siJezik
Dom / znanje / Vsebine

znanje

Himerni humani papiloma virus-16 Virusu podobni delci, ki predstavljajo peptide P18I10 in T20 iz HIV-1 ovojnice, inducirajo HPV16 in HIV-1-specifično humoralno imunost in imunost, posredovano s celicami T, pri miših BALB/c

Dec 07, 2023

Povzetek:

V tej študiji sta bila CTL peptid HIV-1 P18I10, pridobljen iz zanke V3 HIV-1 gp120, in T20 protifuzijski peptid HIV-1 gp41 vstavljena v kapsidno beljakovino L1 HPV16 za konstruiranje himernih VLP HPV: HIV (L1:P18I10 in L1:T20) z uporabo ekspresijskega sistema celic sesalcev. HPV: HIV VLP smo očistili s kromatografijo. Dokazali smo, da vstavljanje peptidov P18I10 ali T20 v zanko DE kapsidnih proteinov HPV16 L1 ni vplivalo na in vitro stabilnost, samosestavljanje in morfologijo himernih HPV: HIV VLP. Pomembno je, da ni vplival niti na reaktivnost protiteles HIV-1, ki ciljajo na zaporedne in konformacijske peptide P18I10 in T20, predstavljene na himernih HPV: HIV VLPs, niti na indukcijo HPV16 L1-specifičnih protiteles in vivo. Opazili smo, da lahko himerna cepiva L1:P18I10/L1:T20 VLP inducirajo HPV16-, vendar šibke HIV-1-specifične odzive protiteles in izzovejo HPV16- in HIV-1-specifične T- celičnih odzivov pri miših BALB/c. Poleg tega bi lahko bil potencialni spodbujevalec za povečanje za HIV specifičnih celičnih odzivov pri heterologni imunizaciji po prvem cepljenju s cepivom BCG.HIVA. To raziskovalno delo bi prispevalo korak k razvoju nove himerne platforme cepiva na osnovi HPV: HIV VLP za nadzor okužbe s HPV16 in HIV-1, ki je nujno potrebna v državah v razvoju in industrializiranih državah.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Ključne besede:

HIV-1; HPV16; cepivo; virusom podobni delci; P18I10; T20 enfuvirtid; BCG.HIVA; humoralna imunost; T-celično posredovana imunost

1. Uvod

Virus človeške imunske pomanjkljivosti -1 (HIV-1), ki povzroča sindrom pridobljene imunske pomanjkljivosti (AIDS), je bil odkrit v zgodnjih osemdesetih letih prejšnjega stoletja in od takrat je postal svetovna epidemija [1]. Čeprav lahko zelo aktivno protiretrovirusno zdravljenje (HAART) skupaj s profilakso pred izpostavitvijo (PrEP) resnično vpliva na nadzor okužbe s HIV-1, je cepljenje še vedno temeljni pristop v javno korist in za konec svetovne epidemije HIV-1 [2]. Kljub več kot trem desetletjem temeljitih raziskav HIV-1 in številnim kliničnim preskušanjem cepiva licenčno cepivo proti HIV-1 do zdaj še vedno ni mogoče doseči. Preskušanje RV144, izvedeno na Tajskem, je bilo prvi primer, ki je pokazal skromno učinkovitost 31,2 % proti okužbi z virusom HIV-1 [3]. Večina drugih kandidatov za cepivo proti virusu HIV-1, ki so bila podvržena kliničnim preskušanjem, je v glavnem temeljila na DNK, rekombinantnih virusnih vektorjih ali podenotnih proteinskih modelih [4,5]. V idealnem primeru je učinkovito cepivo proti HIV-1 sposobno inducirati prirojene imunske odzive, nevtralizirati protitelesa za preprečevanje virusne okužbe [6] ter odzive citotoksičnih limfocitov T (CTL) za odpravo okuženih celic [7]. Vendar pa lahko izzivanje vsakega odziva zahteva različne strategije cepiva, kar upravičuje ločena, a vzporedna razvojna prizadevanja. Izbira imunogenov in dostavnih vektorjev bo pomembno vplivala na delovanje in specifičnost cepiv proti HIV-1 [8,9]. Ponavljajoči se neuspehi pri uporabi standardnih pristopov za razvoj cepiva proti virusu HIV-1 so pripeljali do spoznanja pomena izbire dostavnih vektorjev, režimov glavnega pospeševanja in specifičnosti imunogena v humoralnem in celičnem odzivu. Poznamo že več kot 100 tipov humanega papiloma virusa (HPV), genotipa HPV 16 in 18 pa naj bi bila odgovorna za približno 70 % raka materničnega vratu po vsem svetu [10]. HPV L1 virusu podobni delci (VLP), razvrščeni kot vrsta podenotnih cepiv, lahko pretežno inducirajo primerljive L1- specifične humoralne odzive na virion divjega tipa in tudi odzive, ki jih posredujejo celice T [11–13]. Trenutno so na trgu dovoljena tri preventivna cepiva proti HPV in vsa temeljijo na VLP kapsidnega proteina HPV L1. Dva od njih, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, ZDA) in Gardasil-9 (Merck), proizvajata ekspresijski sistem kvasovk (Saccharomyces cerevisiae), medtem ko drugega, Cervarix (GSK, Brentford, Združeno kraljestvo), proizvaja s sistemom bakulovirusnega ekspresijskega vektorja/celice insektov (BEVS/IC) [14]. Do sedaj optimalni pogoji za proizvodnjo proteinov HPV16 L1 v ekspresijskem sistemu sesalcev niso bili dobro uveljavljeni. Zato je razvoj kombiniranega cepiva, ki bi ščitil pred okužbama s HPV in HIV, logično prizadevanje v boju proti tema dvema glavnima svetovnima patogenoma.

V naši prejšnji publikaciji preglednega dokumenta v zvezi s koncepti zasnove cepiv proti virusu HIV-1 na osnovi virusom podobnih delcev (VLP) smo omenili, da bi lahko VLP brez ovojnice, kot so VLP papiloma virusa, igrali funkcionalno vlogo kot vektorji za dostavo HIV-1 CTL ali epitopi nevtralizirajočih protiteles [15,16]. Ta hipoteza je bila potrjena pri več himernih govejih papiloma virusih (BPV) L1 VLP, ki predstavljajo epitop P18I10 CTL iz zanke V3 ovojnice proteina gp120 HIV-1 (Env) in epitop 2F5 ali regijo MPER gp41 HIV-1 Env [17–22]. Strukturne značilnosti kapsidnih proteinov L1 tipa -16 (HPV16) človeškega papiloma virusa so podobne tistim pri BPV in se lahko samosestavijo v enoslojne VLP L1 [23]. Pet proteinov HPV16 L1 tvori pentamer in 72 pentamerov se samosestavi v HPV16 VLP [24]. Vendar pa še vedno ni jasnih dokazov, da bi lahko bili himerni kapsidni proteini HPV16:HIV stabilni in vitro in se sami sestavili v morfološko integralne VLP. Po drugi strani pa se je izkazalo, da so HPV16 L1 VLP zelo imunogeni in so sposobni inducirati antigen specifične T in B-celične imunske odzive [11–13]. Še vedno je treba ugotoviti, ali bi lahko bila predstavitev epitopov HIV-1 prek HPV: HIV VLP imunogena. V tej študiji smo želeli razviti himerno cepivo HPV: HIV na osnovi VLP z uporabo človeških celic 293F, dobro uveljavljenega sistema izražanja celic sesalcev. Protein HPV 16 L1 je deloval kot strukturni ogrodje cepiva, peptida P18I10 in T20 pa sta bila izbrana kot imunogena HIV-1 in vstavljena v zanko DE proteina HPV 16 L1. Imunodominantni CTL epitop P18I10, ki obsega 10 aminokislin (ostanki 311–320: RGP GRAFVTI), izhaja iz tretje variabilne domene (V3) glikoproteina gp120 ovojnice HIV-1. Peptid P18I10 je bil identificiran kot H-2Dd-omejena molekula MHC razreda I za induciranje odzivov citotoksičnih limfocitov T (CTL) [25,26]. Peptid T20, znan kot enfuvirtid in zasnovan kot protiretrovirusni multimerični fuzijski peptid, je sestavljen iz zaporedja 36 aminokislin (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF), ki posnema zaporedje vijačnice C-terminalne heptade blizu membrane.0 s proksimalno zunanjo regijo (MPER) glikoproteina 41 ovojnice HIV-1 (gp41) [27]. Ta dva celična epitopa HIV-1 T (P18I10) in B (T20) sta bila izbrana kot izhodišče in dokaz koncepta eksperimenta za himerni HPV na osnovi VLP: platforma za razvoj cepiva proti HIV.

V zadnjem desetletju je bilo preizkušenih veliko različnih oblik cepiva proti HIV-1 na osnovi VLP [15]. Čeprav je bila večina prejšnjih strategij cepiva HIV-1 VLP [28] ali himernega BPV: HIV VLP [17–22] osredotočena na induciranje imunskih odzivov z uporabo homolognega režima začetnega pospeševanja, sta dve prejšnji študiji nakazali, da heterologna imunizacija sestavljen iz rekombinantnihMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG), ki izraža HIV-1 Gag prime in HIV-1 Gag VLP boost, lahko prispeva k izboljšanju T-celične imunosti [29,30]. V naši raziskovalni skupini smo dokazali pripravo z rBCG, ki izraža imunogen HIVA, in okrepitev z rekombinantnim virusnim vektorjem MVA. HiVA je bila varna in je pri miših BALB/c izzvala HIV-1-specifične imunske odzive T-celic [31–33]. Imunogen HIVA, ki ga je oblikoval dr. Tomas Hanke, je sestavljen iz proteina HIV-1 Gag polne dolžine v kombinaciji z več epitopi CTL, vključno z epitopi P18I10 na C-koncu [34]. Zato smo želeli oceniti, ali lahko BCG.HIVA okrepi imunske odzive T-celic, ki jih sprožijo virusi HIV: HPV (L1:P18I10) VLP pri miših BALB/c.

V tej študiji so bili himerni imunogeni HPV: HIV (L1:P18I10 in L1:T20) zasnovani in proizvedeni z uporabo ekspresijskega sistema 293F. Ekspresijo himernega proteina L1:P18I10 in L1:T20 smo potrdili z imunskim barvanjem. VLP HPV: HIV smo nato očistili s 3-stopenjsko kromatografsko metodo, vključno s kationsko (CEC), kromatografijo po velikosti (SEC) in afinitetno kromatografijo za heparin (H-AC). Nato so bili in vitro stabilnost, in vitro samosestavljanje in morfologija očiščenih HPV: HIV VLP potrjeni z nereducirajočim SDS-PAGE, testom molekulske mase oziroma transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM). Zaporedne in konformacijske peptide P18I10 in T20, predstavljene na himernih HPV: HIV VLP, smo dodatno okarakterizirali z anti-HIV-1 gp120 V3 in 2F5 monoklonskimi protitelesi in vitro z uporabo Western blota in indirektnega testa ELISA. Končno je bila imunogenost HPV: HIV VLP ocenjena v modelu miši BALB/c. Dokazali smo, da lahko himerna cepiva na osnovi L1:P18I10 in L1:T20 VLP inducirajo odzive specifičnih protiteles proti HPV16- in HIV-1-in himerni L1:P18I10 VLP lahko inducirajo HPV16- in HIV{ {37}}specifični T-celični odzivi pri miših BALB/c. Ker sta razvoj in proizvodnja imunogenega cepiva proti HPV: HIV še vedno nedosegljiva, je ta študija zagotovila osnovno strategijo, ki je morda vredna podpore globalnim prizadevanjem za razvoj novih himernih cepiv na osnovi VLP za nadzor okužb s HPV in HIV-1.

