Povzetek:Poročali so, da imajo korenine Vitis amurensis potencial za beljenje kože z oceno melanogeneze in inhibitornih aktivnosti tirozinaze. V tej študiji so bile korenine V. amurensis uporabljene za hitro izbiro belilnih sestavin z uporabo LC-Q-TOF-MS skupaj z inhibitornim testom tirozinaze in za optimizacijo postopka ekstrakcije za uporabo kot funkcionalni material za beljenje kože z metodologijo odzivne površine. Rezultati so pokazali, da so korenine V. amurensis pokazale zaviralne učinke na tirozinazo z dvema oligomeroma stilbena, ε-vinifera (1) in vitaminom B (2), kot je napovedal LC-Q-TOF-MS skupaj z biološkim testom. Optimalni pogoji ekstrakcije (koncentracija metanola 66 odstotkov, prostornina topila 140 ml in čas ekstrakcije 100 minut) za sestavine za beljenje kože so bili vzpostavljeni z izkoristkom 6,20 odstotka, inhibitorna aktivnost tirozinaze pa je bila 87,27 odstotka. Razmerje med vsakim faktorjem in njegovim ustreznim odzivom je bilo potrjeno s Pearsonovo korelacijsko analizo. Volumen topila je pokazal jasno linearno povezavo z donosi, koncentracija metanola pa je imela močno linearno povezavo z inhibitorno aktivnostjo tirozinaze za spojini 1 in 2, kot tudi njuno kombinacijo. Na splošno se je izkazalo, da ima LC-Q-TOF-MS skupaj z biološkim testom potencial za učinkovito iskanje novih aktivnih sestavin, pa tudi znanih aktivnih sestavin; vitamine lahko predlagamo kot novo naravno potencialno belilno sredstvo.

Glede na ustrezne študije,cistancheje navadno zelišče, ki je znano kot »čudežno zelišče, ki podaljšuje življenje«. Njegova glavna sestavina jecistanozid, ki ima različne učinke kot nprantioksidant, protivnetno, inspodbujanje imunske funkcije. Mehanizem med cistančo inbeljenje koželeži v antioksidativnem učinku cistančeglikozidi. Melanin v človeški koži nastaja z oksidacijo tirozina, ki jo kataliziratirozinaza, oksidacijska reakcija pa zahteva sodelovanje kisika, zato radikali brez kisika v telesu postanejo pomemben dejavnik, ki vpliva na proizvodnjo melanina. Cistanche vsebujecistanozid, ki je antioksidant in lahko zmanjša nastajanje prostih radikalov v telesu ter tako zavira nastajanje melanina.

Kliknite na Cistanche Sald Near Me

Za več informacij:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ključne besede:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS skupaj z inhibitornim testom tirozinaze; metodologija odzivne površine; Pearsonova korelacija

1. Uvod

Melanin je odgovoren za barvo kože in dlake sesalcev in ščiti kožo pred ultravijoličnimi žarki, vendar prekomerna proizvodnja melanina in kopičenje melanina v koži povzročata hiperpigmentacijske kožne motnje, kot so pege, melazma, starostne pege, efelidi in senilni lentigini. Tirozinaza, znana kot encim oksidaza, ki vsebuje baker, ima ključno vlogo pri biosintezi melanina. Encim je kataliziral dve zaporedni oksidacijski reakciji: prvo stopnjo, hidroksilacijo L-tirozina v 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), in drugo stopnjo, oksidacijo L-DOPA v dopakinon. Dopakinon je zelo reaktivna snov, ki lahko spontano polimerizira in tvori melanin [1–3]. Zato se lahko zaviralci tirozinaze uporabljajo za zdravljenje kožnih motenj, povezanih s hiperpigmentacijo, in kot sredstva za beljenje kože.

