Fotosenzitivni nanosestavi predzdravil, ki vsebujejo kemoterapevtsko funkcijo mirovanja, krepijo imunoterapijo raka

Povzetek

Imunoterapija v kombinaciji z učinkovitimi terapevtiki, kot sta kemoterapija in fotodinamična terapija, je uspešna strategija za aktiviranje protitumorskih imunskih odzivov za izboljšano zdravljenje proti raku. Vendar pa razvoj večnamenskih biološko razgradljivih, biokompatibilnih, nizko toksičnih, a zelo učinkovitih in klinično dostopnih transformiranih nanoimunostimulantov ostaja izziv in je veliko povpraševanje. Tukaj poročamo in oblikujemo novo fotokemoterapevtsko nano-predzdravilo COS-BA/Ce6 NP brez nosilcev s kombiniranjem treh večnamenskih komponent, samosestavljene naravne majhne molekule betulinske kisline (BA), vodotopnega hitozanskega oligosaharida (COS), in nizko toksični fotosenzibilizator klorin e6 (Ce6) za povečanje protitumorske učinkovitosti imunoterapije raka, posredovane z imunskim adjuvantom proti PD-L1-. Pokazali smo, da so oblikovana nanozdravila imela pametno in značilno značilnost "mirovanja" v kemoterapevtskem učinku z želeno nižjo citotoksičnostjo in številne ugodne terapevtske lastnosti, vključno z izboljšano generacijo 1 O2, ki jo povzroča zmanjšana energijska vrzel Ce6, odzivnostjo na pH, dobro biorazgradljivostjo in biokompatibilnost, ki zagotavlja visoko učinkovito, sinergistično fotokemoterapijo. Poleg tega bi lahko v kombinaciji z anti-PD-L1 terapijo tako kemoterapija na osnovi nano-sestave kot kemoterapija/fotodinamična terapija (PDT) učinkovito aktivirala protitumorsko imunost pri zdravljenju primarnih ali oddaljenih tumorjev, kar bi odprlo potencialno privlačne možnosti za klinično imunoterapijo.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

KLJUČNE BESEDE

Imunoterapija raka; Nano-imunostimulanti; Kemoterapevtsko mirovanje; Pro-zdravilo; Samomontaža; Naravna majhna molekula; betulinska kislina; Fotodinamična terapija