2. Materiali in metode

2.1. Izdelava seva cepiva BCG.HIVA2auxo.int

Rekombinantni imunogen HIVA, ki izraža BCG, je bil predhodno konstruiran z uporabo E.coli-mycobacterial integrative shuttle vektorja p2auxo.int. Konstrukcija E. coli/mikobakterijskega vektorja, ki izraža antigen HIVA, je bila prej opisana [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int smo razredčili v PBS-Tween20 na 2 × 107 cfu/ml, obdelali z ultrazvokom, da bi prekinili bakterijske grude, in cepili v zadnjo živilsko blazinico ali miši BALB/c (50 µL, 106 cfu/miš).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

2.2. Bakterijske kulture in transformacija

Celice glicinskega avksotrofnega seva E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, ZDA), ki ga je zagotovil dr. Pau Ferrer, smo gojili v minimalnem M9-izvedenem gojišču (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}},5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glukoza, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; tiamin, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , dopolnjen z glicinom (70 µg/mL). Celice E. coli M151Gly smo transformirali s plazmidi p2auxo.HIVA z elektroporacijo. Za to smo kulture E. coli gojili do optične gostote 0,9 pri 600 nm in jih transformirali z uporabo elektroporatorja genskega pulzerja Bio-Rad pri 2,5 kV, 25 µF in 200 Ω. Transformirane celice smo nato gojili na ploščah z agarjem M9-D (komponente, kot je opisano prej, z dodanim 1,5 % baktoagarja) brez dodatka glicina za selekcijo ali z dodatkom glicina kot kontrolo. Lizin avksotrofni sev BCG, BCG∆lys, ki so ga prijazno zagotovili WR Jacobs Jr., BR Bloom in T. Hsu, je bil transformiran s plazmidno DNA p2auxo.HIVAint z elektroporacijo. Mikobakterije smo gojili v gojišču Middlebrook 7H9 ali na gojišču Middlebrook agar 7H10, dopolnjenem z albumin-dekstrozo-katalazo (ADC; Difco), ki je vseboval 0,05 % Tween 80. L-lizin monohidroklorid (Sigma, Kawasaki, Japonska) smo raztopili v destilirani vodi in uporabljen kot dodatek v končni koncentraciji 40 µg/mL. Za transformacijo smo BCG gojili do optične gostote 1,5 pri 600 nm in transformirali z uporabo elektroporatorja genskega pulzerja Bio-Rad pri 2,5 kV, 25 µF in 1000 Ω. Transformante smo nato gojili na mediju Middlebrook agar 7H10, dopolnjenem z ADC, ki je vseboval 0,05 % Tween 80 brez dodatka lizina.

2.3. Celične linije in celične kulture

Celice 293F (Tibco), pridobljene iz celic človeških embrionalnih ledvic (HEK) 293, smo gojili v ekspresijskem mediju FreeStyle 293 (Tibco), dopolnjenem s 5 ml/L penicilin-streptomicina (Tibco), in inkubirali v inkubatorju pri 37 °C, ki je vseboval navlaženi atmosferi s 5 % CO2 na platformi orbitalnega stresalnika, ki se vrti s 125 obrati na minuto.

2.4. Proizvodnja proteinov L1:P18I10 in L1:T20 z uporabo ekspresijskega sistema 293F

Konstrukt pCDNA3.1 je vseboval L1:P18I10 ali L1:T20 DNA kodirne sekvence, ki ustrezajo himernim L1:P18I10 oziroma L1:T20 proteinom. HIV-1 P18I10 CTL peptid (RGPGRAFVTI) ali T20 peptid (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) je bil vstavljen v DE zanko kapsidnega proteina HPV16 L1. Sekvenca zanke HPV16 L1 DE, ki kodira 130–136 aminokislin, je bila nadomeščena s peptidom P18I10I10 ali T20. Kodirne sekvence DNA L1:P18I10 ali L1:T20 so bile modificirane s Kozakovim zaporedjem, optimizirane s človeškim kodonom, obdane z mesti restrikcijskih encimov HindIII in XbaI ter klonirane v vektor pcDNA3.1(+) z uporabo storitev genske sinteze GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA). Rekombinantno plazmidno DNA (pDNA) smo transformirali v kompetentne celice E. coli DH5 (Invitrogen) za pomnoževanje in ekstrahirali z uporabo plazmidnih kompletov Maxi (QIAGEN, Hilden, Nemčija). Celice 293F smo gojili s 30 ml ekspresijskega medija FreeStyle 293 v erlenmajerici s prostornino 125 ml (Corning, New York, NY, ZDA) do gostote 1,0 × 106/ml in začasno transfektirali z L1:P18I10 ali L1:T20 pDNA z uporabo razvejanih polietilenimina z MW 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) pri optimiziranem razmerju DNK proti PEI 1:3 (m/m) in DNK proti mediju kulture 1:1 (m/v), glede na po navodilih proizvajalca [35]. Celice 293F smo pobrali 96 ur po transfekciji. Celice 293F lahko dosežejo konfluentno gostoto 3,6 × 106 celic/ml s približno 50-odstotno sposobnostjo preživetja.

2.5. Imunofluorescenčno barvanje

Celice smo permeabilizirali na stekelcu s 100% hladnim acetonom. Nato so bile fiksne celice testirane s protitelesom proti HPV16 L1 CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) in zajete s protimišjim IgG-FITC (Sigma). Imunsko obarvane celične monosloje smo temeljito sprali s PBS in prekrili z montažnim medijem z DAPI (Abcam). Imunofluorescenčne slike smo pregledali pod invertnim mikroskopom pri 40-kratni povečavi. Učinkovitost transfekcije je bila določena z razmerjem med FITC (zeleno) pozitivnimi celicami in DAPI (modro) obarvanimi celicami.

2.6. Čiščenje HPV: HIV (L1:P18I10 in L1:T20) VLPs

Skupno 108 transficiranih celic 293F v 125 ml erlenmajerico (30 ml gojišča/bučka) smo zbrali s centrifugiranjem pri 1500 vrtljajih na minuto 5 minut in dvakrat sprali s PBS. Celične pelete smo resuspendirali v pufru za lizo, formuliranem z 1 % Triton X-100, zaviralcem proteaze (1:100) (Millipore) in benzonazo (25 U/mL) (Millipore). Celične lizate smo zbistrili z 0,45 µm PVDF brizgalnim filtrom (Millipore). Vzorci HPV: HIV (L1:P18I10 in L1:T20) VLP so bili serijsko prečiščeni z uporabo kationske izmenjave (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, ZDA), izključitve velikosti (Capto Core 700, GE) in afinitete (HiTrap Heparin HP , GE) kromatografijo. Kromatografski protokoli so bili opisani v naših prejšnjih študijah [36,37] in so sledili protokolu proizvajalca [38]. Signal proteina L1 v vsaki stopnji čiščenja je bil karakteriziran z Western blot analizo in testiran s protitelesom proti HPV16 L1 CAMVIR-1 [39].

2.7. Nereducirajoča SDS-PAGE

VLP-ji HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 so bili zmešani z 2 × Laemmlijevim vzorčnim pufrom (BIO-RAD) v odsotnosti ali prisotnosti 5 % (v/v) 2-merkaptoetanola ({{11} }ME) in reagirala pri sobni temperaturi (RT) 24 ur. Vzorci so bili ločeni z 8–16 % proteinskimi geli brez madežev TGX (BIO-RAD). Nato smo gele prenesli na PVDF membrane. Membrane so bile testirane z anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v razredčitvi 1:4000. Po tem smo membrane inkubirali s konjugatom anti-mišje IgG peroksidaze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v razredčitvi 1:4000. Signal je bil razvit in vizualiziran s kemiluminiscenco z uporabo substratnega kompleta Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Slike madežev so bile pridobljene z uporabo slikovnega sistema Odyssey Fc.

2.8. Analiza molekulske mase

HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 VLP-ji brez 2-ME obdelave so bili odfiltrirani skozi naprave za ultrafiltracijo z omejitvijo molekulske mase 1000 kDa (MWCO) (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 VLP z 2-ME obdelavo so prepustili 100 kDa MWCO ultrafiltracijske naprave (Amicon). Retentate smo rekonstituirali do prvotne prostornine in zbrali iz rezervoarja za vzorec filtrirne naprave, medtem ko smo filtrate zbrali na dnu centrifugalne epruvete. Signal L1 smo izmerili z uporabo pikčastega blota, testiranega z anti-HPV16 L1 mAb in odkritega s konjugatom anti-mišjega IgG-peroksidaze (Sigma-Aldrich). Slike so bile pridobljene z uporabo Odyssey Fc Imaging System na kemiluminiscenčnem kanalu.

Desert ginseng-Improve immunity

Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem

2.9. Negativno barvanje in transmisijska elektronska mikroskopija

Po 5-minutnem polnjenju z ogljikom prevlečenih bakrenih mrež (Sigma-Aldrich) pod ultravijolično svetlobo so bili komercialni HPV16 L1 (Abcam), prečiščeni VLP L1:P18I10 in L1:T20 uravnoteženi z 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl). ) smo 1 minuto absorbirali na rešetke in trikrat splaknili z vodo miliQ. VLP HPV: HIV so bile 1 minuto negativno obarvane z 2 % uranil acetatom pri pH 4,5 (Sigma-Aldrich). Odvečna sredstva za obarvanje smo odstranili s kvalitativnim filtrirnim papirjem Whatman (Sigma-Aldrich). Mreže so bile postavljene v razvlaževalno komoro vsaj 2 uri pred opazovanjem. Slike so bile pridobljene s transmisijskim elektronskim mikroskopom (Tecnai Spirit 120 kV) pri povečavi SA135K (100 nm) oziroma SA59000 (200 nm).

2.10. Elektroforeza z natrijevim dodecil sulfatom in poliakrilamidnim gelom ter Western blotting analiza

Enake količine (500 ng) proteina L1 HPV16 (Abcam), prečiščenih VLP L1:P18I10 in L1:T20 smo zmešali z 2 × Laemmlijevim vzorčnim pufrom, ki je vseboval 5 % 2-ME, in kuhali pri 95 ◦C 5 minut . Vzorci so bili ločeni z 8–16 % TGX Stain-free proteinskimi geli in nato preneseni na PVDF membrano (Millipore, Burlington, MA, ZDA) z uporabo Semi-Dry transfer naprave (Bio-Rad). Membrana je bila blokirana s 5% posnetim mlekom v TBST. Nato so bile membrane testirane z anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v razredčitvi 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) v razredčitvi 1: 40 in HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) v razredčitvi 1:4000. Po tem smo membrane inkubirali s konjugatom peroksidaze proti mišjim IgG (Sigma-Aldrich) v razredčitvi 1:4000. Za razvoj signala je bil uporabljen Western ECL substrat kit (BIO-RAD). Blot slike so bile pridobljene z uporabo slikovnega sistema Odyssey Fc na kemiluminiscenčnem kanalu.

2.11. Imunizacija miši, zbiranje serumov in izolacija splenocitov

To je predhodna študija za dokazovanje koncepta, ki dokazuje imunogenost HPV: VLP virusa HIV (VLP L1:P18I10 in L1:T20). Odmerek, način dajanja in interval začetnega pospeševanja naših HPV: HIV VLPs se je nanašal na prejšnje študije, ki so imunizirale miši z govejim papiloma virusom (BPV): HIV VLPs za induciranje odzivov protiteles [20, 21]. Prečiščen HPV: VLP virusa HIV smo emulgirali z enakim volumnom (225 µg na vsak odmerek 0,5 ml) aluminijevega hidroksifosfat sulfata (Thermo Fisher), da bi zagotovili podobno formulacijo licenčnega cepiva proti HPV Gardasil-9 [40]. Vse skupine miši so imele enako porazdelitev po spolu (moški n=4 in samice n=4 na skupino). V skupinah A in B so bile miši BALB/c imunizirane intramuskularno (im) z 10 µg L1:P18I10 oziroma L1:T20 VLPs po homolognem režimu začetnega pospeševanja. V skupini C so miši cepili s 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int intradermalno (id, na živilski blazinici) in jih okrepili z 10 µg L1:P18I10 VLP intramuskularno. V skupini D so bile miši s pozitivno kontrolo cepljene z zdravilom Gardasil- 9 prime, ki mu je sledilo intramuskularno okrepljeno zdravljenje z cepivo Gardasil-9 z 10 µg HPV16 L1 VLP. V skupini E so bile miši negativne kontrole dvakrat imunizirane s pufrom PBS. Interval med prvimi okrepitvami je bil 2 tedna. Miši smo žrtvovali 28. dan. Vzorce krvi smo zbrali iz src miši. Serume smo pridobili s centrifugiranjem in shranili pri –20 ◦C za test ELISA. Mišje vranice so bile odstranjene in posamično stisnjene skozi celično cedilo (Falcon) s 5 ml gumijastim batom brizge. Po odstranitvi rdečih krvnih celic z pufrom za lizo ACK (Lonza) smo splenocite sprali in resuspendirali v mediju za limfocite R10 (RPMI 1640, dopolnjen z 10 % fetalnega telečjega seruma (FCS), penicilin-streptomicin, 20 mM HEPES in 15 mM {{ 46}}ME) pri koncentraciji 2 × 107 celic/mL.