Vitis amurensis, divje rastoča vrsta grozdja, je razširjena predvsem v Aziji (Koreja, Kitajska in Japonska). Popolnoma zrelo sadje uživamo surovo in vsebuje veliko hranilnih snovi, kot so saharoza, glukoza, beljakovine in vitamini, zato se uporablja kot surovina za vino, sok, želeje in marmelado. Poleg tega se njegovi listi uporabljajo v solati [4]. Njegove korenine in stebla se uporabljajo kot tradicionalno zdravilo za zdravljenje raka, nevralgičnih bolečin in bolečin v trebuhu [5,6]. Njegove korenine so sestavljene iz stilbenov (glavna sestavina), procianidinov, flavonoidov, triterpenoidov in drugih fenolnih spojin. Do sedaj je bila kemijska sestava korenine dovolj podrobno raziskana. Poročali so zlasti o različnih oligomerih stilbena, vključno z resveratrolom, amurenzinom A, vitaminom A, (plus)-ε-vinifero, amurenzini C–M, ampelopsinom A, D in ampelopsinom E [6]. Metanolni izvleček korenine kaže antimelanogeni učinek proti -melanocitno stimulirajočemu hormonu povzročeni melanogenezi v celicah B16F10 in pri oksidaciji 3,4-dihidroksifenilalanina (L-DOPA) prek gobje tirozinaze [7]. Poleg tega izvlečki V. amurensis in njihove aktivne spojine kažejo antioksidativne, protivnetne, nevroprotektivne in protitumorske učinke [7–10].

LC-MS v kombinaciji z biološkim testom lahko istočasno potrdi kemijski profil in biološko aktivnost sestavin v naravnih izdelkih brez potrebe po ekstrakciji in izolaciji. Zato se pred kratkim uporablja za učinkovito in hitro identifikacijo bioaktivnih spojin v naravnih izdelkih [11–13].

Optimizacija je proces, ki omogoča največjo učinkovitost eksperimentalnih sistemov ali izdelkov. Metodologija odzivne površine (RSM), multivariatna analiza, načrtovanje eksperimentov z uporabo matematičnih in statističnih tehnik, ki temeljijo na empiričnih modelih, ter izražanje korelacije med načrtom eksperimenta in rezultati kot polinomske funkcije so nekatere tehnike, ki zagotavljajo idealne pogoje optimizacije z največjo učinkovitostjo. RSM je natančna in učinkovita optimizacijska metoda, ki se pogosto uporablja na različnih področjih, vključno s predelavo hrane, kemijo, biologijo in kmetijstvom [14–16]. V zadnjih desetletjih se je povečalo zanimanje za farmacijo, kozmetiko in funkcionalna živila, ki vsebujejo naravne izdelke; posledično potekajo raziskave tako v akademskih krogih kot v industriji, katerih cilj je razvoj takšnih izdelkov [17,18]. Prvi korak v teh študijah vključuje ekstrakcijo bioaktivne sestavine iz naravnih proizvodov. Ker so v tem času na ekstrahirane sestavine vplivali številni dejavniki, kot so čas ekstrakcije, temperatura, razmerje med tekočino in trdno snovjo ter prostornina topila, je potrebna optimizacija za maksimalno ekstrakcijo bioaktivnih sestavin.

Kolikor nam je znano, so redko poročali o inhibitornih sestavinah tirozinaze in optimizaciji izvlečkov korenin V. amurensis [5,19]. Cilj te študije je bil torej hitra pridobitev inhibitorja tirozinaze iz korenin V. amurensis z uporabo LC-Q-TOF-MS skupaj s preskusom zaviranja tirozinaze in optimizacija pogojev ekstrakcije za razširitev uporabe korenin V. amurensis kot sredstva za beljenje kože avtor RSM.

2. Rezultati in razprava

2.1. LC-QTOF MS skupaj s testom zaviranja tirozinaze z uporabo izvlečka korenine V. amurensis

80-odstotni MeOH ekstrakt korenine V. amurensis je pokazal znatno inhibitorno aktivnost tirozinaze (80,7 ± 0,8 odstotka pri 50 µg/mL, tabela S1). Za identifikacijo spojin, ki zavirajo tirozinazo v korenu V. amurensis brez izolacije, je bil izveden LC-QTOF-MS skupaj s testom zaviranja tirozinaze. Kemični profil ekstrakta korenine V. amurensis je bil pridobljen v prvi vožnji (slika S1), bioaktivne spojine pa so bile identificirane s testom zaviranja tirozinaze frakcij, zbranih vsakih 30 s iz druge serije (slika 1). Med 19. in 22. minuto sta bila na masnem kromatogramu dva vrha, za katera je bilo predvideno, da imata znatno inhibitorno aktivnost tirozinaze, in s kemičnim profiliranjem (tabela 1) je bilo ugotovljeno, da sta njuni strukturi dimer stilbena (1) in tetramer stilbena (2).

2.2. Identifikacija sestavin korenine V. amurensis, ki zavirajo tirozinazo

Najprej smo iz frakcije EtOAc izolirali dve sestavini, za katere se pričakuje, da imata inhibitorno aktivnost na tirozinazo, in ovrednotili njuno bioaktivnost. Strukturi izoliranih spojin 1 in 2 sta bili identificirani kot ε-vinifera (1) [20,21] oziroma vitamin B (-vinifera, 2) [21–23] z uporabo 1H-NMR, 13C-NMR in ESI-MS (slika 2, sliki S2 in S3 ter tabela S2). V testu zaviranja tirozinaze so bile vrednosti IC50 spojin 1, 2 in kojične kisline 3,51, 10,74 oziroma 27,09 µM. Obe spojini sta pokazali večje zaviralne učinke na tirozinazo kot pozitivna kontrola, kojična kislina, ki je znana sestavina za beljenje kože (tabela 1 in slika S4). V prejšnjih študijah so poročali, da ima ε-vinifera (1) inhibitorno aktivnost tirozinaze [23]; vendar je bil vitamin B (2) prvič identificiran v naši študiji.

Na splošno rezultati v korelaciji s predvidenimi podatki LC-MS skupaj s testom zaviranja tirozinaze in vitaminom B (2) kažejo potencial kot nov zaviralec tirozinaze. Poleg tega so bile izvedene študije molekularnega priklopa, ki so podprle rezultat pomembne inhibitorne aktivnosti dveh stilbenskih oligomerov za tirozinazo. Kot je prikazano v tabeli 1, sta spojini 1 in 2 pokazali višji rezultat priklopa kot pozitivna kontrola, kojična kislina, kar je skladno z našimi eksperimentalnimi podatki. Vendar so bili rezultati priklopa spojin v nasprotju z našimi eksperimentalnimi rezultati. Načini interakcije spojin 1 in 2 so bili opisani na sliki 3. Spojina 1 je tvorila 4 vodikove vezi, 2 hidrofobni interakciji in 1 interakcijo pi-lonskega para, spojina 2 pa je tvorila 11 vodikovih vezi, 7 hidrofobnih interakcij, 1 van der Waalsovo interakcijo in 3 interakcije pi-lone parov. Posledično je bilo potrjeno, da se spojine lahko vstavijo v aktivno mesto ciljnega proteina in se vežejo na katalitične aminokislinske ostanke, ki lahko zavirajo aktivnost tirozinaze. Poleg tega je ε-vinifera (1) opisana kot konkurenčni zaviralec, ki se veže na isto mesto, kot se L-DOPA veže na tirozinazo [23]. Ugotovljeno je bilo, da se vitamin B (2) veže na isto mesto kot ε-vinifera (1), kar je potrdilo, da je vitamin B (2) nov konkurenčni inhibitor.

2.3. Optimizacija ekstrakcije korenin V. amurensis z uporabo RSM

Za uporabo korenin V. amurensis kot funkcionalnega materiala za beljenje kože je Box-Behnken design (BBD) zasnoval optimalne pogoje ekstrakcije, da bi povečali izkoristek ekstrakcije in inhibitorno aktivnost tirozinaze. Učinki neodvisnih odzivov, kot so izkoristek ekstrakcije, inhibitorna aktivnost tirozinaze, količina spojine 1, količina spojine 2 in količina vsote spojin 1 in 2, na tri neodvisne spremenljivke (čas ekstrakcije, koncentracija MeOH/voda in prostornina topila), so bile izmerjene (tabela 2). Razpon spremenljivk je bil nastavljen kot čas ekstrakcije (40, 70 in 100 min), koncentracija MeOH (40, 70 in 100 odstotkov) in prostornina topila ( 35, 87,5 in 140 ml) na podlagi predhodnega enofaktorskega eksperimenta (podatki niso prikazani). Vrednosti, dobljene iz zasnovanih eksperimentov, so bile izražene kot polinomi korelacije med spremenljivkami z uporabo regresijske analize (tabele S4–S13 in slika S5). Kot rezultat izvajanja individualne optimizacije za vsako reakcijo (tabela 3) naj bi izkoristek predstavljal 6,21 odstotka pri ekstrakciji z 100.00 min, MeOH 64,78 odstotka, 140.{{42} } mL. Zaviralna aktivnost tirozinaze (v odstotkih) je bila ekstrahirana s 65,22 min, MeOH 100.00 odstotkov, 140.00 mL pogojev, in predvideno je bilo, da bo pokazala vrednost 90,37 odstotka. Količina spojine 1 pri 65,74 min, MeOH 100.00 %, 35,00 ml je bila predvidena kot 37,45 µg/mg, količina spojine 2 pri 70,00 min, MeOH 70,00 % in 92,24 mL je bil predviden kot 86.77 µg/mg. Poleg tega naj bi skupne vsebnosti spojin 1 in 2 pokazale največjo vrednost 108,10 µg/mg pri ekstrakciji v pogojih 75,20 min, MeOH 100,00 % in 35,00 ml. Poskusi, ki temeljijo na optimiziranih pogojih, so dali 6,19 ± 0,36 odstotka, inhibitorno aktivnost tirozinaze 91,72 ± 3,48 odstotka, vsebnost spojine 1 36,54 ± 1,78 µg/mg, vsebnost spojine 2 85,74 ± 16,57 µg/mg in vsoto spojin 1 in {{85} }.10 ± 19,11 µg/mg in posamezni odzivi za vsako spremenljivko so pokazali razliko 5 odstotkov ali manj od teoretično predvidenih vrednosti. Optimizacija večkratnega odziva je bila izvedena, da bi povečali izkoristek ekstrakcije in inhibitorno aktivnost tirozinaze (tabela 3). Optimizirani pogoji so bili naslednji: čas ekstrakcije 100 min; koncentracija MeOH 66,38 odstotka; in prostornina topila 140 ml. Z uporabo teh pogojev je bilo ugotovljeno, da je izkoristek 5,95 ± 1,13 odstotka, inhibitorna aktivnost tirozinaze pa 85,93 ± 1,57 odstotka; te vrednosti so bile podobne predvidenim vrednostim, 6,20 oziroma 87,25 odstotka. Poleg tega je bila korelacija med vsako spremenljivko in ustreznim odzivom analizirana z uporabo Pearsonove korelacije (tabela 4). Izkoristek ekstrakcije je pokazal jasno linearno razmerje med časom ekstrakcije in koncentracijo MeOH ter negativno linearno razmerje s količino spojine 1. Poleg tega je inhibitorna aktivnost tirozinaze pokazala močno linearno razmerje med količino spojine 2 in količino vsote spojin 1 in 2 ter jasno linearno razmerje s spojino 1. Zato je bila inhibitorna aktivnost korenine V. amurensis na tirozinazo sorazmerna s spojinama 1 in 2, vendar je pokazala močnejšo linearno povezavo s količino spojine 2 kot spojine 1.

3. Materiali in metode

3.1. Splošni eksperimentalni postopki

Srednjetlačna tekočinska kromatografija (MPLC) je bila izvedena z uporabo Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Švedska). En sistem je opremljen s črpalko za bliskovno kromatografijo visoke ločljivosti (HPFC), spremenljivim detektorjem z dvojno valovno dolžino in zbiralnikom. NMR spektri so bili pridobljeni s spektrometrom Bruker SPECTROSPIN 300 MHz (Bruker Corporation, Billerica, MA, ZDA). Metanol-d4, NMR topilo, je bilo kupljeno pri Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Acetonitril (ACN), voda in metanol (MeOH) kromatografske kakovosti so bili kupljeni pri ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Republika Koreja). L-tirozin, gobja tirozinaza, kojična kislina in mravljinčna kislina so bili kupljeni pri Sigma–Aldrich Co (St. Louis, MO, ZDA).

3.2. Rastlinski material

Korenina V. amurensis je bila pridobljena iz Gyeongbuka v Koreji in tudi kupljena pri Omniherbu (Daegu, Republika Koreja). Identificiral jih je dr. prof. Ki Yong Lee s fakultete za farmacijo na korejski univerzi. Vzorec vavčerja (KUP-HD071) je bil deponiran v Laboratoriju za farmakognozijo Visoke šole za farmacijo Korejske univerze.

3.3. LC-Q-TOF masna spektrometrija

LC je bila izvedena s serijo Agilent 1260 (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA), ki je vsebovala binarno črpalko, spletni razplinjevalec, samodejni vzorčevalnik, termostatsko nadzorovan prostor za kolono in detektor niza fotodiod. Kromatografsko ločevanje smo izvedli s kolono Shiseido CapCell PAK C18 (5 µm, 4,6 mm, ID × 150 nm). Mobilna faza je bila sestavljena iz vode (topilo A) in ACN (topilo B), obe sta vsebovali 0.1 odstotka mravljinčne kisline. Pogoji gradienta so bili naslednji: 0–5 min, 10 odstotkov B, 5–30 minut in linearno povečanje B od 10 do 90 odstotkov. Hitrost kroženja je bila nastavljena na 0,6 ml/min; 5 µL in 20 µL vzorcev smo vbrizgali za analizo LC-Q-TOF-MS oziroma LC-Q-TOF-MS, povezano s testom zaviranja tirozinaze. Masno spektrometrijo smo izvedli z uporabo masnega spektrometra Agilent 6530 Q-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA) z vmesnikom za ionizacijo z elektrosprejem (ESI) v negativnem načinu. Podatki o masnem območju od m/z 50–1000 so bili zbrani v centroidnem načinu. Masni parametri so bili naslednji: kapilarna napetost 4000 V; tlak razpršilnika, 40 psi; napetost fragmenta, 175 V; napetost skimmera, 65 V; temperatura sušilnega plina, 325 ◦C; sorazmerni pretok sušilnega plina 12,0 L/min; energija trka 10, 20, 30 in 40 eV. Prilagoditev parametrov pridobivanja in obdelava podatkov sta bili izvedeni z uporabo LC-MS/MS Data Acquisition z uporabo serije 6530 Q-TOF (različica B.05.00) (programska oprema MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, CA, ZDA).

3.4. LC-Q-TOF-MS skupaj s testom zaviranja tirozinaze

LC-Q-TOF-MS skupaj s testom zaviranja tirozinaze je bil izveden z uporabo metode, določene v prejšnji študiji [24]. Na kratko, test je potekal v dveh serijah. V prvi seriji je bil kemijski profil vzorca pridobljen z uporabo LC-Q-TOF-MS. V naslednjem zagonu je bil eluat po prehodu skozi sistem LC pod navedenimi pogoji LC-Q-TOF zbran v 96-plošče z vdolbinicami vsakih 30 s. Inhibitorno aktivnost tirozinaze zbranih frakcij smo ovrednotili s testom zaviranja tirozinaze.

3.5. Izolacija spojin, ki zavirajo tirozinazo, iz korenine V. amurensis

Za izolacijo spojin, ki zavirajo tirozinazo, identificiranih z uporabo LC-Q-TOF-MS, skupaj s preskusom zaviranja tirozinaze, je bila korenina V. amurensis (3.01 kg) trikrat ekstrahirana z 80 odstotki MeOH 60 min pri sobni temperaturi z uporabo ultrazvoka. Ekstrahirano topilo smo filtrirali in koncentrirali, da smo dobili surovi ekstrakt (215,7 g), ki smo ga suspendirali v vodi in zaporedno porazdelili z n-heksanom, etil acetatom (EtOAc) in n-BuOH. Frakcijo EtOAc (25,85 g) smo podvrgli kolonski kromatografiji s silikagelom z uporabo n-heksana:EtOAc pod pogoji gradienta (20:1 → 0:1), da smo dobili sedem frakcij (E1–E7). Frakcijo E4 smo ločili z uporabo MPLC in 100 g SNAP KP-Sil, kartuše s silikagelom, in diklorometana: MeOH pod pogoji gradienta (97:3 → 0:100), da smo dobili sedem podfrakcij (E4–1 do E4–7) . Spojino 2 (417,0 mg) dobimo iz E4–5. Podfrakcijo E4–4 smo ponovno kromatografirali na MPLC z uporabo SNAP 25 g Ultra, vložka s silikagelom in kloroform:MeOH:H2O pod pogoji gradienta (50:4:1 → 15:4:1), da smo dobili sedem frakcij ( E4–4–1 do E4–4–7). Spojino 1 (396,0 mg) smo pridobili iz E4–4–5, ki smo jo opazili kot eno točko na plošči za tankoplastno kromatografijo (TLC).

3.6. Test zaviranja tirozinaze

Inhibitorno aktivnost tirozinaze so ovrednotili z uporabo predhodno opisane metode z rahlo modifikacijo [25]. Dva mikrolitra vzorca in 50 µL 0.1 U/µL gobove tirozinaze smo obdelali v 96-plošče z vdolbinicami in inkubirali pri 37 ◦C. Po 15 minutah smo dodali 50 µL 1 mM L-tirozina in nato reagirali pri 37 ◦C 15 minut. Količino nastalega dopakroma smo izmerili pri 495 nm z bralnikom mikroplošč Spectra Max 19{{20}} (Molecular Devices, San Jose, CA, ZDA). Inhibicijsko aktivnost tirozinaze smo izračunali z naslednjo enačbo: inhibicija tirozinaze ( odstotki )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, kjer je S absorbanca vzorca, tirozinaze in L -tirozin; S0 je absorbanca vzorca in L-tirozina; C je absorbanca tirozinaze in L-tirozina, C0 pa absorbanca L-tirozina. Kojična kislina, znani zaviralec tirozinaze, je bila uporabljena kot pozitivna kontrola. Vrednosti IC50 so bile izračunane z uporabo GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ZDA).

3.7. Molecular Docking Studies

Molekularno spajanje je bilo izvedeno z uporabo programske opreme SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, ZDA) s kristalnimi strukturami PPO3, tirozinaze iz Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Vse vodne molekule ciljnega proteina so bile odstranjene in priprava liganda je bila izvedena s protokolom priprave "sanitize" v SYBYL-X 2.1.1. Afiniteta protein-ligand je bila izračunana s poljem sile Tripos in izražena kot skupni rezultati. Zasidrana poza liganda iz kompleksa protein-ligand je bila vizualizirana v programu Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co., San Diego, CA, ZDA).

3.8. Načrt eksperimenta in statistična analiza

Optimiziran pogoj za ekstrakcijo sestavin z največjo inhibitorno aktivnostjo tirozinaze iz korenine V. amurensis je bil vzpostavljen z uporabo BBD s tremi spremenljivkami in tremi ravnmi (MINITAB Release 14.12.0 Statistical Software). Na podlagi preliminarnih rezultatov enofaktorskega eksperimenta so bile izbrane neodvisne spremenljivke, vključno s časom ekstrakcije (X1), koncentracijo MeOH in vode (X2) ter prostornino tekočine (X3), in vrsto njihovih spremenljivk (tabela S3). Spremenljivke za RSM so bile kodirane z uporabo treh ravni, −1, 0 in 1. Na splošno je bilo zasnovanih 15 poskusov, vključno s 3 ponovitvami v središču zasnove (tabela 2). Kot neodvisni odzivi so bili izmerjeni izkoristek (v odstotkih), inhibitorna aktivnost tirozinaze (v odstotkih), količina spojine (1) (µg/mg) in količina spojine (2) (µg/mg). Inhibicijsko aktivnost ekstrakta na tirozinazo so ocenili pri koncentraciji 50 µg/mL. Vsak odziv je izražen z naslednjo polinomsko enačbo drugega reda:

kjer R označuje odziv; 1, 2 in 3 so linearni koeficienti; 12, 23 in 13 so koeficienti interakcije med tremi spremenljivkami; in 11, 22 in 33 so kvadratni koeficienti.
Poleg tega je bila opravljena Pearsonova korelacijska analiza, da se ugotovi obstoj linearne povezave med vsako spremenljivko in odzivom. Pearsonov korelacijski koeficient ima močno linearno razmerje med {{0}}.7 in 1.0, jasno linearno razmerje med 0.3 in 0.7, šibko linearno razmerje med {{10}}.1 in 0.3 ter nič ali zanemarljivo linearno razmerje med 0.0 in 0.1. Pozitivna in negativna korelacija se izrazita glede na to, ali je Pearsonov korelacijski koeficient pozitiven ali negativen.

3.9. Kvantitativna analiza spojin 1 in 2, ki zavirajo tirozinazo

Količina vsake spojine 1 in 2 v ekstraktih, dobljenih z uporabo načrtovanih 15 eksperimentalnih pogojev, je bila izmerjena z uporabo umeritvenih krivulj (tabela 2). Umeritveni krivulji za spojini 1 in 2 sta bili določeni z uporabo površine pod UV-kromatogramsko krivuljo (330 nm, pridobljeno pri koncentracijah 0,1–1000 µg/mL oziroma 7,81–1000 µg/mL). LC je bila izvedena z uporabo sistema Waters 2695 LC (Waters, Santa Clara, CA, ZDA) z enakimi pogoji kot pri sistemu LC, ki je podrobno opisan v materialih in metodah, masna spektrometrija LC-Q-TOF.

4. Sklepi

ε-Viniferin (1) in vitamin B (2) korenin V. amurensis sta bila označena kot sestavini za beljenje kože z uporabo LC-Q-TOF-MS skupaj s testom zaviranja tirozinaze. Zlasti vitamin B (2) je bil v tej študiji prvič opredeljen kot spojina, ki zavira tirozinazo, ε-vinifera (1) in vitamin B (2) pa sta pokazala večje zaviralne učinke na tirozinazo kot pozitivna kontrola, kojična kislina. Pogoji optimizacije z največjim inhibitornim učinkom na tirozinazo in donosom korenin V. amurensis so bili določeni z uporabo časa ekstrakcije (100 min), koncentracije MeOH (66,38 odstotka) in volumna tekočine (140 ml). Rezultat je pokazal dobro ujemanje med eksperimentalnimi in predvidenimi vrednostmi. Posledično je LC-Q-TOF-MS skupaj z biološkim testom dokazal potencial za učinkovito iskanje novih aktivnih sestavin, pa tudi znanih aktivnih sestavin, vitamina B (2), ki se lahko predlaga kot novo naravno potencialno belilno sredstvo.

Dodatni materiali: Naslednje je na voljo na spletu, slika S1: MS kromatogram v načinu negativne ionizacije (A); UV-kromatogram pri 280 nm (B) ekstraktov korenin V. amurensis, Slika S2: 1H- in 13C-NMR spektra spojine 1 (300 in 75 MHz, CD3OD), Slika S3: 1H- in 13C-NMR spektra spojine 2 (300 in 75 MHz, CD3OD), slika S4: sigmoidni diagram in IC50 pozitivne kontrole, spojini 1 in 2, slika S5: krivulje odzivne površine in konture, ki prikazujejo učinek parametrov ekstrakcije (X1: čas ekstrakcije, min; X2: Koncentracija MeOH, %; X3: prostornina topila, mL). (A) donos; (B) inhibitorna aktivnost tirozinaze; (C) spojina 1; (D) spojina 2; (E) vsota spojin 1 in 2, tabela S1. Inhibicijska aktivnost izvlečkov korenin V. amurensis na tirozinazo, tabela S2: 1H- in 13C NMR podatki spojin 1 in 2 v CD3OD (δ v ppm), tabela S3: neodvisne spremenljivke in ravni za metodologijo odzivne površine, tabela S4: ocenjena regresija koeficient za izkoristek, tabela S5: Analiza variance za izkoristek, tabela S6: ocenjeni regresijski koeficient za inhibitorno aktivnost tirozinaze, tabela S7: analiza variance za inhibitorno aktivnost tirozinaze, tabela S8: ocenjeni regresijski koeficient za spojino 1, tabela S9: analiza varianca za spojino 1, tabela S10: Ocenjeni regresijski koeficient za spojino 2, tabela S11. Analiza variance za spojino 2, Tabela S12: Ocenjeni regresijski koeficient za vsoto spojin 1 in 2, Tabela S13: Analiza variance za vsoto spojin 1 in 2.
Avtorski prispevki: Konceptualizacija, KYL; metodologija, K.-EO, HS in KYL; programska oprema, K.-EO in HS; validacija, HS; formalna analiza, K.-EO in HS; preiskava, K.-EO, HS, MKL in KYL; urejanje podatkov, K.-EO, HS, BP in KYL; pisanje - priprava izvirnega osnutka, K.-EO in HS; pisanje—pregledovanje in urejanje, HS, MKL, BP in KYL; nadzor, MKL, BP in KYL. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.
Financiranje: To raziskavo je podprla nepovratna sredstva Nacionalne raziskovalne fundacije Koreje, ki jo financira korejska vlada (NRF-2017R1A2B4003403 in NRF-2019R1A6A1A03031807), in nepovratna sredstva Korejskega projekta raziskav in razvoja zdravstvene tehnologije prek Korejskega razvoja zdravstvene industrije Inštitut (KHIDI), ki ga financira Ministrstvo za zdravje in socialno skrbstvo Republike Koreje (HF20C0038).
Izjava o razpoložljivosti podatkov: Podatki, predstavljeni v tej študiji, so na voljo v dodatnem gradivu.
Nasprotja interesov:Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.
Razpoložljivost vzorcev: Ni na voljo

Reference

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-S triazolom povezani 5-benziliden (tio) barbiturati kot novi inhibitorji tirozinaze in lovilci prostih radikalov. Arh. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. Identifikacija 6, 7, 40 -trihidroksiizoflavona kot močnega zaviralca tirozinaze. Biosci. Biotehnologija. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Zaviralec tirozinaze iz črnih riževih otrobov. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Pesem, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Pregled kemije in farmakologije. Fitomedicina 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Betulinska kislina, izolirana iz korenine Vitis amurensis, zavira melanogenezo, ki jo povzroča 3-izobutil-1- metilksantin, preko regulacije poti MEK/ERK in PI3K/Akt v celicah B16F10. Food Chem. Toxicol. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Hung, ND; Bae, K. Antioksidantna in lipoksigenazna inhibitorna aktivnost oligostilbenov iz listov in stebla Vitis amurensis. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprechtove korenine, inhibirane -melanocitne stimulirajoče hormonske melanogeneze v celicah B16F10. Nutr. Res. Prakt. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, JZ; Park, JH Oligomeri resveratrola iz Vitis amurensis zmanjšajo oksidativni stres, ki ga povzroči amiloid, v celicah PC12. Biol. Pharm. Bik. 2007, 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Močna inhibicija rasti pljučnega raka Lewis s heksanolom A iz korenin Vitis amurensis z apoptotičnimi in anti-angiogenimi aktivnostmi. Rakotvorna snov 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Protivnetni učinek procianidinov iz semen divjega grozdja (Vitis amurensis) v celicah RAW 264.7, ki jih povzroča LPS. Oksid. Med. Celica. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Identifikacija antioksidativnih sestavin iz Polygonum aviculare z uporabo LC-MS skupaj s testom DPPH. Nat. Prod. Sci. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Karakterizacija inhibitornih sestavin proizvodnje NO iz Catalpa ovata z uporabo LC-MS skupaj s celičnim testom. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s povezano UV, masno spektrometrijo in biokemijsko detekcijo za identifikacijo inhibitorjev acetilholinesteraze iz naravnih proizvodov. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Metodologija odzivne površine (RSM) kot orodje za optimizacijo v analizni kemiji. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Čojnska, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Uporaba metodologije odzivnih površin in metod umetnih nevronskih mrež pri modeliranju in optimizaciji biosorpcijskega procesa. Bioresour. Technol. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Eksperimentalni načrt I. Pregled. Analitik trendov. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Sonce, Y.; Ši, L.; Xue, P. Optimizacija ultrazvočno podprte ekstrakcije z metodologijo odzivne površine, antioksidativno zmogljivostjo in inhibitorno aktivnostjo tirozinaze antocianinov iz rdečih riževih otrobov. Food Sci. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Sočasna optimizacija ekstrakcije fenolnih spojin s pomočjo mikrovalovne pečice in antioksidativne aktivnosti semen avokada (Persea americana Mill.) z uporabo metodologije odzivne površine. J. Anal. Metode Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Ločevanje petih oligostilbenov iz Vitis amurensis s protitočno kromatografijo visoke ločljivosti s sosednjim gradientom. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Protivnetni učinki resveratrola in oligostilbenov iz Vitis thunbergii var. taiwaniana proti artritisu, ki ga povzročajo lipopolisaharidi. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polifenoli, izolirani iz listov Vitis thunbergii var. Taiwaniana ureja pot, povezano z APP. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Novi oligostilbeni iz Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Izvlečki grozdnega trsa kot večnamenska pomlajevalna kozmetična sestavina: Vrednotenje aktivnosti sirtuina, inhibicije tirozinaze in potenciala biološke uporabnosti. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Oh, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Karakterizacija inhibitornih sestavin tirozinaze iz nadzemnih delov Humulus japonicus z uporabo LC-MS/MS povezanega spletnega testa. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Sinteza in biološka ocena derivatov resveratrola kot zaviralcev melanogeneze. Molekule 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501