1. Uvod

Imunoterapija raka, kot je strategija blokade imunske kontrolne točke z uporabo PD-L1 ali CTLA-4 za boj proti raku z aktiviranjem gostiteljevega imunskega sistema, je nedvomno spremenila zdravljenje raka1,2. Na žalost so šibek imunski odziv in neučinkoviti terapevtski učinki močno omejili njegove klinične možnosti3,4. Nedavno so trenutne študije pokazale, da lahko kombinacija imunoterapije z drugimi modalitetami, kot so kemoterapija5, fotodinamična terapija (PDT)6, fototermalna terapija (PTT)7 in radioterapija8, učinkovito sproži protitumorsko imunogenost tako, da spodbudi rakave celice k imunogeni celični smrti ( ICD)9, ki kaže na potencial imunske modulacije za aktiviranje protitumorskih imunskih odzivov. Številne inovativne zasnove nanomaterialov, ki temeljijo na teh sinergističnih kombinacijah strategij imunoterapije, so dosegle znatno izboljšano protirakavo delovanje, vključno z anorganskimi10, polimernimi11 in biomimetičnimi12 nanodelci (NP). Vendar pa razvoj večnamenskih biološko razgradljivih, biokompatibilnih, nizko toksičnih, a zelo učinkovitih in klinično dostopnih transformiranih nanoimunostimulansov ostaja velik izziv in veliko povpraševanje. Naravni biološki materiali, kot so nukleinske kisline 13, proteini 12, peptidi 14, 15 in majhni molekularni naravni izdelki 16, 17, so zaradi svojih inherentnih koristi (npr. biokompatibilnost, netoksičnost) pritegnili veliko raziskovalnega zanimanja za uporabo v medicini. Zlasti v zadnjih letih so bile zaporedoma odkrite bioaktivne terpenoidne naravne majhne molekule (NSM) proti raku, ki imajo funkcijo samosestavljanja 18, 19. Na primer, betulinska kislina (BA), ergosterol (ET) in abietinska kislina (AA) se lahko same sestavijo v mikronske ali nanostrukturirane delce. Ti NSM so privlačni gradniki za razvoj protitumorskih učinkovin za sinergistično kemoterapijo in PDT. Dokazano je, da imajo pomembne prednosti enostavne nano-izdelave, boljše biokompatibilnosti in biorazgradljivosti, manjše toksičnosti z zmanjšano poškodbo jeter in visokega sinergizma pri protitumorski terapiji20e23. To zagotavlja obetavne alternative za razvoj klinično dostopnih prevedljivih nano-imunostimulantov za sinergistično imunoterapijo. Vendar pa je na splošno močnejša lipofilnost teh NSM povzročila neučinkovito celično endocitozo, ki je oslabila njihovo protirakavo delovanje in omejila njihovo klinično vrednost za zdravljenje raka24. Podobno kot nanokompoziti, o katerih se pogosto poroča, so ustrezne nanoformulacije NSM spodbujale celični vnos za izboljšanje kemoterapevtskih učinkov, a tudi nenamerno povečale tveganje nespecifične citotoksičnosti za normalne celice22. Zato je vredno temeljito premisliti o tem, kako čim bolj povečati učinkovitost terpenoidnih nanoagentov NSM proti raku, hkrati pa zmanjšati njihovo toksičnost za normalno tkivo, kot ključno vprašanje v procesu sinergistične imunoterapije.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Strategije predzdravila so bile v veliki meri uporabljene za izboljšanje celičnega vnosa lipofilnih majhnih molekul s povečanjem hidrofilnosti25. Na splošno imajo amfifilna zdravila zlasti večjo učinkovitost celičnega privzema kot hidrofilna ali lipofilna zdravila26. Večja kot je celična fagocitoza, boljša je terapevtska učinkovitost24. Tako je lahko razvoj amfifilnih terpenoidnih NSM molekul predzdravil potencialna metoda za maksimiranje njihovih terapevtskih učinkov. Poleg tega so nanozdravila, ki se odzivajo na dražljaje na specifično tumorsko mikrookolje (npr. kislina, odzivnost na redoks), veliko obetavna za nadzor sproščanja zdravil, kar je koristno pri zatiranju citotoksičnosti kemoterapevtskih zdravil 27, 28. Medtem je bila supramolekularna sestava (npr. pristop ponovnega obarjanja) učinkovita strategija za pripravo visoko topnih v vodi nanozdravil brez nosilcev 22, 29, za katere bi lahko pričakovali, da bodo nekoliko zmanjšale učinkovitost fagocitoze amfifilnih NSM do neke mere in s tem oslabile njihovo predhodno načrtovana citotoksičnost. Domnevamo, da so bila na dražljaje odzivna in popolnoma hidrofilna nanozdravila nadalje vzpostavljena na podlagi predzdravila amfifilnih NSM in lahko učinkovito zavirajo njegovo nespecifično citotoksičnost za normalne celice, hkrati pa spodbujajo sproščanje zelo toksičnih amfifilnih NSM v tumorske celice, kar olajša njihovo mirovanje v normalnih tkivih in aktivacija na mestu tumorja. Pomembno je izbrati ustrezen prekurzor, topen v vodi in odziven na dražljaje, za modifikacijo terpenoidnih NSM za pripravo amfifilnih molekul predzdravil. Že leta imajo oligosaharidi hitozana (COS), kot razpadli produkti hitozana, dobro topnost v vodi in bogate skupine eOH oreNH2, ki vodijo k dobremu odzivu pH, ampak imajo tudi koristne protitumorske aktivnosti s krepitvijo gostiteljeve imunske funkcije z uravnavanjem aktivnosti imunskih celic, kot so monocitni makrofagi in limfociti30,31. Ti zagotavljajo ogromno možnost konstruiranja ciljnih nano imunostimulantov, ki se odzivajo na dražljaje, za sinergistično imunoterapijo.

Tu se na podlagi zgornjih premislekov v našem eksperimentalnem načrtu pentaciklični triterpenski NSM betulinske kisline (BA) uporablja kot močno sredstvo proti raku32, COS je bil uveden za sintetiziranje amfifilne molekule COS-BA za izboljšanje kemoterapevtskega učinka. Klorin e6 (Ce6), široko uporabljen fotosenzibilizator z zelo nizko/brez temne toksičnosti33, je bil uporabljen za izdelavo popolnoma vodotopnega fotosenzitivnega predzdravila COS-BA/Ce6 NP brez nosilcev z uporabo strategije neposrednega sosestavljanja. NP COS-BA/Ce6 združujejo dva terapevtska načina, kemoterapijo in fotodinamično terapijo (PDT), ki lahko učinkovito povečajo predstavitev antigenov, pridobljenih iz tumorja, celicam T, s čimer ustvarijo robustne imunološke odzive s pomočjo imunskega adjuvansa anti-PD-L1 povzroči visoko učinkovito in sinergistično protitumorsko kemoterapijo/PDT/imunoterapijo (Shema 1). Konstruirani NP-ji COS-BA/Ce6 so pokazali pametno funkcijo mirovanja z zahrbtnimi učinki kemoterapije, tj. neobsevani so-sestavljeni NP-ji so pokazali izjemno inhibirano in vitro citotoksičnost v primerjavi z amfifilnimi COS-BA, bodisi proti raku ali normalnim celicam. Ker se pripisuje značilnemu pH-odzivnemu vedenju, ima nizko toksičnost in biološko varnost za normalno tkivo in vivo, vendar je zelo toksičen za tumorsko tkivo zaradi stimulirajočega sproščanja hiperaktivnega COS-BA v šibko kislem tumorskem mikrookolju34. Kolikor nam je znano, trenutno še vedno redko poročajo o oblikovanih nano zdravilih, ki imajo to kemoterapevtsko funkcijo mirovanja. Medtem ima nanozdravilo več ugodnih terapevtskih lastnosti, kot je izboljšana generacija 1 O2 z zmanjšanjem energetske vrzeli (DEST) Ce6, hiter biološki metabolizem in povečano kopičenje tumorja, kar je vodilo do učinkovite in varne protitumorske kombinacije kemoterapije in zdravljenja s PDT. Še pomembneje je, da bi tako kemoterapija na osnovi NP kot sistemi kemoterapije/PDT lahko učinkovito aktivirali protitumorsko imunost z olajšanjem proliferacije CD8þ T celic, ki proizvajajo TNF-a in IFN-g, v primarnih ali oddaljenih tumorjih. Naše predlagano biološko razgradljivo, biokompatibilno, edinstveno mirujoče, biološko varno in visoko učinkovito fotokemoterapevtsko nanozdravilo dosega pomembne sistemske imunske terapevtske odzive, kar odpira privlačne možnosti za klinično uporabo pri zdravljenju zdravljenja oddaljenega ali metastatskega raka.

Shema 1 PDT in kemoterapija sočasno sestavljenih NP-jev COS-BA/Ce6 sta potencirala anti-PD-L1, da inducirata sistemsko protitumorsko imunoterapijo. Uvedba vodotopnega COS lahko učinkovito poveča kemoterapevtsko aktivnost BA (prikazano kot pol meča), kar povzroči hiperaktivno COS-BA amfifilno predzdravilo (dolg meč). Ko so bili sestavljeni s fotosenzibilizatorjem Ce6 (nožnica), so imeli lupinasto strukturirani in na pH občutljivi nano-sestavi pametno in značilno funkcijo "mirovanja" z inhibirano kemoterapevtsko toksičnostjo za normalna tkiva. Toda, ko je prispel in ga je spodbudilo kislo (Hþ) tumorsko mikrookolje, se bo sprostilo zelo aktivno amfifilno predzdravilo COS-BA, kar bo povzročilo pomembno kemoterapijo. Poleg tega so konstruirani ko-sestavi pokazali odlično aktivnost PDT z izboljšano generacijo singletnega kisika ( 1 O2), ki jo je povzročila zmanjšana energijska vrzel med singletnim in tripletnim vzbujenim stanjem (DEST) Ce6. V kombinaciji z blokado kontrolne točke proti PD-L1 lahko sproščanje s tumorjem povezanih antigenov po zdravljenju s kemoterapijo/PDT učinkovito aktivira sistemski protitumorski imunski odziv za imunoterapijo oddaljenega raka.

2. Materiali in metode

2.1. Sinteza COS-BA

Betulinska kislina (40 mg, 0.1 mmol), EDC (38 mg, 0.2 mmol) in NHS (17 mg, 0.15 mmol ) smo raztopili v 3 mL N,N-dimetilformamida (DMF). Po mešanju pri sobni temperaturi 30 min smo v zmes nežno po kapljicah dodali 96 mg vodne raztopine COS (1 ml) in mešali 24 ur. Nato smo reakcijsko zmes razredčili s CH2Cl2 in večkrat ekstrahirali. CH2Cl2 plast smo uparili in očistili na koloni silikagela. Nereagirano BA smo najprej odstranili z uporabo petroletra: acetona (5:1, v/v) kot eluenta in nato spremenili na 3:1, da smo dobili beli COS-BA (izkoristek: 42 %), kjer je bil COS identificiran kot dimer ( n Z 2). 1H NMR (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDC13) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32,44.11, 41.85, 40.59, 38.68, 38.55, 37.32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M–6H] (C44H72N2O12).

2.2. Priprava COS-BA/Ce6 NP

So-sestavljeni COS-BA/Ce6 NP so bili pripravljeni z enostopenjsko metodo ponovnega obarjanja. Običajno je bilo najprej zmešanih 5 mL raztopine Ce6 (33 mmol/L) in 40 mL COS-BA (33 mmol/L) DMSO. Nato smo zmes hitro vbrizgali v 1 ml vode, ki je vsebovala 10 ml NaOH (50 mmol/L) pod ultrazvokom (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Kitajska). Po 10-minutni ultrazvočni obdelavi smo COS-BA/Ce6 NP pridobili s centrifugiranjem pri 13,000 rpm (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Kitajska) 25 minut. Druge formulacije z različnimi razmerji COS-BA proti Ce6 smo pripravili po istem postopku s konstantnim molskim razmerjem NaOH proti Ce6 3:1.

2.3. Celične linije

Človeške celične linije MCF-7, HepG2, LO2 in mišje 4T1, L929 zagotavlja Inštitut za biokemijo in celično biologijo, SIBS, CAS (Kitajska). MCF-7, HepG2 in LO2 smo gojili v gojišču DMEM z 10 % fetalnega govejega seruma (FBS, Gibco) in 1 % penicilin-streptomicinskega antibiotika (Life Technology, ZDA) pri 37 C. 4T1 in L929 smo gojili v RMPI-1640 medij z enakim razmerjem kot zgoraj.

2.4. Študije celičnega privzema in endocitnih poti

Za preiskavo celičnega privzema smo celice 4T1 ali LO2 inkubirali s prostimi Ce6 ali COS-BA/Ce6 NP (ekvivalentna koncentracija Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/ml) za različne čase. Po izpiranju, fiksiranju in obarvanju z DIPA (#D9542, Sigma) smo celice slikali pod fluorescenčnim invertnim mikroskopom (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Kitajska). Intenzivnost fluorescence je bila določena s pretočno citometrijo z uporabo mini sistema Guava EasyCyte (Merck Millipore, Nemčija). Za kvantifikacijo učinkovitosti privzema smo celično kopičenje BA in COS-BA izmerili s HPLC (Agilent 1200, ZDA). Običajno so bile celice 4T1 obdelane s prostim COS-BA ali BA (ekvivalent BA: 25 mg/mL) 0,5 in 3 ure. Po izpiranju s PBS smo celične pelete pobrali in podvrgli ultrazvočni homogenizaciji (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Kitajska) za celično lizo. Nato smo COS-BA ali BA ekstrahirali s kloroformom za analizo HPLC po liofilizaciji vzorcev. Mobilna faza je bila voda (0,2 % fosforne kisline) in acetonitril pri pretoku 1,0 ml/min, ustrezna volumska razmerja pa so bila 60:40 oziroma 15:85 (v/v) za analizo COS-BA oziroma BA. . Valovna dolžina detekcije je bila 213 nm. Za raziskavo endocitnih poti NP COS-BA/Ce6 smo celice 4T1 zasejali v 6-plošče z vdolbinicami in jih inkubirali 24 ur, preden smo jih 30 minut predhodno obdelali z različnimi zaviralci endocitoze, vključno z zaviralcem mikropinocitoze [50 mmol/L , etil izopropil amilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], s klatrinom posredovan zaviralec endocitoze [20 mmol/L, klorpromazin (#C7010, Solarbio)], s caveolae posredovan zaviralec endocitoze [25 mmol/L, nistatin ( #IN0260, Solarbio)] in zaviralec zakisljevanja lizosomov [50 mmol/L, klorokin fosfat (#C9720, Solarbio)]35. Nato smo celice 2 uri gojili z 2 ml COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL) in jih slikali pod FIM (UP Optotech). Celice, inkubirane brez endocitnega inhibitorja pri 37 °C, so bile nastavljene kot kontrolne in pri nizkotemperaturni inkubaciji (4 °C) za oceno endocitoze, odvisne od energije. Medtem smo s pretočno citometrijo določili tudi srednjo intenzivnost fluorescence celic.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

2.5. Test citotoksičnosti

Celice 4T1 smo zasejali v 96-ploščo z vdolbinicami. Nato so bile celice 24 ur obdelane z različnimi koncentracijami COS-BA NP. Nato smo v vdolbino dodali 10 mL barvila MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/mL) in inkubirali dodatne 4 ure, nato pa dodali 150 mL DMSO, da smo raztopili kristale formazana . Absorbanco vsake vdolbinice pri 492 nm smo zabeležili z čitalcem mikroplošč. Za obsevano skupino so bile celice 4 ure obdelane z zdravili, nato 10 minut obsevane s 675  10 nm svetlobo in inkubirane dodatnih 20 ur. Citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP (1 mg/mL Ce6 ustreza 11,5 mg/mL COS-BA in 6,4 mg/mL BA) proti drugim celicam (MCF-7, HepG2, LO2 in L929) so bili prav tako določeni z istim testom MTT le z drugačnim medijem. Medtem je bil indeks kombinacije izračunan s programsko opremo CompuSyn 2.0 z uporabo izračuna izreka Chou Talalay36.

2.6. Živalski modeli

Vsi eksperimentalni postopki so bili izvedeni v skladu s protokoli, ki jih je odobril Odbor za nego in uporabo živali Harbinske medicinske univerze. Celice 4T1 smo suspendirali v mediju RMPI-1640 in subkutano injicirali v desni zadnji del vsake samice miši BALB/c (18-22 g, stare 6-7 tednov).

2.7. In/ex vivo fluorescenčno slikanje

200 ml COS-BA/Ce6 NPs 5 % raztopine glukoze (ekvivalent Ce6: 0,35 mg/mL, COS-BA: 4,02 mg/mL) je bilo injicirano skozi repno veno mišem, ki so nosile tumor. Po tem je bilo izvedeno fluorescenčno slikanje tumorskih mest ob vnaprej določenem času z uporabo večmodelnega sistema za slikanje živali AniView 100/600 in vivo (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Kitajska) z vzbujanjem pri 630 nm. Po 24 urah po injiciranju so glavne organe (srce, jetra, vranico, pljuča in ledvice) in tumor zbrali za ex vivo fluorescenčno slikanje. Poleg tega so bile ovrednotene tudi ex vivo fluorescenčne slike tumorjev in glavnih organov v različnih časih po iv injekcijah Ce6 ali COS-BA/Ce6 NP.

2.8. In vivo kemoterapija/PDT

Miši, ki nosijo 4T1- (75e100 mm3 ), so naključno razdeljene v šest skupin (n Z 5): 1) 5 % raztopina glukoze; 2) Ce6; 3) Ce6 z obsevanjem; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, kjer je BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP; 6) COS-BA/Ce6 NP z obsevanjem. Za vsako skupino miši vbrizgamo 200 ml COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 3,5 mg/kg telesa) skozi repno veno 0., 2. in 4. dan. Za skupine obsevanja po 4 urah po injiciranju po vsakem dajanju so bile vse miši anestezirane z izofluranom, mesta tumorja pa 15 minut obsevana s 675  10 nm (150 mW/cm2) svetlobo. Volumen tumorja in telesno maso miši beležimo tudi vsak drugi dan. Volumen tumorja se izračuna po formuli: VZ širina2 dolžina/2. Po 14 dneh zdravljenja so bili tumorji izrezani in ponderirani za izračun tumorskega inhibicijskega razmerja (TIR) ​​po običajno uporabljeni enačbi: TIRZ (1 vzorec/kontrola) 100 %. Pri čemer sta bila vzorec in kontrola povprečna masa tumorja vsake zdravljene skupine oziroma skupine s 5 % vodno raztopino glukoze.

2.9. In vivo kemoterapija/PDT/imunoterapija

Za prikaz potenciala COS-BA/Ce6 NP v kombinaciji z imunoterapijo je bil dvostranski model tumorja zasnovan s subkutano injekcijo celic 4T1 v levi in ​​desni bok. Ko so se tumorji približali 75e100 mm3, so miši razdelili v pet skupin. (1) nadzor; (2) COS-BA/ Ce6 NP (COS-BA Z 40,2 mg/kg, kjer je BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ svetloba; (4) COS-BA/Ce6 NP þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PD-L1 þ svetloba. Na dan 0 so miši intravensko injicirali 200 ml 5 % raztopine glukoze (skupina 1) ali COS-BA/Ce6 NPs (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (skupina 2, 3, 4, 5). Po 4 urah po injiciranju so bili desni tumorji skupin 3 in 4 obsevani 15 minut. Miši so bile anestezirane z izofluranom in valjane na eni strani, da bi se izognili izpostavitvi levih tumorjev. