih vrstah in funkcijah celic. Zato moramo tudi v vsakdanjem življenju posvetiti pozornost izboljšanju imunosti. Cistanche lahko poveča imunost, polisaharidi v mesu pa lahko uravnavajo imunski odziv človeškega imunskega sistema, izboljšajo stresno sposobnost imunskih celic in povečajo učinek sterilizacije imunskih celic.

Kliknite zdravstvene koristi cistanche

Ključne besede:

čili poper (Capsicum annuum); Ralstonia solanacearum; CaWRKY30; WRKY TF-ji.

1. Uvod

Rastline so zaradi svoje nepremične narave med življenjem pogosto izpostavljene različnim biotskim in abiotskim stresom [1,2]. Rastline so razvile več obrambnih mehanizmov kot odziv na ponavljajoče se selekcijske pritiske večjih ekoloških in okoljskih omejitev. Različni transkripcijski faktorji (TF) se med seboj povezujejo, da razvijejo sofisticirana transkripcijska omrežja za uravnavanje teh klasičnih obrambnih mehanizmov na transkripcijski ravni [3,4]. Obrambne reakcije na različne strese so ustrezno sinhronizirane in nadzorovane, saj so kritične za rastline v obliki porabe energije in razvoja [5]. Obrambni mehanizmi se lahko razlikujejo pri različnih rastlinskih vrstah zaradi različnih okoljskih okoliščin, ki vplivajo na njihovo prilagajanje [6–8].

Zato obrambnega sistema, ki ga uporabljajo modelne rastline, ni mogoče v celoti implicirati na nemodelne rastline. Zato so bili obrambni sistemi rastlin glavni poudarek v zadnjih desetletjih; vendar so bile te študije večinoma osredotočene na modelne rastline, tj. Arabidopsis thaliana in riž (Oryza sativa L.). Kljub temu je bila funkcionalna sinhronizacija teh transkripcijskih kompleksov za uravnavanje odziva rastlin na različne strese slabo raziskana, predvsem pri nemodelnih rastlinah.

Proteini WRKY sestavljajo največjo družino TF v rastlinah. TF WRKY vsebujejo eno ali dve domeni WRKY in običajno zaporedje WRKYGQK na N-koncu, ki mu sledi motiv cinkovega prsta C2HC ali C2H2 [4,9,10]. Proteini WRKY so filogenetsko razdeljeni v tri glavne skupine (tj. skupine I–III), ki temeljijo na več domenah WRKY in strukturi motiva cinkovega prsta.

Skupina II WRKY TF je ponovno razdeljena na pet podskupin (IIa, IIb, IIc, IId in IIe) [11–13]. Člani WRKY se v glavnem vežejo z W-polji [TTGAC(C/T)], ki jih najdemo v promocijskih regijah različnih ciljnih genov, tako da navpično vstavijo izključni klin v glavni utor DNA [14] z motivom WRKY GQK na drugi verigi b, ki stimulira transkripcijska modulacija ekspresije ciljnih genov [14–16]. WRKY so bili vključeni v več bioloških sistemov v rastlinah, vključno z mirovanjem semen, kalitvijo semen, staranjem in razvojem semen. Podobno so tudi ti vključeni v odziv na biotske in abiotske strese in preklapljanje transkripcije njihovih ciljnih genov [17–20].

Poroča se, da skupina WRKY TF ali en WRKY TF, transkripcijsko induciran s samo enim stresom, modulira več stresov. W-polja so obogatena znotraj promotorskih regij [21–24]. Te študije prikazujejo prisotnost omrežij WRKY, vpletenih v odziv na določen stres ali kombinacijo dveh ali več. V zadnjem desetletju so pogosto raziskovali vlogo beljakovin WRKY in osnovnih mehanizmov pri odzivu na biotske in abiotske strese; vendar je bil poudarek teh študij predvsem na enem genu kot odzivu na en stres v modelnih rastlinah, npr. A. thaliana in O. sativa. Pred kratkim je bila predlagana pomembna funkcionalna razlika med bližnjimi homologi WRKY TF iz različnih rastlinskih vrst [24, 25]. Funkcije WRKY in spleta WRKY v nemodelnih rastlinah, kot je Capsicum annuum L., kot odziv na posamezne ali kombinirane obremenitve, so bile do zdaj slabo raziskane.

Poper je svetovno znan po svojem gospodarskem pomenu. Seje se v visokogorju v zmernih sezonah [26,27]. Poper je izpostavljen različnim boleznim, ki se prenašajo s prstjo, kot sta ožig popra in bakterijsko venenje, ki ju povzročajo bakterijski patogeni, tj. Phytophthora capsicum oziroma Ralstonia solanacearum [28, 29]. Naključje teh patogenov ima uničujoče učinke na pridelavo paprike pri visokih temperaturah in visoki vlažnosti (HTHH). HTHH oslabi imunost paprike, ki jo posreduje protein R, in pospeši rast in razvoj patogenov. Poleg tega napad patogena in HTHH istočasno izvajata naravni selekcijski pritisk na poper, kar je v preteklosti vplivalo na razvoj popra [30–32]. Nasprotno pa hkratni pojav okužbe s patogeni in HTHH morda ne bo vplival na razvoj modelnih rastlin, kot sta A. thaliana in O. sativa. Zato se zdi poper primernejši za raziskave imunosti proti biotskim ali abiotskim stresom, tj. RSI ali HTHH.

Ralstonia solanacearum povzroča bakterijsko venenje v številnih pridelkih, npr. papriki, paradižniku, krompirju itd. Je gram-negativna proteobakterija, ki se prenaša v tleh [33]. Tvori hitre kolonije v tkivih ksilema, kar vodi do bolezni bakterijskega venenja v napadenih rastlinah [34].

Znano je, da odzive rastlinskih vrst na biotski in abiotski stres uravnavajo fitohormoni [35]. Fitohormoni so drobne molekule, ki sodelujejo pri uravnavanju rasti rastlin, razmnoževanju in preživetju rastlin. Salicilna kislina (SA) in jasmonska kislina (JA) sta kritični za imunske odzive rastlinskih vrst. Ta dva veljata za kritične temelje imunskega odziva rastlin proti patogenom. Biosinteza in signalizacija SA sta ključnega pomena za obrambo pred biotrofnimi patogeni, medtem ko JA zagotavlja obrambo pred nekrotrofnimi patogeni [36,37]. Etilen (ET) pomaga pri obrambnih odzivih proti številnim interakcijam med rastlino in patogenom [37].

Različne avtohtone sorte paprike subtropskih območij kažejo pospešeno odpornost na bolezni, tudi pod HTHH [38]. S toploto povezani cis-element HSE na splošno obstaja skupaj s fitohormoni, vključno s SA, JA, ET, ABA ali s patogeni povezanimi cis-elementi v promocijskih regijah večine MAPK in CDPK, ki sodelujejo pri imunosti rastlin [39–41]. Priporoča prisotnost preslušavanja med imunostjo in HTHH. Genom paprike je 27 oziroma 7,5-krat večji od A. thaliana oziroma O. sativa. Vendar pa ima samo 73 genov WRKY, medtem ko imajo manjši genomi A. thaliana in O. sativa 72 oziroma 122 genov WRKY [9,42,43]. Prej smo odkrili, da so bili CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45] in CaWRKY58 [46] vključeni v odziv paprike na RSI.

Med njimi CaWRKY6, -22, -27 in -40 delujejo kot pozitivni regulatorji imunosti rastlin, medtem ko je CaWRKY58 negativni regulator. Ti geni imajo podmnožico elementov HSE in W-polj v svoji promocijski regiji in promotorje drugih WRKY TF, kar sklepa na vlogo WRKY omrežij pri regulaciji odziva popra proti RSI. Poleg tega sta CaWRKY40 neposredno regulirala CaWRKY6 [44] in CabZIP63 [16], medtem ko je CaWRKY40 posredno reguliral CaCDPK15 [47]. Nasprotno pa večina WRKY TF paprike še ni bila opredeljena glede na njihov odziv na napade patogenov.

V trenutni študiji je bila izolirana cDNA polne dolžine za družino paprike WRKY TFs in poimenovana CaWRKY30. Označili smo ga ekspresivno in funkcionalno ter ugotovili, da je bil CaWRKY30 induciran z RSI in foliarnim nanašanjem SA, JA, ET in ABA. Prehodna prekomerna ekspresija CaWRKY30 v listih paprike je sprožila HR podobno celično smrt in proizvodnjo H2O2. Utišanje CaWRKY30 v popru je ogrozilo odpornost popra na RSI. Ti rezultati kažejo, da CaWRKY30 pozitivno uravnava odpornost paprike na RSI.

2. Rezultati

2.1. Kloniranje in analiza zaporedja CaWRKY30

Z analizo celotnega genoma je bil identificiran nov gen WRKY CaWRKY30 (CA01g34480). Gen CaWRKY30 je bil izbran za funkcionalno karakterizacijo, saj obstoj z imunostjo povezanih cis-elementov, kot so TGA (faktor vezave motiva TGACG), motiv TGACG, TATC-box, TATAbox in W-box v regiji promotorja označuje njegovo možno vlogo pri imunosti paprike (slika S1). Fragment cDNA CaWRKY30 (CA01g34480) 924 bp odprtega bralnega okvirja (ORF) je bil kloniran z uporabo gensko specifičnih primerjev (tabela S1). Dolžina izpeljanega aminokislinskega zaporedja CaWRKY30 je bila 307 aminokislinskih ostankov, ki so imeli ohranjeno domeno WRKY, in je bila kategorizirana v skupino III (slika 1). Predvideni protein ima velikost in teoretični pI 34,55 kDa oziroma 7,32. CaWRKY30 si deli 88, 60, 68 in 57 odstotkov aminokislinske identitete z NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53 in StWRKY53 (slika S2).

2.2. Transkripcijska ekspresija CaWRKY30 pod RSI in zdravljenjem z različnimi fitohormoni

Prisotnost cis-elementov, povezanih z imunostjo, v promotorski regiji CaWRKY30 je pokazala njegovo potencialno vlogo pri imunskem RSI paprike. Da bi preverili idejo, je bila izvedena analiza qRT-PCR za oceno transkripcijskih ravni CaWRY30 na RSI. Transkripcijske ravni CaWRKY30 so bile povečane v listih, obdelanih z Ralstonia, v primerjavi z lažno obdelanimi listi (slika 2A). Izboljšane ravni transkripcijske ekspresije CaWRKY30 so bile konsistentne med 0 in 48 urami po zdravljenju (HPT). Najvišje ravni transkripcijske ekspresije so bile zabeležene pri 48 hpt (slika 2A).

Fitohormoni, vključno s signalnimi potmi, posredovanimi z ET, ABA, SA in JA, so ključni regulatorji reakcij rastlin na biotske in abiotske strese. Regulacijo CaWRKY30 s signalnimi potmi, posredovanimi s fitohormoni, so preučevali s foliarno aplikacijo ET, ABA, SA in JA z analizo qRT-PCR. Rezultati so pokazali, da so bile relativne ravni transkripcijske ekspresije CaWRKY30 povečane od 0 h do 48 hpt s 100 µM ET v primerjavi z lažnim. Te ravni transkripcije so bile najvišje pri 48 hpt z ET (slika 2B). Foliarna uporaba 100 µM ABA je znatno povečala transkripcijske ravni CaWRKY30 v primerjavi z lažno uporabo. Ravni transkripcije so dosegle najvišjo raven pri 12 hpt z ABA (slika 2C). Rezultati so pokazali, da se je transkripcijsko kopičenje CaWRKY30 znatno povečalo po nanosu 1 mM SA v primerjavi z lažnim. Te izboljšane ravni transkripcijske ekspresije so bile najvišje pri 24 hpt (slika 2D).

Slika 2. Preizkus qRT-PCR relativnih ravni transkripcijske ekspresije CaWRKY30 v listih paprike, ki so bili cepljeni z bakterijo Ralstonia solanacearum (RSI), in foliarno uporabo različnih fitohormonov. Analiza qRT-PCR je bila uporabljena za preverjanje transkripcijskih ravni CaWRKY30 v listih paprike, izpostavljenih različnim obdelavam, vključno z RSI (A), nanosom 100 µm ET (B), nanosom 100 µm ABA (C) in nanosom 1 mM SA (D) v različnih časovnih intervalih. Številčnost transkripcije v listih, obdelanih z RSI, so primerjali s kontrolnimi listi, obdelanimi z MgCl2 - (lažno), katerih relativna raven izražanja je bila nastavljena na "1". (B–D) Ravni transkripcijske ekspresije v listih, obdelanih s fitohormoni, so primerjali z listi, obdelanimi z ddH2O (navidezno), katerih raven izražanja je bila nastavljena na "1". Višina stolpca označuje povprečja, stolpci napak pa standardno napako povprečij. Različne črke nad stolpci kažejo pomembno razliko med srednjimi vrednostmi, ki temeljijo na Fisherjevem zaščitenem LSD testu.

2.3. Ugotovljeno je bilo, da je CaWRKY30 lokaliziran v jedru

Analiza zaporedja z uporabo WoLFPSORT je pokazala, da ima predvideno zaporedje beljakovin CaWRKY30 domnevni signal jedrske lokalizacije (slika 1), ki kaže njegovo potencialno ciljanje v jedru. Za potrditev tega dojemanja je bil ustvarjen fuzijski konstrukt aCaWRKY30 GFP, ki ga je poganjal konstitutivni promotor CaMV35S. Nato je bil ta konstituirani vektor prenesen v sev Agrobacterium GV3101. Začasno smo prekomerno izrazili konstrukt CaWRKY30 GFP v listih Nicofiamabenthamiana z injekcijo A. tumefacient, signale GFP pa smo pregledali s konfokalnim fluores.science mikroskopom. Rezultati so pokazali, da so bili GFP signali CaWRKY30-GFP prisotni v jedrih, medtem ko je bil GFP nadzora zaznan v različnih subceličnih delih, kot sta citoplazma in jedra (slika 3).

Slika 3. Podcelična lokalizacija CaWRKY30. CaWRKY30 se je v celoti nahajal v jedru listov nicotiane benthamine. Zelena barva prikazuje GFP Modra barva prikazuje DAPI obarvanje jedra. Cianova barva prikazuje zlitje zelenega CFP in modro obarvanega jedra z DAPI. CPP signaGreen) za kontrolo so bili listi N. benthamiana odkriti po celi celici. slike so bile posnete s konfokalno mikroskopijo 48 ur po inokulaciji. Palice=25 um.

2.4. Utišanje CaWRKY30 s strani VIGS je zmanjšalo imunost Pepperja na RSI in označevalne gene, povezane z znižano imunostjo.

CaWRKY30 je bil utišan z virusom povzročenim utišanjem genov (VIGS), da bi preučili njegovo vlogo pri imunosti na poper. Pridobljenih je bilo skupno 50 CaWRKY30-neutišanih (TRV:00) in 50 CaWRKY30- utišanih (TRV: CaWRKY30) rastlin. Šest rastlin z utišanjem CaWRKY30 je bilo naključno izbranih, da bi preverili njihovo učinkovitost utišanja genov s koreninsko inokulacijo s celicami kompatibilnega virulentnega seva R. solanacearum. Naše ugotovitve so pokazale, da so se transkripcijske ravni CaWRKY30 zmanjšale za približno 30 odstotkov v utišanih rastlinah CaWRKY30, obdelanih z Ralstonia, v primerjavi z neutišanimi rastlinami, kar potrjuje utišanje CaWRKY30 (slika 4A).

Rastline z utišanjem CaWRKY30 so pokazale znatno večjo občutljivost za RSI v primerjavi z rastlinami brez utišanja. Občutljivost paprike za patogen se je povečala s povečanjem rasti populacije Ralstonia, ki je označena z višjimi vrednostmi cfu v rastlinah paprike, ki so bile utišane s CaWRKY30, v primerjavi z rastlinami, ki niso bile utišane, 3 dni in 5 dni po inokulaciji (dpi) (slika 4B). Histokemični test obarvanja je bil opravljen za odkrivanje proizvodnje H2O2 in nekroze celic v utišanih (TRV: CaWRKY30) in neutišanih (TRV:00) listih paprike, cepljenih z ralstonia CaWRKY30. Temno DAB obarvanje (znak proizvodnje H2O2) in HR podobno celično smrt, označeno s temno tripan modro obarvanjem, so opazili v neutišanih listih paprike pri 48 hpi (ure po inokulaciji). Nasprotno pa so se koncentracije tripan modrega in DAB obarvanja znatno zmanjšale v CaWRKY30 utišanih listih paprike (slika 4C). Električna prevodnost - indikator uhajanja ionov - je bila izračunana za preučevanje poškodb plazemske membrane in celične smrti po RSI.

Rezultati so pokazali, da so neutišane rastline, obdelane z RSI, pokazale večje uhajanje ionov kot rastline, obdelane z Ralstonia, utišane rastline CaWRKY30 pri 24 in 48 dpi (slika 4D). Relativni indeks bolezni je bil ocenjen do 10 dpi za sklepanje o stopnji bolezni v CaWRKY30-utišanih in neutišanih rastlinah po RSI (dodatna tabela S2). Izrazite simptome bolezni so opazili pri utišanih rastlinah CaWRKY30 pri 10 dpi, medtem ko so neutišane rastline izražale malo simptomov bolezni (slika 4E). Šest CaWRKY30-utišanih in neutišanih rastlin je bilo naključno izbranih in infiltriranih z R. solanacearum v korenine za analizo fenotipa. Očitne simptome bolezni venenja so opazili pri utišani papriki CaWRKY30 pri 10 dpi, medtem ko so neutišane rastline izražale zelo šibke simptome venenja (slika 4F). Analiza qRT-PCR je bila izvedena za preučevanje transkripcijske kopičenja z imunostjo povezanih markerskih genov in rezultati so pokazali, da so bile ravni transkripcijske ekspresije z imunostjo povezanih markerskih genov, kot so CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 in CaHIR1, zmanjšane v CaWRKY{{ 25}}utišane rastline v primerjavi z neutišanimi rastlinami pri 48 dpi (slika 4G).

Slika 4. Utišanje CaWRKY30 z VIGS je zmanjšalo odpornost paprike na RSI in povečalo označevalne gene, povezane z imunostjo. Preskus qRT-PCR ravni izražanja CaWRKY30 v rastlinah paprike, inokuliranih z R. solanacearum, lažno (inokuliranih z raztopino MgCl2) CaWRKY30-utišanih rastlin (TRV: CaWRKY30) in kontrolnih rastlin (TRV:00) (A). Razlika v rasti R. solanacearum med CaWRKY30-utišanimi in neutišanimi (kontrolnimi) rastlinami paprike, cepljenimi z R. solanacearum pri 3 in 5 dpi (B). Histokemično obarvanje (DAB in tripan modro) v CaWRKY30-utišanih (TRV: CaWRKY30) in neutišanih (TRV:00) listih paprike, cepljenih z R. solanacearum, pri 48 dpi. Lestvica=50 µm (C). Merjenje uhajanja elektrolita kot ionske prevodnosti za oceno odzivov na odmiranje celic v listnih ploščah CaWRKY30-utišanih (TRV: CaWRKY22) in neutišanih (TRV:00) rastlin paprike pri 24 in 48 hpi z in brez R. solanacearum (D). CaWRKY30-utišanje z VIGS je povečalo dovzetnost rastlin paprike za okužbo z R. solanacearum.

Indeks bolezni se je s časom bistveno povečal. CaWRKY30-utišane (TRV: CaWRKY30) rastline so s časom pokazale visoko dovzetnost za okužbo z R. solanacearum v primerjavi z neutišanimi (TRV:00). Povprečja temeljijo na štirih bioloških ponovitvah s petimi rastlinami na ponovitev (E). Fenotipski učinek tretiranja z R. solanacearum na CaWRKY30-utišane (TRV: CaWRKY30) in neutišane (TRV:00) rastline paprike pri 10 dpi (F). qRT-PCR test transkripcijskih ravni obrambno povezanih markerskih genov v CaWRKY30-utišanih (TRV: CaWRKY30) in neutišanih (TRV:00) rastlinah paprike 48 ur po inokulaciji z R. solanacearum (G). Relativna raven transkripcijske ekspresije lažno obdelanih neutišanih rastlin je bila nastavljena na "1". Višina stolpca označuje povprečja, stolpci napak pa standardno napako povprečij. Podatki predstavljajo povprečje ± SE iz štirih bioloških ponovitev. Različne črke nad črtami kažejo pomembne razlike med sredstvi.

For more information:1950477648nn@gmail.com