2.12. Encimsko vezan imunosorbentni test

Za testiranje HPV16 L1- in HIV-1-specifičnih protiteles, ki se vežejo na himerni HPV: konstrukti HIV VLP in vitro, 50 µL enake koncentracije (200 ng/mL) rekombinantnega proteina HPV16 L1 (Abcam, ab119880 ), prečiščene L1:P18I10 in L1:T20 VLP v 50 mM karbonatnem bikarbonatnem pufru (pH=9.6) (Sigma) so bile 2-krat serijsko razredčene in prevlečene na plošče Maxisorb (Nunc). Plošče smo inkubirali pri 4 ◦C čez noč. Plošče smo blokirali z blokirnim pufrom (5 % posnetega mleka v TBST) pri 37 ◦C vsaj 2 uri. Po dvakratnem izpiranju s TBST smo plošče, prevlečene z VLP, inkubirali z anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v razredčitvi 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) v razredčitvi 1:8000 in anti- HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) v razredčitvi 1:40 v blokirnem pufru pri 37 ◦C 2 uri. Po trikratnem izpiranju s TBST smo plošče 1 uro inkubirali z rekombinantnim konjugatom protein G peroksidaze (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) pri razredčitvi 1:4000 v blokirnem pufru pri 37 °C. TMB je bil uporabljen za razvoj signala encimsko vezanega imunskega testa (ELISA) in ustavljen s 50 µL 2M H2SO4. Optično gostoto (OD) vsake vdolbinice smo izmerili in zabeležili pri valovni dolžini 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč EL × 800 absorbance.

Za merjenje z VLP induciranih protiteles pri miših BALB/c so bile mikrotitrske plošče prevlečene s 50 µL 2 µg/mL rekombinantnega HPV16 L1 proteina (Abcam, ab119880), peptida HIV-1 P18I10 (NIBSC, ARP734), peptid T20 (NIBSC, ARP984) s 50 mM karbonatno-bikarbonatnim pufrom (pH=9.6). Plošče smo inkubirali pri 4 ◦C čez noč. Plošče smo blokirali z blokirnim pufrom (5 % posnetega mleka v TBST) pri 37 ◦C vsaj 2 uri. Istočasno smo serume, zbrane iz skupine AE imuniziranih miši, razredčili s 5 % posnetim mlekom v TBST v razmerju 1:50. Po dvakratnem izpiranju s TBST smo plošče 2 uri inkubirali z razredčenimi serumi pri 37 °C. Po trikratnem izpiranju s TBST smo ploščam dodali konjugat rekombinantnega proteina G HRP v razredčitvi 1:4000 v pufru za blokiranje in inkubirali pri 37 °C 1 uro. TMB je bil uporabljen za razvoj signala ELISA in ustavljen s 50 µL 2M H2SO4. OD vsake vdolbinice smo izmerili pri valovni dolžini 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč EL × 800 absorbance (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot test

Preizkus encimsko vezanega imunskega vpojnega mesta (ELISpot) je bil izveden z uporabo komercialnega kompleta mišjega IFN-ELISpot (Mabtech, Nacka Strand, Švedska) v skladu z navodili proizvajalca. Plošče ELISpot (MSISP4510, 96-plošče z jamicami s poliviniliden difluoridnimi membranami, Millipore, Middlesex County, MA, ZDA) so bile obdelane s 70 % EtOH in prevlečene s prečiščenim monoklonskim protitelesom za zajem mišjega interferona (IFN-), razredčenim v fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) do končne koncentracije 5 µg/mL pri 4 ◦C čez noč. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 2,5 × 105 svežih splenocitov. Nato smo celice iz skupin A in B stimulirali z 2 µg/mL HPV16 L1 VLPs oziroma HIV-1 P18I10 peptidov. Vse vzorce in kontrole smo nasadili v podvojene vdolbinice. Teste ELISpot smo inkubirali 16 ur pri 37 ◦C, 5 % CO2. Plošče so bile nato 5x sprane s PBS, inkubirane 2 uri z biotiniliranim anti-IFN-monoklonskim protitelesom (mAb), razredčenim v PBS 2 % fetalnega telečjega seruma (FCS) do končne koncentracije 2 µg/mL, sprane 5-krat v PBS in inkubirali s konjugatom streptavidin-alkalna fosfataza v PBS 2 % FCS. Nato smo plošče 5-krat sprali s PBS, preden smo jih inkubirali s 100 µL raztopine substrata 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfata (BCIP)/nitro modrega tetrazolija (NBT) (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, ZDA). Po 5–10 minutah smo plošče sprali z vodo iz pipe, posušili in nastale lise prešteli z bralnikom ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Nemčija). Za vsako žival smo povprečje odzivov ozadja odšteli posamezno iz vseh vdolbinic, da smo omogočili primerjavo celic, ki tvorijo mesto IFN (SFC)/106 med skupinami. Za opredelitev pozitivnih odzivov je bil prag opredeljen kot najmanj pet točk na vdolbinico in odzivi, ki presegajo povprečno število točk v vdolbinicah negativne kontrole plus tri standardne deviacije vdolbinic negativne kontrole.

2.14. Statistična analiza

Vse statistične analize so bile izvedene s programsko opremo Prism 6 GraphPad (CA, ZDA). Uporabili smo podatke iz poskusov, izvedenih v 5 različnih koncentracijah prevleke plošče ELISA (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) rekombinantnega proteina HPV16 L1 (Abcam, ab119880) in HPV: HIV VLP. Zbrali smo podatke iz dveh skupin (HPV16 L1 in HPV: HIV VLP) in zbrali tri ponovitve za vsako koncentracijo prevleke. Graf v Prismu je prikazoval podatke kot raztreseni grafikon, ki prikazuje koncentracijo prevleke (ng/mL) na osi X in OD450 na osi Y. Ker smo domnevali, da so naši in vitro podatki ELISA povezani v linearnem vzorcu, smo izvedli linearno regresijsko analizo in primerjali naklona obeh črt, da bi potrdili nabor podatkov-1 in nabor podatkov-2 (protitelesa reaktivnost med HPV16 L1 in HPV: VLP virusi HIV) se razlikujejo po svojem delovanju. Izbrali smo 95-odstotne intervale zaupanja poleg najprimernejše linije. Prism je samodejno prekril črto linearne regresije na obeh naših nizih podatkov in narisal črtkano črto, ki predstavlja 95-odstotne intervale zaupanja. Med linearno regresijsko analizo je programska oprema izračunala samo povprečno vrednost Y našega nabora podatkov, ki je pokazala dobro prileganje. Poleg tega nam je Prism dal komentar, tako da lahko sklepamo, da so razlike med obema naklonoma izjemno velike.

Imeli smo 5 nizov (ELISA) in 4 nize (ELISPOT) podatkov, zbranih iz poskusov imunizacije miši. Ti nizi podatkov so imeli enako število (moški n=4 in ženske n=4) v vsaki skupini. Kot pozitivno kontrolno skupino smo uporabili -9-miši, imunizirane s Gardasilom, kot negativno kontrolno skupino pa miši, imunizirane s PBS. Podatki naših zasnovanih poskusov se niso ujemali ali seznanjali. Izvedli smo enosmerno analizo variance (ANOVA), da bi ugotovili, ali so te srednje vrednosti različne. Najprej smo preverili, ali naši podatki ustrezajo Gaussovi normalni porazdelitvi. Ugotovili smo, da nekatere skupine podatkov v testu ELISA niso prestale testa normalne Gaussove porazdelitve. Zato smo izvedli neparametrično statistično analizo teh podatkov. Nasprotno pa so vse skupine podatkov v testu ELISPOT mimo testa Gaussove normalne porazdelitve. Tako smo izvedli parametrično statistično analizo teh podatkov. Prag pomembnosti in stopnja zaupanja sta bila nastavljena na 0.05 (enakovredno 95-odstotnemu intervalu zaupanja). p vrednost, ki na splošno kaže verjetnost, da obstajajo razlike med skupinami. Ker je naša glavna skrb pri tem poskusu, kakšne so razlike med našimi skupinami, so nam večkratne primerjave v Prismi dale rezultat primerjave v vseh skupinah z vsako drugo skupino.

2.15. Etične izjave

Šest do osem tednov stare miši BALB/c so bile kupljene pri Envigu (podjetje Inotiv, Chicago, IL, ZDA) in odobrene s strani lokalnih oblasti (Generalitat de Catalunya, številka projekta 11157) in Odbora za etiko Universitat Autònoma de Barcelona. Poskusi na živalih so bili strogo v skladu z zakonodajo o dobrem počutju živali Generalitat de Catalunya. Vse poskuse je odobril lokalni odbor za raziskovalno etiko (postopek 43.19, bolnišnica de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Rezultati

3.1. Zasnova imunogenov L1:P18I10 in L1:T20 ter ovrednotenje ekspresije HPV: proteina HIV z uporabo ekspresijskega sistema 293F

Peptid P18I10 iz zanke tretje variabilne domene HIV-1 Env (V3) in peptid T20 iz proksimalne zunanje regije (MPER) membrane HIV-1 Env sta bila vstavljena v protein zanke HPV16 L1 DE, da se ustvari himerni L1 : P18I10 in L1: T20 imunogeni. Himerne kodirne sekvence DNA L1:P18I10 in L1:T20 smo klonirali v ekspresijski vektor plazmidne DNA pcDNA3.1 (+) za prehodno transfekcijo v celicah 293F (slika 1A). Monomerne strukture HPV16 L1, himernih L1:P18I10 in L1:T20 kapsidnih proteinov so bile predhodno predvidene z uporabo strežnika SWISS-modela (slika 1B). Glavni kapsidni protein L1 HPV16 (7cn2.1.R) je bil izbran kot strukturna predloga za izdelavo modeliranja homologije kapsidnega proteina HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20. V primerjavi s konformacijo vezanega peptida P18I10 v prejšnji študiji [41] smer glavne verige N do C konca peptida P18I10 na našem himernem proteinu L1:P18I10 poteka od desne proti levi (slika 1B, srednja in zgornja plošča), in izpostavljene stranske verige P18I10 bi lahko potencialno vplivale na receptorje celic T (slika 1B, srednja in spodnja plošča). V primerjavi s strukturo peptida zaviralca fuzije HIV-1 v prejšnjem preglednem dokumentu [42] je vstavljeni peptid T20 na kapsidni protein HPV16 L1 predstavljen kot vijačnici podobna tvorba (slika 1B, desni in zgornji del). ), izpostavljene stranske verige T20 pa bi potencialno lahko prepoznali receptorji celic B (slika 1B, desna in spodnja plošča). Ker se lahko kapsidni proteini HPV16 L1 homogeno sestavijo v ikozaedrični delec T=7 z 72 pentamernimi kapsomeri [43], je prikaz peptidov P18I10 ali T20 z visoko gostoto na zunanji površini himernega HPV: HIV VLP potencialno zelo imunostimulativen za induciranje za epitope specifičnih imunskih odzivov.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


Slika 1. Zasnova imunogena L1:P18I10 in L1:T20 in konstrukcija himernih HPV:VLP virusov HIV z uporabo ekspresijskega sistema 293F. (A) Himerne L1:P18I10 in L1:T20 kodirne sekvence DNA so bile klonirane v ekspresijske vektorje pcDNA3.1+ za prehodno transfekcijo v celicah 293F. (B) Napoved monomernih struktur HPV16 L1 in himernega HPV: kapsidni proteini HIV z uporabo strežnika SWISS-modela. HPV16 glavni kapsidni protein L1 (7cn2.1.R) je bil izbran kot strukturna predloga za izdelavo modeliranja homologije kapsidnega proteina HPV16 L1 (leva plošča), L1:P18I10 (srednja plošča) in L1:T20 (desna plošča). Sekundarni strukturni elementi kapsidnega proteina HPV16 L1 so označeni s črkami h1–h5 za 5 -vijačnice. Zanke kapsidnega proteina HPV16 L1 med verigami so označene z BC, CD, DE, EF, FG in HI. Sekundarni strukturni elementi HIV-1 P18I10 in T20 peptidov L1 so označeni s puščicami (zgornja plošča). Del peptida P18I10 in T20, ki štrli nad površino kapsidnega proteina HPV16 L1, je označen s puščicami (spodnja plošča). (C) Imunofluorescenčno barvanje proteina L1 v celicah 293F. Naslednje pDNA.L1:P18I10 (levo), pDNA.L1:T20 (na sredini) in pDNA.brez vstavitve (desno) so bile transfektirane v celice 293F. Transfektirane celice so bile testirane z anti-HPV16 L1 mAb in odkrite z anti-mišjim IgG-FITC (zelen kanal). Celična jedra so bila obarvana z DAPI (modri kanal). Imunofluorescenčne slike so bile združene z uporabo programa Adobe Photoshop

Ker terminalna sekvenca proteina C HPV16 L1 posreduje celični stroj za uvoz jedra med okužbo [44], so bili signali jedrne lokalizacije (NLS) proteina HPV16 L1 identificirani v prejšnjih študijah [45]. Monoklonsko protitelo CAMVIR-1 je bilo izbrano za prepoznavanje epitopa L1 HPV16 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], barvilo FITC na osnovi fluoresceina pa je bilo uporabljeno kot reporter za spremljanje izražanja L1:P18I10 in L1: T20 beljakovine. Imunofluo rpresence slike so jasno pokazale, da je bil HPV16 L1 (zeleno) večinoma lokaliziran v jedrih (modro) celic 293F. V celicah 293F, transektiranih s kontrolnim plazmidom (plazmid pcDNA3.1 brez vstavka), niso opazili signala L1 (slika 1C). Rezultati so pokazali, da bi se tako himerni kapsidni proteini L1:P18I10 in L1:T20 lahko izrazili z uporabo transfekcije, posredovane s polietileniminom (PEI), in jih prepoznalo monoklonsko protitelo HPV16 L1 CAMVIR-1.

3.2. Čiščenje VLP L1:P18I10 in L1:T20 z uporabo kromatografskih metod

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa in heterologni spodnji pas<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


Slika 2. Čiščenje in karakterizacija L1:P18I10 in L1:T20 VLP. (A) Shematski diagram poteka postopka čiščenja L1:P18I10 in L1:T20 VLP s kromatografijo. (B, C) Western blot analiza vzorcev L1:P18I10 in L1:T20 VLP iz vsake stopnje čiščenja. Signal L1 v vsaki stopnji čiščenja je bil karakteriziran z Western blot analizo, testirano z anti-HPV16 L1 mAb. Puščica označuje molekulsko maso ~56 kDa L1:P18I10 in ~58 kDa L1:T20 proteinov. Proga 1: očiščen celični lizat (CCL); Proga 2: pretok (FT) iz nalaganja vzorca s kationsko izmenjevalno kromatografijo (CEC); Proga 3: eluat CEC; Proga 4: FT iz stopnje regeneracije CEC 2M NaCl; Proga 5: izključitvena kromatografija (SEC) FT-1; Proga 6: SEC FT-2; Proga 7: FT iz nalaganja vzorca s heparinsko afinitetno kromatografijo (H-AC); Proga 8: H-AC eluat; Proga 9: FT iz koraka regeneracije H-AC 2M NaCl; Proga 10: 10-kratna diafiltracija.

3.3. Stabilnost in vitro in samosestavljanje L1:P18I10 in L1:T20 VLP

Da bi potrdili, da so prečiščeni HPV:HIV VLP-ji pokazali podobno in vitro stabilnost kot HPV16 L1 VLP-ji, smo izvedli neredukcijsko SDS-PAGE za oceno disulfidnega navzkrižnega povezovanja HPV:HIV kapsidnih proteinov (slika 3A). Znano je, da pH, ionska moč, temperatura [52] in redoks okolje korelirajo z disulfidnimi vezmi kapsidnih proteinov HPV16 L1 [53]. VLP HPV L1 se pri nizkem pH in visoki ionski moči nagibajo k samosestavitvi. Največja razgradnja VLP običajno zahteva relativno dolgotrajno izpostavljenost visoki koncentraciji reducenta, kot je 5 % 2-merkaptoetanol (2-ME) [54]. V odsotnosti redukcijskih sredstev 2-ME je le majhen del HPV-16 proteina L1, L1:P18I10 in L1:T20 prešel v monomere z navidezno molekulsko maso (MW) 55 kDa . Približno 70 % proteinov L1 je bilo disulfidno vezanih v večje dimere ali pentamere, s predvideno MW 110 kDa in 280 kDa (slika 3A, proge 2, 4 in 6). Nasprotno pa so se skoraj vsi proteini HPV-16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 v pufru za razstavljanje pojavili kot monomerne strukture v neredukcijski SDS-PAGE (slika 3A, pas 3, 5 in 7). Ti rezultati so pokazali, da in vitro stabilnost prečiščenih L1:P18I10 in L1:T20 VLP predstavlja podobne vzorce disulfidnega navzkrižnega povezovanja kot HPV16 L1 VLP pri enakem pH, ionski moči in termičnih pogojih. Zdi se, da se prečiščeni VLP po dolgotrajni izpostavljenosti visokim koncentracijam reducentov razgradijo na raven pentamerov, trimerjev in dimerjev. Ti podatki so v skladu s prejšnjimi študijami [53, 54]. Vendar razstavljanje HPV: HIV VLP še zdaleč ni bilo dokončano (monomeri).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


Slika 3. In vitro stabilnost L1:P18I10 in L1:T20 VLP. (A) Disulfidno navzkrižno povezovanje L1: P18I10 in L1: T20 VLP v nereducirajoči SDS-PAGE. VLP HPV16 L1, prečiščene VLP L1:P18I10 in L1:T20 smo zmešali z vzorčnim pufrom Laemmli v odsotnosti ali prisotnosti 2-merkaptoetanola (2-ME) in analizirali z neredukcijsko SDS-STRAN. Položaj monomera L1 (55 kDa), dimera L1 (110 kDa) in pentamera L1 (280 kDa) je označen s puščico. Proga 1: marker molekulske mase beljakovin; Proga 2: HPV16 L1 VLP; Proga 3: HPV16 L1 VLP, zdravljena z 2-ME; Proga 4: L1:P18I10 VLP; Proga 5: L1: P18I10 VLP, zdravljena z 2-ME; Proga 6: L1:T20 VLP; Proga 7: L1:T20 VLP, zdravljena z 2-ME. (B) Analiza molekulske mase L1:P18I10 in L1:T20 VLP. Sestavljene VLP-je, neobdelane z 2-ME (proge 2, 4 in 6), so bile odfiltrirane skozi naprave za diafiltracijo z omejitvijo molekulske mase 1000 kDa (MWCO) (zgornja plošča). Razstavljeni VLP-ji, obdelani z 2-ME (proge 3, 5 in 7), so bili odfiltrirani skozi centrifugalne filtrirne naprave 100 kDa MWCO (spodnja plošča). Retentate (R) smo zbrali iz rezervoarjev za vzorce filtrirne naprave, medtem ko smo filtrate (F) zbrali na dnu centrifugalnih epruvet. Signal proteina L1 je bil odkrit z uporabo pikčastega blota, testiranega z anti-HPV16 L1 mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) in so bili ohranjeni v retentatih. Vzorec je sovpadal s podatki, ki so jih opazili pri nereducirni SDS-PAGE. Čeprav so bile vse skupine VLP, zdravljene z 2-ME, prikazane v monomernem pasu (~55 kDa) v nereducirni SDS-PAGE (slika 3A, pas 3, 5 in 7). Vendar ustrezni zmanjšani VLP-ji niso bili filtrirani skozi 100kDa ultrafiltracijske membrane (slika 3B, spodnja plošča). Ti rezultati kažejo, da so se himerni HPV: proteini HIV sposobni samosestaviti v večje delce, vendar je za maksimalno razstavljanje VLP v monomere potrebno ne samo zmanjšanje disulfidnih vezi, ampak tudi drugi denaturacijski dejavniki, kot sta pH ali ionska moč.

3.4. Morfološka karakterizacija L1:P18I10 in L1:T20 VLP

Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM) je bila uporabljena za pregled morfološke konformacije HPV16 L1 in HPV: HIV VLP. Peptidi HIV-1 P18I10 in T20 so bili vstavljeni v zanke DE proteina L1 HPV16. Ti komercialni HPV16 L1 in himerni HPV: kapsidni proteini HIV se lahko in vitro spontano sami sestavijo v integralne VLP v premeru približno 50–60 nm (slika 4A–C, desna plošča). V primerjavi z elektronskimi mikrofotografijami VLP HPV16 L1, objavljenimi v prejšnjih študijah [55,56], je bila ikozaedrična struktura HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 VLP manj kontrastna in nejasna. Lahko bi ga pripisali negativnemu reagentu za barvanje, ki smo ga uporabili v tej študiji. V naši nedavni študiji, objavljeni v prejšnji študiji [37] in drugem tekočem dokumentu, ki je v strokovni recenziji (podatki niso prikazani), smo dobili dobro kakovost in ločljivost elektronskih mikrografov, ko so L1:P18I10 VLP-ji, pridobljeni iz kvasovk in bakulovirusov (isti himerni konstrukt) so bili uravnoteženi v PBS in negativno obarvani s fosfovolframovo kislino (PTA). Ker smo v tej študiji uporabili različne sisteme proizvodnje in čiščenja VLP, so bili VLP L1:P18I10 in L1:T20, pridobljeni iz celic sesalcev, uravnoteženi s Tris-HCl in negativno obarvani z uranil acetatom. Čeprav bi lahko elektronske mikrofotografije izboljšali, smo še vedno lahko opazili jasen vzorec, da se lahko večina kapsidnega proteina HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 sama sestavi v morfološke VLP pod zaslonom TEM (slika 4A–C, leva plošča). ). V bistvu so HPV VLP zaščiteni pred agregacijo v pogojih z visoko vsebnostjo soli [57]. Nekaj ​​zaznavne agregacije HPV16 L1 in HPV: HIV VLP v pufru Tris-HCl z nizko vsebnostjo soli je bilo mogoče videti pod manjšo povečavo (slika 4A–C, leva plošča). Iz teh rezultatov smo zaključili, da modifikacija delne sekvence zanke L1 DE z vstavitvijo peptidov HIV-1 P18I10 ali T20 ni pomembno vplivala na morfologijo HPV: VLP virusa HIV.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


Slika 4. Elektronski mikrografi L1:P18I10 in L1:T20 VLP. (A) Morfologija HPV16 VLP. (B) Morfologija L1: P18I10 VLP. (C) Morfologija L1:T20 VLP. Očiščeni VLP-ji so bili absorbirani na z UV-napolnjenimi bakrenimi mrežami, prevlečenimi z ogljikom, in negativno obarvani z 2% uranil acetatom. Slike so bile pridobljene s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Vrstica predstavlja 200 nm pri povečavi 59, 000 (leva plošča) oziroma 100 nm pri povečavi 135 K (desna plošča)

3.5. Predstavitev in reaktivnost epitopov HPV-16 in HIV-1 

Za potrditev, da so bili zaporedni epitopi HIV-1 P18I10 ali 2F5 predstavljeni v VLP-jih L1:P18I10 ali L1:T20, očiščenih s kromatografijo, sta bili izvedeni Western blot analiza in indirektni test ELISA z uporabo za epitope specifičnih mAbs. Izbrali smo dobro znano monoklonsko protitelo (mAb), imenovano CAMVIR-1, za prepoznavanje visoko ohranjenega epitopa (GFGAMDF, aa 230–236) proteina HPV16 L1 [39,58]. Prej objavljeno mAb, ki cilja na epitop zanke HIV-1 gp120 V3 (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322), je bilo izbrano za odkrivanje zaporednih epitopov P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Po drugi strani pa je bilo za karakterizacijo peptida T20 izbrano široko nevtralizirajoče protitelo (bnAb), ki prepozna epitop HIV-1 gp41 2F5 (ELDKWA) proti številnim laboratorijskim sevom HIV-1 [ 60,61]. Western blot test, testiran s HPV16 L1 mAb, je pokazal pasove 55, 56 in 58 kDa, ki ustrezajo proteinu HPV16 L1, L1:P18I10 oziroma L1:T20 (slika 5A, B, levo). Molekulska masa (MW) proteina L1:P18I10 je bila podobna proteinu L1 HPV16 (slika 5A, levo). Pas, ki ustreza proteinu L1:T20, je bil opažen nekoliko višji kot protein L1 HPV16, kot je bilo predvideno iz dodatnega aminokislinskega zaporedja (slika 5B, levo). Pasove približno 56 in 58 kDa, ki ustrezajo beljakovinam L1:P18I10 in L1:T20, so odkrili v Western blot testu, testiranem z anti-HIV-1 gp120 V3 oziroma 2F5 mAb (slika 5A, B, desno). ). Mislili smo, da je molekulska masa (MW) proteina L1:T20, obarvanega z anti-2F5-, pravilna in ustreza pričakovanim 58 kDa (slika 5B, desno). Vendar pa je MW anti-HIV{82}} gp120 V3-obarvanega proteina L1:P18I10 nekoliko nižja (slika 5A, desno). To bi lahko pripisali heterogeni strukturi himernih proteinov L1: P18I10. Ker se konformacija zaporednega epitopa lahko izgubi pod denaturacijskim stanjem v SDS-PAGE. Zato smo nadalje izvedli indirektni test ELISA, da bi dokazali, da je konformacijski peptid P18I10 pravilno predstavljen na naših himernih L1: P18I10 VLP (slika 5E). Po drugi strani pa je protitelo zanke proti HIV-1 gp120 V3, ki smo ga uporabili, prepoznalo celotno zanko HIV-1 V3 namesto epitopa P18I10. Posledično je bil skupni signal proti V3 nižji (slika 5A, B, desne plošče). Kljub temu so ti rezultati pokazali, da sta zaporedna peptida HIV-1 P18I10 in T20 prisotna v HPV: HIV VLP.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


Slika 5. Predstavitev epitopov HPV-16 in HIV-1. (A, B) Zaporedna detekcija epitopa himernih L1:P18I10 in L1:T20 VLP. Očiščene VLP L1:P18I10 in L1:T20 smo analizirali z Western blotom z uporabo anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 in 2F5 mAb. HPV16 L1 VLPs so bili uporabljeni kot kontrola. Molekulska masa proteinov L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) in L1:T20 (58 kDa) je označena s puščico. Proga 1: marker molekulske mase beljakovin; Proga 2: protein HPV16 L1; Proga 3: L1:P18I10 protein; Proga 4: L1:T20 protein. (C, D) Vezava HPV16 L1 mAb na himerne VLP L1:P18I10 in L1:T20. (E) Vezava anti-HIV-1 gp120 V3 mAb na himerne L1:P18I10 VLP. (F) Vezava HIV-1 2F5 mAb na himerne L1:T20 VLP. Linijski graf posrednih testov ELISA je bil izveden za odkrivanje konformacijskih epitopov rekombinantnih HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 VLP, vezanih na anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 oziroma 2F5 mAbs. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse. Izveden je bil preprost linearni regresijski test za primerjavo razlike v črtah prečiščenih L1:P18I10 in L1:T20 VLP s standardno krivuljo komercialnih L1 VLP; ns: ni pomembno; ** p < 0,01.

Da bi ugotovili, ali je konformacijske epitope HIV{{{{50}}}}, predstavljene na HPV: HIV VLP, mogoče identificirati z nevtralizirajočimi protitelesi gp120 V3 in 2F5 in vitro, smo izvedli posredni test ELISA, da preverimo specifičnost in reaktivnost vezave epitopa. Kot je prikazano na sliki 5C, D, so HPV16 L1, L1:P18I10 in L1:T20 VLP prepoznali anti-L1 mAb. Izvedli smo linearno regresijsko analizo, da smo primerjali naklon vsake črte redčenja. Rezultati so pokazali, da se specifičnost vezave na epitop L1 VLP L1:P18I10 ali L1:T20 ni razlikovala od L1 VLP HPV16. Poleg tega je anti-HIV-1 gp120 V3 mAb lahko vezalo L1:P18I10 VLP, ne pa HPV16 L1 VLP (slika 5E). Poleg tega lahko 2F5 mAb prepozna L1:T20 VLP, ne pa HPV16 L1 VLP (slika 5F). Po linearni regresijski analizi je bila razlika v specifičnosti vezave epitopa gp120 V3 med L1:P18I10 in HPV16 L1 izjemno pomembna (p < 0,01 %). Specifičnost vezave epitopa 2F5 L1:T20 VLP se je pomembno razlikovala od HPV16 L1 VLP (p < 0,01 %). Ta vzorec je razkril, da hidrofobni celični lipidi niso bili potrebni za vezavo 2F5-nevtralizirajočih protiteles na HPV: HIV VLP in vitro. Čeprav je reaktivnost anti-HIV-1 gp120 V3 in 2F5 nevtralizirajočih protiteles proti HPV: HIV VLP sorazmerno blaga, je bila vezava anti-HIV-1 gp120 V3 in 2F5 mAb na HPV: HIV VLP znatno specifični za epitop.

3.6. Imunogenost L1:P18I10 in L1:T20 VLP po imunizaciji miši BALB/c

Ocenili smo HPV16- in HIV-1-specifične imunske odzive po imunizaciji miši BALB/c z L1:P18I10 in L1:T20 VLP. Urnik cepljenja je prikazan na sliki 6A. Ker je bila z VLP povzročena imunogenost po mukoznem dajanju na splošno šibkejša kot po sistemskem dajanju, so miši imunizirali intramuskularno z eno šestino odmerka Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. Adjuvans aluminijevega hidroksifosfat sulfata za odmerek (10 µg/100 µl) himernih HPV: VLP virusa HIV je bil prilagojen na enako koncentracijo (1 mg/1 ml) kot Gardasil-9. Da bi ocenili razliko med spoloma v izidih cepljenja, so ocenili primerjavo odzivov protiteles med samci (n=4) in samicami (n=4) miši. V skupini L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP in Gardasil-9 so bili odzivi protiteles proti HPV16 L1 mišjih samic v povprečju višji kot pri mišjih samcih (slika 6B). 2 od 4 (50 %) samic, imuniziranih z L1:P18I10 VLP, 3 od 4 (75 %) samic, imuniziranih z L1:T20 VLP, in vse (100 %) mišje samice, imunizirane s Gardasilom, so izzvale višji titer protiteles proti L1 kot samci miši. Odzivi anti-L1, ki so jih sprožile mišje samice v skupini, ki je prejemala Gardasil-9, so bili znatno višji kot pri mišjih samcih (p=0.0041) (slika 6B). Zelo nizka stopnja odzivov protiteles proti L1 je bila odkrita v skupini s pripravo BCG.HIVA in pospeševanjem L1:P18I10 VLP. Ta vzorec se ujema s prejšnjimi ugotovitvami, ki opisujejo, da BCG pretežno inducira T-celične odzive namesto proizvodnje IgG [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


Slika 6. Indukcija humoralnih imunskih odzivov z L1:P18I10 in L1:T20 VLP pri miših BALB/c. Urnik cepljenja je prikazan v (A). Vse skupine miši so imele enako porazdelitev po spolu (moški n=4 in samice n=4). Skupini A in B: homologna prima-boost imunizacija z 10 µg L1:P18I10 ali L1:T20 VLP intramuskularno (im); Skupina C: uvod s 106 cfu rBCG.HIVA intradermalno (id) in okrepitev z 10 µg L1:P18I10 VLP im; Skupina D: homologno primarno poživitveno cepljenje s Gardasilom-9, ki vsebuje 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Skupina E: dvakratna imunizacija s PBS pufrom. Interval med prvimi okrepitvami je bil 2 tedna. Končna točka tega preskušanja je bila 28. dan. Serume smo zbrali in razredčili pri titru 1:50 za test ELISA. (B) HPV L1-specifični IgG pri mišjih samcih in samicah. (C–E) Epitop-specifični IgG, induciran z L1:P18I10 in L1:T20 VLP. ELISA je bila izvedena za analizo anti-L1, anti-P18I10 in anti-T20 IgG, ki so jih inducirale miši BALB/c po različnih kombinacijah prime-boost, kot je opisano zgoraj. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD. Za primerjavo razlik med skupinami je bil narejen enosmerni (neparametrični) test ANOVA. OD: optična gostota. N ni pomemben; ** p < 0,01

Ocenili smo, ali lahko miši, imunizirane z L1: P18110 in L1: T20 VLP, inducirajo HPV-16 L1-specifična protitelesa in HIV-1 epitop specifična protitelesa pri miših BALB/c. Z VLP inducirana protitelesa IgG v mišjih serumih so bila izmerjena z ELISA testom, prevlečenim z rekombinantnim HPV16 L1 proteinom, P18I10 oziroma T20 peptidi. Statistična razlika v L1-specifičnih IgG pri serumskem titru 1:50 je bila odkrita v skupini Gardasil-9 v primerjavi s kontrolno skupino PBS (p=0.0039). Odzivi proti L1 pri miših, imuniziranih s Gardasil-9, L1:P18I10 in L1:T20 VLP, so bili podobni in se niso pomembno razlikovali (slika 6C). BCG.HIVA2auxo.int prime in L1:P18I10 VLP boost miši so izzvale zelo nizko raven anti-L1 IgG. Ti rezultati kažejo, da so miši, imunizirane s HPV: HIV VLP, proizvedle enako raven anti-L1 IgG kot miši, imunizirane s Gardasil-9- (slika 6C). Čeprav se zdi, da ima skupina L1:P18I10 VLP številčno tendenco k višji ravni IgG, specifičnega za epitop P18I10, kot druge imunizacijske skupine, te razlike niso bile statistično značilne (slika 6D). Pri nekaterih miših, imuniziranih z L1:P18I10 VLP (4 od 8, 50 %), so opazili višja protitelesa proti P18I10 v primerjavi z mišmi, imuniziranimi s Gardasil-9-. Druga možnost je, da je analiza T-testa pokazala, da je razlika med skupino L1:P18I10 VLP in Gardasil-9 značilna (p=0,005) (podatki niso prikazani). V skupini L1:T20 VLP so zaznali znatno večji odziv protiteles proti peptidu T20 v primerjavi s skupino Gardasil-9 (p=0.0083). Kot je bilo pričakovano, titrov anti-T20 ni bilo mogoče zaznati v cepiva Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP in BCG.HIVA prime v kombinaciji z L1:P18I10 VLP skupinami za pospeševanje (slika 6E). Titer protitelesa, specifičnega za peptid T20, je bil relativno nizek. To je verjetno posledica: (1) T20 je subdominantni peptid; (2) izzivanje nevtralizirajočih protiteles MPER ali 2F5 zahteva konjugate peptid-lipid (slika 6E). Na splošno so naši rezultati pokazali, da lahko VLP L1:P18I10 in L1:T20 pri miših inducirajo HPV16-, vendar šibke HIV-1-specifične protitelesne odzive.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Za ovrednotenje imunskih odzivov T-celic, specifičnih za HPV in HIV, pri miših smo sledili shemi imunizacije, prikazani na sliki 7A. Poleg tega so primerjali heterologno osnovno cepljenje BCG.HIVA2auxo.int in L1:P18I10 VLPs boosting s homologno L1:P18I10 VLP primarno in boost imunizacijo, da bi ocenili pogostnost specifičnih imunskih odzivov T-celic HPV16 in HIV-1. Med skupinama Gardasil-9 in PBS ni bilo razlik glede izločanja IFN po stimulaciji splenocitov s HPV16 L1 VLP. Tudi razlike v L1- specifičnem izločanju IFN-ja med skupinama L1:P18I10 VLP in Gardasil-9 niso bile pomembne. Ugotovili smo, da bi lahko šibko L1-specifično izločanje IFN pripisali nizki koncentraciji (2 µg/mL) HPV16 L1 VLP, uporabljenih kot dražljaje. Skupina BCG.HIVA2auxo.int prime in L1:P18I10 VLP boost je povzročila višjo pogostnost splenocitov, ki izločajo IFN, in opazili so pomembne razlike v izločanju IFN v primerjavi z mišmi, cepljenimi s skupino Gardasil-9 (p {{36 }}.0103). 3 od 8 miši (~38 %) so izzvale najvišje L1- specifične odzive IFN (slika 7B). To bi lahko pripisali nespecifični adjuvantnosti BCG glede na naše prejšnje študije [64–66]. Očiten začetni učinek, tudi z divjim tipom BCG, je v skladu s sposobnostjo derivatov rBCG, da delujejo kot močni adjuvansi za kasnejša ojačevalna cepiva [64,65]. Kar zadeva HIV-1-specifične T-celične odzive, so največjo skupno velikost celic, ki tvorijo točke IFN (SFC)/106 splenocitov, opazili pri miših, zdravljenih z BCG.HIVA2auxo.int, v primerjavi z mišmi, ki so prejemale Gardasil{{54} } cepiva ali L1:P18I10 VLP. Miši, cepljene z BCG.HIVA in okrepljene z L1:P18I10 VLP, so izzvale znatno večje izločanje IFN-ja v primerjavi z mišmi, cepljenimi s homolognim primarnim pospeševanjem L1:P18I10 VLP (p=0.0268). Poleg tega so pri miših, cepljenih z L1:P18I10 VLP, opazili znatno večje izločanje IFN v primerjavi z mišmi, ki so prejemale cepivo Gardasil-9 (p=0.0157) (slika 7C). Kot je bilo pričakovano, izločanje IFN ni bilo mogoče zaznati v skupinah Gardasil-9 in PBS. Ti rezultati so pokazali, da (1) VLP L1:P18I10 izzovejo HIV-1-specifične imunske odzive T-celic; (2) L1:P18I10 VLP so izzvali HPV-specifične T-celične imunske odzive in (3) BCG.HIVA2auxo.int bi lahko okrepil HIV-1-specifične T-celične imunske odzive, ki jih izzove L1:P18I10 VLP.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


Slika 7. Indukcija specifičnih odzivov celic T za HPV16 in HIV-1 s himernimi L1:P8I10 VLP in BCG.HIVA pri miših BALB/c. Urnik cepljenja je prikazan v (A). Vse skupine miši so imele enako porazdelitev po spolu (moški n=4 in samice n=4). Skupina A: homologna prima-boost imunizacija z 10 µg L1:P18I10 VLP intramuskularno (im); Skupina B: uvod s 106 cfu rBCG.HIVA intradermalno (id) in okrepitev z 10 µg L1:P18I10 VLP im; Skupina C: homologno začetno pospešeno cepljenje s Gardasilom-9, ki vsebuje 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Skupina D: dvakratna imunizacija s PBS pufrom. Interval med prvimi okrepitvami je bil 2 tedna. Končna točka tega preskušanja je bila 28. dan. Splenociti so bili izolirani za IFN-ELISpot test. Imunski odziv T-celic na HPV16 in HIV-1 je bil ocenjen ex vivo z IFN-ELISpot po stimulaciji splenocitov s HPV16 L1 VLP in peptidom P18I10. (B, C) HPV16 L1- in HIV-1 P8I10-specifični T-celični odzivi, ki jih izzovejo L1:P8I10 VLP in BCG.HIVA prime v kombinaciji s pospeševanjem L1:P18I10 VLP. Podatki so prikazani kot mediana ± SD. Opravljen je bil enosmerni ANOVA test za primerjavo razlik med skupinami. N ni pomemben; * p < 0,05.

4. Disblazina

Tako HPV16 kot HIV-1 sta spolno prenosljivi bolezni in sta trenutno v središču številnih študij o cepivih. Čeprav so bila profilaktična cepiva proti HPV komercializirana in je bil prenos HIV-1 v veliki meri nadzorovan s protiretrovirusnim zdravljenjem (ART) in PrEP, je nujno potrebno učinkovito, varno in cenovno dostopno himerno cepivo proti HPV: HIV proti obema virusoma. V tej študiji (1) smo dokazali, da sta ekspresijski sistem 293F in metoda kromatografskega čiščenja lahko izvedljiva pristopa za proizvodnjo in čiščenje himernih L1:P18I10 in L1:T20 VLP; (2) potrdili smo, da vstavljanje peptidov P18I10 ali T20 v zanko DE kapsidnih proteinov HPV16 L1 ni vplivalo na in vitro stabilnost, samosestavljanje in morfologijo himernih HPV: HIV VLP; (3) Zaporedni in konformacijski peptidi P18I10 ali T20, izpostavljeni DE zankam himernega HPV: VLP virusa HIV je mogoče zaznati z nevtralizirajočimi protitelesi anti-HIV-1 gp120 V3 in 2F5 in vitro; (4) Himerni VLP L1:P18I10 in L1:T20 bi lahko izzvali HPV, a šibka HIV-1-specifična vezavna protitelesa pri miših BALB/c. Poleg tega vstavljanje peptidov HIV-1 P18I10 ali T20 v protein HPV16 L1 ni vplivalo na indukcijo protiteles, specifičnih za HPV16 L1-, in vivo; (5) VLP-ji L1:P18I10 bi lahko inducirali T-celične odzive, specifične za HPV16 in HIV-1-; (6) BCG.HIVA prime in L1:P18I10 VLP boost sta izzvala najvišjo velikost splenocitov, ki proizvajajo IFN, v primerjavi s homolognim primarnim boostom L1:P18I10 VLP pri miših BALB/c. Te ugotovitve so podprle nadaljnji razvoj cepiv proti virusu HIV-1 na osnovi rBCG in himernega HPV: HIV VLP. Na splošno ta študija zagotavlja osnovno strategijo, ki bi lahko bila vredna podpore globalnim prizadevanjem za razvoj novih himernih cepiv na osnovi VLP za nadzor okužb s HPV in HIV.

V tej študiji bi lahko L1:P18I10 in L1:T20 VLP inducirali enako raven protiteles, ki vežejo L1 proti HPV16, kot cepivo Gardasil-9 proti HPV. Vendar VLP-ji L1:P18I10 in L1:T20 izzovejo samo nizke ravni odzivov protiteles, ki vežejo HIV, specifičnih za epitope P18I10 in T20. Domnevali smo, da je to lahko posledica testnih plošč ELISA, ki so bile prevlečene z rekombinantnim proteinom HPV16 L1, peptidom HIV-1 P18I10 oziroma peptidom HIV-1 T20. Mišja protitelesa proti L1, inducirana z našimi L1:P18I10 in L1:T20 VLP, lahko ciljajo na več veznih epitopov proteina L1. Nasprotno pa mišja protitelesa proti HIV-1, ki jih izzovejo naši L1:P18I10 in L1:T20 VLP, ciljajo le na en sam HIV peptid (P18I10 ali T20) na HPV: HIV VLP. Posledično so bile skupne največje vrednosti OD450 protiteles, ki vežejo virus HIV-1, veliko nižje od protiteles L1 proti HPV16.

Razlog, da smo izbrali zanko DE kapsidnega proteina HPV16 L1 kot predhodno insercijsko regijo HIV-1 imunogena, se je skliceval na prejšnjo študijo, ki je imunizirala miši z govejim papiloma virusom (BPV): HIV VLP za induciranje odzivov protiteles [20]. Znano je, da epitopi, ki se nahajajo znotraj površinsko izpostavljenih DE in FG zank glavnih kapsidnih proteinov HPV L1, pretežno prispevajo k navzkrižno nevtralizirajočim protitelesom, ki jih povzroči cepivo [67]. Poleg tega so prejšnje študije pokazale, da lahko vstavitev HIV-1 MPER v zanko BPV L1 DE inducira delno nevtralizirajoča protitelesa, ki specifično prepoznajo naravno konformacijo MPER v HIV-1 Env [20]. Vendar pa nobeni podatki niso pokazali, ali rekombinantni BPV L1:MPER VLP vpliva na imunogenost in nevtralizacijo proti BPV po vstavitvi HIV-1 MPER v protein BPV L1. V naši študiji z uporabo VLP HPV16 L1 kot vektorja za dostavo antigena HIV smo opazili, da vstavljanje peptida HIV-1 ni spremenilo strukture L1 HPV in da imajo himerni HPV: proteini HIV še vedno sposobnost tvorbe VLP. Poleg tega smo izvedli koncept imunskega premoščanja, da bi dokazali primerljive imunske odzive med kandidatom HPV: HIV VLP (naš) in odobrenim cepivom proti HPV na osnovi VLP (licencirano Gardasil-9). Naši podatki so razkrili, da lahko vstavljanje peptida HIV-1 P18I10 ali T20 v himerni HPV: VLP virusa HIV povzroči podoben titer protiteles, specifičnih za vezavo HPV16 L1-, v primerjavi s HPV Gardasil-9 cepivo. Tipsko specifična vezavna protitelesa proti HPV16 L1, opažena pri licenčnem cepivu HPV Gardasil-9 VLP v primerjavi s himernimi različicami cepiva HPV Gardasil-9 VLP, so bila v skladu z našimi podatki.

Dolžino in mesto optimalnega tujega antigena HIV-1, vključenega v HPV16 L1 VLP, in in vitro stabilnost nastalega himernega HPV: HIV VLP je treba preveriti pred imunizacijo miši. Naša trenutna študija je pokazala, da vstavljanje peptidov P18I10 ali T20 v protein HPV16 L1 ni vplivalo na stabilnost in vitro, samosestavljanje in morfologijo himernih HPV: HIV VLP. Ti rezultati so bili v skladu s prejšnjimi študijami, ki so pokazale, da vstavitev domene HIV-1 MPER v sekvenco zanke BPV L1 DE ni vplivala na sposobnost samosestavljanja kapsidnega proteina BPV L1 v VLP [20]. V bistvu epitopi, ki se nahajajo znotraj površinsko izpostavljenih zank DE in FG kapsidnih proteinov HPV L1, pretežno prispevajo k indukciji L1-specifičnih navzkrižno nevtralizirajočih protiteles [67]. Tukaj smo dokazali, da vstavitev peptidov HIV-1 P18I10 ali T20 v zanko HPV16 L1 DE ni vplivala na indukcijo L1-specifičnih protiteles s himernimi HPV: HIV VLP po imunizaciji miši. Poleg tega so bili epitopi HIV-1 P18I10 ali T20 na zankah HPV16 DE himernega HPV: HIV VLP odkriti in vitro in so bili imunogeni in vivo. HPV16 L1 VLP predstavljajo potencialno ogrodje za površinsko prikazovanje zanimivega epitopa HIV-1. V tej študiji smo izvedli indirektni test ELISA, da bi dokazali konformacijski peptid P18I10 in T20, predstavljen na površini naših himernih HPV: HIV VLP. V prihodnosti bi lahko bila imunska elektronska mikroskopija tudi dodaten pristop za prikaz strukturne lokalizacije in organizacije antigena P18I10 ali T20 znotraj HPV: HIV VLP.

Samosestavljanje je reprezentativen indeks in vitro stabilnosti HPV16 L1 VLP. Znano je, da pH, ionska moč, temperatura [52] in redoks okolje korelirajo z disulfidnimi vezmi kapsidnih proteinov HPV16 L1 [53]. Prejšnja dela o VLP virusih papiloma so pokazala pomen disulfidnih vezi za samosestavljanje glavne kapside L1 [68,69]. Tvorba disulfida je pokazala višji cistein kapsidnega proteina L1 v ustrezni geometriji [53]. Te disulfidne navzkrižne povezave povezujejo ostanke 175 in 428 (za HPV16), ki stabilizirajo virione HPV in VLP [70]. V tej študiji smo analizirali vzorce medmolekularnega disulfidnega navzkrižnega povezovanja kot posreden dokaz za dokaz, da se naši kapsidni proteini L1:P18I10 in L1:T20 nagibajo k samosestavljanju in vitro. Na sliki 3A smo pokazali, da so prečiščeni VLP L1:P18I10 in L1:T20 predstavljali podobne vzorce medmolekularnega disulfidnega navzkrižnega povezovanja kot VLP HPV16 L1 pri enakem pH, ionski moči in termičnih pogojih. Na sliki 3B smo dodatno dokazali, da so se prečiščeni proteini L1:P18I10 in L1:T20 sposobni samosestaviti v večje delce (večje od L1 pentamera MW 280 kDa) in vitro. Zato smo skupaj z morfološkim vzorcem VLP samosestavljanja (čeprav ikozaedrična struktura ni bila povsem dobra), opaženim na sliki 4, zaključili, da je naš prečiščeni himerni HPV: VLP virus HIV stabilen in vitro. Poleg stabilnosti VLP je treba upoštevati še številne druge kritične dejavnike, ki bi lahko vplivali na imunogenost himernega HPV: VLP virusa HIV, kot so mesto vstavitve imunogena med različne zanke VLP [71], odmerek, intervali začetnega pospeševanja in način dajanja [22] itd.

Peptidi P18I10, pridobljeni iz zanke HIV-1 gp120 V3, so v celicah, okuženih s HIV, predstavljeni z molekulami razreda I glavnega histokompatibilnega kompleksa (MHC-I) [26]. CD8+, citotoksični limfociti T (CTL), bi lahko prepoznali antigene P18I10, omejene z MHC-I, in izločali različne citokine, kot je IFN-, da bi odstranili celice, okužene s HIV [72–75]. Rekombinantna virusna ali plazmidna DNA sta dobra nosilca cepiva za izražanje peptidov P18I10 v gostiteljskih celicah in induciranje P18I10-specifičnih celičnih odzivov po poti MHC-I [76–79]. Na primer, kombinirani režim DNA prime in modificiranega virusa vakcinije Ankara (MVA) boost je zadostoval za indukcijo odzivov IFN- in CTL proti epitopu P18I10 [79]. Nasprotno, eksogeni peptidi P18I10 niso učinkovito predstavljeni CD8+ T-celicam po poti MHC-I [80,81] in zahtevajo sodelovanje ustreznih adjuvansov [82–85] ali nosilcev antigena, kot je npr. VLP-ji. Na primer, imunogenost sintetičnih peptidov P18I10, dopolnjenih z adjuvansi, je bila obrobna zaradi odsotnosti determinant T-helper [82–85]. Prej so poročali, da so HIV-1 Gag VLP [86], VLP površinskega antigena hepatitisa B (HBsAg) [87], VLP parvovirusa VP2 [88] in VLP virusa papiloma L1 [17–19] bi lahko delovali kot dostavni vektorji za MHC-I-omejeno predstavitev epitopa CTL in vivo. Čeprav je mehanizem odzivov T-celic, omejenih z MHC-I, ki jih povzroči VLP, še vedno nejasen, bi struktura delcev VLP lahko koristila endocitnemu privzemu makrofagov ali dendritičnih celic, s čimer bi dostopali do citosola in nato vstopili na tipično pot MHC-I [89, 90]. Poleg tega so opazili, da determinanta P18I10, omejena z MHC-I, inducira odzive T-celic pomočnic CD4+ po poti MHC-II [91,92]. Hibridne VLP BPV1 L1 se lahko uporabljajo kot nosilci antigenskih epitopov za izzivanje terapevtskih virusno specifičnih odzivov CTL prek poti MHC-I in MHC-II [17,19], kar zagotavlja obetavno strategijo za načrtovanje cepiva za nadzor virusne okužbe. Nekatere zgodnje študije so pokazale tudi VLP BPV L1, ki izražajo epitop HPV16 E7 ali epitop P18I10 HIV-1 gp120 V3 z zanko inducirane površine sluznice in tudi humoralno in T-celično imunost, specifično za sistemski epitop VLP [18]. V skladu s prejšnjimi študijami smo predhodno dokazali, da lahko naši himerni HPV: HIV (L1: P18I10) VLP inducirajo HIV-specifične T-celične imunske odzive pri miših BALB/c po stimulaciji splenocitov s peptidom P18I10. Poleg tega je priprava BCG.HIVA okrepila HIV-1-specifične imunske odzive T-celic pri miših. Vendar bi večnamenski T-celični imunski odzivi, inducirani z L1: P18I10 VLP, potrebovali nadaljnje imunološke študije.

Širši odzivi T-celic CD8+ proti številnim ohranjenim epitopom CTL so koristni za premagovanje genetske raznolikosti HIV-1 in pobeg [7,93–100]. Racionalna zasnova imunogenov T-celic HIV-1, kot je HIVA, bi morala imeti potencial za odziv na več epitopov CTL [34]. Imunogen HIV-1 HIVA, ki ga je oblikoval dr. Tomas Hanke, je sestavljen iz proteina HIV-1 Gag polne dolžine v kombinaciji z več epitopi CTL, vključno z epitopi P18I10 na C-koncu [34]. DNA, MVA in rBCG so bili izbrani kot prenašalci imunogena HIVA in so inducirali veliko magnitudo in širino celičnih odzivov, specifičnih za epitope CTL, z uporabo heterolognih režimov prime-boost v modelih miši in primatov razen človeka (NHP) [34,101]. Naše predhodne študije so pokazale, da je BCG.HIVA prime v kombinaciji z MVA.HIVA boost izzval HIV-1-specifične IFN-producirajoče CD8+ T-celice pri miših BALB/c [31–33,102]. Zanimivo je, da so VLP lahko potencialni spodbujevalec za povečanje za HIV specifičnih celičnih odzivov pri heterologni imunizaciji z rBCG [29,30] ali DNA cepivi [103,104]. Na primer, rBCG, ki izraža HIV-1 Gag protein, bi lahko učinkovito spodbudil T-celični imunski sistem za spodbudo z Gag VLP v modelih NHP [29,30]. V trenutni študiji smo dokazali, da lahko priprava BCG.HIVA okrepi imunske odzive T-celic, ki jih povzročijo HPV: HIV (L1:P18I10) VLP. Nadalje bomo raziskali obseg polifunkcionalnih odzivov CD4+, CD8+ in spominskih T-celic, ki jih ustvarita glavni režim rBCG in pospeševalni režim VLP.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Trenutno se naša raziskovalna skupina osredotoča na razvoj obetavnih rBCG: cepiv proti HIV, ki izražajo nove imunogene T-celic HIV-1, kot sta tHIVconsvX in HIVACAT (HTI) imunogen T-celic, za izboljšanje HIV-1 variantno ujemanje in širino odziva T-celic. Imunogeni HIVconsvX 2. generacije so bili zasnovani s ponovnim definiranjem ohranjenih regij skupine M in uporabo bivalentne mozaične zasnove za čim večje ujemanje potencialnih 9-mernih epitopov T-celic v cepivu z globalnimi različicami [64]. Imunogen HTI je bil zasnovan tako, da pokriva T-celične tarče, proti katerim so odzivi T-celic pretežno opaženi pri HIV-1-okuženih posameznikih z nizko HIV-1 virusno obremenitvijo [65,66]. Ker je bilo dokazano, da so VLP papiloma nosilci več epitopov CTL [17], smo želeli konstruirati himerne VLP HPV16 L1, ki prenašajo več ohranjenih epitopov CTL HIV-1 v kombinaciji z rBCG, ki izraža imunogene T-celic ThivconsvX ali HTI, da bi inducirali širše Imunski odziv CTL proti HIV-1. Visoka gostota in več kopij CTL epitopa HIV-1, predstavljenega na himernem HPV: VLP virusa HIV lahko izboljšajo dostavo antigena v imunski sistem in povzročijo večjo pogostnost odzivov CTL. Nasprotno pa je bolj verjetno, da bo rekombinantni BCG ustvaril nižjo frekvenco odzivov CTL zaradi počasnega podvajanja in vivo. Ker ima BCG izrazit vpliv na diferenciacijo celic T, kar pomeni, da lahko BCG inducira spomin celic T CD8+ s sodelovanjem celic T-pomočnic CD4+ [105], je ta imunogena lastnost bi lahko bil BCG primeren kot začetni agent v heterolognih režimih začetnega pospeševanja. Tako smo pričakovali, da bi se lahko naše HPV: HIV VLP izkazale kot obetaven spodbujevalec za povečanje obsega in širine odzivov CTL virusa HIV-1 pri pripravi z rekombinantnim BCG, ki izraža nov imunogen T-celic HIV-1 .

Peptid T20 vsebuje visoko ohranjen linearni epitop 2F5 (ELDKWA). Poročali so, da ima protitelo 2F5, zbrano pri dolgotrajno okuženih bolnikih s HIV, široko nevtralizirajočo učinkovitost [106,107]. MPER gp41 velja za slabo imunogenega, kar je morda povezano z njegovo lokacijo blizu celičnega in virusnega fosfolipidnega dvosloja [108]. Uporaba vektorjev DNA, ki predstavljajo MPER v lipidnem okolju, je koristna za induciranje gp41-specifičnih nAbs [109–111]. Na primer, dokazano je bilo, da cepiva proti DNA, ki kodirajo virus HIV-1 T20-, ki jih je oblikovala dr. Britta Wahren, inducirajo odzive navzkrižnih nevtralizirajočih protiteles (nAb) [109]. Nasprotno pa so bili številni zgodnji poskusi induciranja nAbs, ki ciljajo na gp41, z uporabo peptidnih ali podenotnih strategij cepiva neuspešni [112–116]. Nedavno so nekatere študije pokazale, da VLP BPV L1, ki izražajo epitop 2F5 ali MPER HIV-1 gp41 induciranih 2F5-specifičnih protiteles pri miših, povzroči navzkrižno nevtralizacijo [20,21]. Podoben vzorec imunogenosti so ugotovili, ko je bil površinski antigen hepatitisa B (HBsAg) spojen z epitopom HIV-1 2F5 ali MPER [59,117–119]. Tu smo dokazali, da lahko predstavitev peptida HIV-1 T20 in P18I10 v našem himernem HPV16 L1 VLP inducira odziv protiteles proti HIV-1 in HPV16. Nevtralizirajoči epitopi, stabilizirani na konformacijskem ogrodju, kot so funkcionalne konice HIV-1 ali VLP, bi lahko bili glavni tok oblikovanja imunogena B-celic za doseganje širokih nevtralizirajočih protiteles (bnAbs) [93]. Vendar je večina novih epitopov bnAb (približno 90 %) neprekinjenih in sestavljenih regij, združenih v 3-dimenzionalne konfiguracije [120]. Čeprav bi lahko predstavitev diskontinuiranih epitopov na proteinskem ogrodju predvideli z računalniškim modeliranjem [121], bi lahko te epitope bnAb postavili pred izziv, da bi jih vgradili v ogrodje proteina HPV16 L1 brez ovojnice. Nasprotno pa manjšina imunogenov B-celic HIV-1, kot je MPER (2F5) HIV-1 gp41 ali zanka V3 (P18IIB) gp120, vsebuje linearne nevtralizirajoče epitope in bi lahko bili primerni za HPV: hrbtenica beljakovin HIV. Zato smo izbrali linearni nevtralizirajoči epitop 2F5, ki je vključen v razširjeni peptid T20 HIV-1 MPER v smislu ugodne strukture za tvorbo -vijačnice [122]. Peptidi T20 bi se lahko spojili in stabilizirali na L1 kapsidnih ogrodjih, da bi izzvali odzive nevtralizirajočih protiteles, če bi lahko predstavili nativno konfiguracijo epitopa 2F5. V tej študiji smo ugotovili, da so bila 2F5 nAbs in vitro vezana na himerne VLP HPV: HIV (L1:T20). Poleg tega lahko L1:T20 VLP inducirajo T20-specifična vezavna protitelesa pri miših BALB/c. Vse več je bilo dokazov, da imajo protitelesa, inducirana s HIV-1 fuzijskim peptidom (T20), podobne lastnosti kot anti-HIV-1 fuzijski peptid enfuvirtid, da vežejo hidrofobni transmembranski ostanek T20, ki se nahaja v MPER gp41 med HIV-1 se spaja in prispeva k nadzoru nad virusom [109,123,124]. V skladu z našimi prejšnjimi pregledi bi bilo treba vedno upoštevati racionalno zasnovo himernih cepiv na osnovi VLP za induciranje HPV in HIV-specifičnih nevtralizirajočih protiteles in odzivov CTL v smislu izbire imunogena, vektorjev za dostavo antigena in režimov glavnega pospeševanja. Skratka, ta študija je pokazala alternativno platformo izražanja na osnovi celic sesalcev in razširljivo metodo kromatografskega čiščenja za inženiring himernih HPV: HIV VLP. Menimo, da bodo naše nove metode čiščenja pomagale pri pridobivanju antigenskih HPV: VLP virusov HIV iz celic sesalcev s ciljem zmanjšanja časa, stroškov in dela ter hkrati povečanja zmogljivosti za industrijsko proizvodnjo. Poleg tega smo dokazali, da lahko VLP HPV16 L1 delujejo kot dostavno platformo za prenašanje peptidnega antigena HIV-1, ker vstavljanje peptidov P18I10 ali T20 v zanko DE kapsidnih proteinov HPV16 L1 ni vplivalo in vitro na stabilnost, samosestavljanje in morfologijo himernih HPV: HIV VLP in je ne moti indukcije specifičnih protiteles HPV16 L1-in vivo. Po drugi strani pa lahko himerni HPV: HIV VLP izzovejo HPV16 in HIV specifične B in T-celične imunske odzive proti obema virusoma. V tem poročilu je bila raziskana možnost razvoja cepiv proti HIV-1 na osnovi rekombinantnega BCG, ki izraža HIV-1 imunogene in HPV: HIV VLPs, ki se lahko uporabljajo za imunizacijo HIV-1 v otroštvu. Ker je razvoj učinkovitega himernega cepiva proti HPV16 in HIV-1 še vedno izziv, to delo prispeva korak k razvoju nove platforme cepiva na osnovi himernega HPV: HIV VLP za nadzor HPV16 in HIV{{118 }} okužbo, ki je nujno potrebna v državah v razvoju in industrializiranih državah.

Reference

1. Globalna statistika UNAIDS o HIV in aidsu-2018 Informativni list. 2019. Dostopno na spletu: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (dostopano 15. junija 2020).

2. Baeten, JM PrEP za HIV: Stopnja A za dokaze, vendar čaka na vpliv. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Pariz, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; et al. Cepljenje z ALVAC in AIDSVAX za preprečevanje okužbe s HIV-1 na Tajskem. N. angl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Glavne znanstvene ovire pri razvoju cepiva proti virusu HIV: zgodovinska perspektiva in prihodnje usmeritve. Spredaj. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL Cepiva proti HIV/aidsu: 2018. Clin. Pharmacol. Ther. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Široko nevtralizirajoča protitelesa in zasnova cepiva proti okužbi s HIV-1. Spredaj. med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T celice pri nadzoru, zdravljenju in preprečevanju HIV. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Vodnik po vakcinologiji: od osnovnih načel do novih razvojev. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Lekcije za splošne vakcinološke raziskave iz poskusov razvoja cepiva proti HIV. Vaccine 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Razširjenost podtipov humanega papiloma virusa 16 in 18 med jemenskimi bolniki z rakom materničnega vratu. Asian Pacific J. Cancer Prev. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Karakterizacija domen zanke HPV16 L1 pri tvorbi tipsko specifičnega, konformacijskega epitopa. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Celično posredovana imunost, ki jo pri miših inducirajo virusu podobni delci HPV 16 L1. Microb. Patog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller, J.; Lowy, D. Pojasnila za visoko učinkovitost profilaktičnih cepiv proti HPV. Vaccine 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Cepiva proti humanemu papilomavirusu. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Koncepti oblikovanja cepiv proti virusu HIV-1 na osnovi virusu podobnih delcev. Spredaj. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Oblikovanje himernih virusom podobnih cepiv na osnovi delcev za humani papiloma virus in HIV: pridobljene izkušnje. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Papilomavirusu podobni delci za dostavo več citotoksičnih epitopov T celic. Virologija 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Imunizacija sluznice z delci, podobnimi virusu papiloma virusa, izzove sistemsko in mukozno imunost pri miših. Virologija 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Virusu papiloma virusu podobni delci lahko dostavijo definirane epitope CTL na pot MHC razreda I. Virologija 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Kopje, GT; Qiao, L. Govejemu papilomavirusu podobni delci, ki predstavljajo ohranjene epitope iz proksimalne zunanje regije membrane HIV-1 gp41 induciranih mukoznih in sistemskih protiteles. Vaccine 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Kopje, GT; Qiao, L. Indukcija mukoznih in sistemskih nevtralizirajočih protiteles proti virusu humane imunske pomanjkljivosti tipa 1 (HIV-1) s peroralno imunizacijo z bovinim papilomavirusom-HIV-1 gp41 himernimi virusom podobnimi delci. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, Nova Zelandija; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Pot dajanja himernega BPV1 VLP določa naravo induciranih imunskih odzivov. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, HEATHER; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Učinkovita samosestava humanega papilomavirusa tipa 16 LI in L1-L2 v virusu podobne delce. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD. Karakterizacija virusom podobnih delcev v GARDASIL® s krio transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Hum. Cepiva Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Citotoksični limfociti T, specifični za antigen HIV-1 gp160 in sintetični peptid P18IIIB pri HLA-A11-imuniziranem posamezniku. AIDS Res. Hum. Retrovirusi 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Molekularna analiza interakcije TCR in peptid/MHC z uporabo peptidov, pridobljenih iz P18-I10-, z eno samo zamenjavo D-aminokisline. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identifikacija in karakterizacija podžepa na N-trimerju HIV-1 Gp41: Posledice za vstop virusa in cilj zdravila. Aids 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Pilotna študija faze II o varnosti in imunogenosti virusa HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) pri asimptomatskih HIV seropozitivnih osebah. J. Infect. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]

29. Chege, GK; Burgers, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; et al. Močna imunost proti kandidatu za avksotrofno Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost za cepivo proti HIV v modelu nečloveških primatov. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; siva, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Režim imunizacije s prvim pospeševanjem z uporabo rekombinantnih cepiv z delci, podobnimi virusu BCG in Pr55gag, ki temeljijo na podtipu C HIV tipa 1, uspešno izzove odzive, specifične za Gag, pri pavijanih. Vaccine 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Joseph, J.; Saubi, N.; Sem, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Cepljenje novorojenih miši z BCG.HIVA222 + MVA.HIVA krepi HIV-1-specifične imunske odzive: Vpliv starosti in poti imunizacije. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Inženiring nove zasnove mikobakterijskega cepiva za pediatrično cepivo HIV-TB, vektorirano z lizinskim avksotrofom BCG. Mol. Ther. Metode Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Kitara, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Predklinični razvoj BCG.HIVA2auxo.int, ki vsebuje integrativni ekspresijski vektor, za pediatrično cepivo HIV-TB. Izboljšanje stabilnosti in specifične HIV{3}} T-celične imunosti. Hum. Cepiva Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T.; McMichael, AJ Zasnova in izdelava poskusnega cepiva proti virusu HIV-1 za enoletno-2000 klinično preskušanje v Keniji. Nat. med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Visoka in visokozmogljiva proizvodnja rekombinantnih beljakovin s prehodno transfekcijo človeških celic 293-EBNA1, ki rastejo v suspenziji. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Enostopenjsko kromatografsko čiščenje beljakovin humanega papiloma virusa tipa 16 L1 iz Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Izražanje himernega HPV-HIV proteina L1P18 v pichia pastoris; čiščenje in karakterizacija virusu podobnih delcev. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. Uporaba CaptoTM Core 700 in Capto Q ImpRes pri čiščenju delcev, podobnih humanemu papiloma virusu. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Proizvodnja in karakterizacija monoklonskega protitelesa proti humanemu papiloma virusu tipa 16 z uporabo rekombinantnega virusa vakcinije. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Monografija izdelka Merck Canada Inc. Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Kristalna struktura H-2D(d) MHC razreda I v kompleksu s peptidom P18-110, pridobljenim iz HIV-1-, pri ločljivosti 2,4 Å: Posledice za celice T in celice NK priznanje. Imuniteta 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Trenutni peptidni zaviralci fuzije tipa-1 HIV. Antivir. Chem. kemoter. 2009, 20. [CrossRef]

43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktura majhnih virusu podobnih delcev, sestavljenih iz proteina L1 humanega papiloma virusa 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Dan, popoldne; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Humani papilomavirus 16 Kapside posredujejo pri vstopu jedra med okužbo. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Zhou, J.; Doorbar, J.; Sonce, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identifikacija jedrnega lokalizacijskega signala proteina humanega papiloma virusa tipa 16 L1. Virologija 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Bioprocesiranje virusom podobnih delcev: izzivi in ​​priložnosti. Pharm. Bioproces. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Pozitivno nabite sekvence kapsidnih proteinov humanega papiloma virusa tipa 16 zadostujejo za posredovanje prenosa genov v ciljne celice prek receptorja heparan sulfata. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagawa, T.; Puško, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Sinteza in sestavljanje virusu podobnih delcev človeških papiloma virusov tipa 6 in tipa 16 v cepitvenem kvasu Schizosaccharomyces pombe. Virologija 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Proizvodnja virusu podobnih delcev humanega papiloma virusa tipa 16 v transgenih rastlinah. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

51. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Razširljiva proizvodnja proteina HPV16 L1 in VLP iz tobačnih listov. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Vila, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Proizvodnja virusu podobnih delcev humanega papiloma virusa tipa 16 L1 z rekombinantnimi celicami Lactobacillus casei. Appl. Okolje. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Visoko, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et al. Ocena toplotne stabilnosti zdravila Gardasil®. Hum. Cepivo. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Kvantitativni opis in vitro sestave delcev, podobnih virusu humanega papiloma virusa 16. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, MP; White, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Kvantitativno razstavljanje in ponovno sestavljanje virusu podobnih delcev humanega papiloma virusa tipa 11 in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

56. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Glavni kapsidni protein papilomavirusa L1 se sam sestavi v virusu podobne delce, ki so zelo imunogeni. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Proizvodnja imunogenih humanih papilomavirus-16 glavnih kapsidnih proteinov, pridobljenih virusu podobnih delcev. Indijski J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Ši, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Došna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stabilizacija delcev, podobnih virusu humanega papiloma virusa, z neionskimi površinsko aktivnimi snovmi. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identifikacija 16-specifičnega epitopa tipa humanega papilomavirusa na C-terminalni roki glavnega kapsidnega proteina L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Glavna nevtralizirajoča domena HIV-I je zelo imunogena, če je izražena na površini jedrnih delcev hepatitisa B. Vaccine 1993, 11, 817–824. [CrossRef]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. Človeška monoklonska protitelesa nenevtralizirajočega HIV-1 gp41 ovojnice grozda II kažejo polireaktivnost za vezavo na fosfolipide in proteinske avtoantigene. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

62. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; et al. Zakasnitev povratnega odziva HIV-1 po prenehanju protiretrovirusnega zdravljenja s pasivnim prenosom človeških nevtralizirajočih protiteles. Nat. med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Lowe, R.; et al. Korelacija med močjo miši in relativno močjo in vitro za delce, podobne virusu humanega papiloma virusa tipa 16, in vzorce cepiva Gardasil. Hum. Cepivo. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Napredek in izzivi pri razvoju cepiva proti HIV na osnovi rekombinantne Mycobacterium bovis BCG: pridobljena spoznanja. Expert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Morda vam bo všeč tudi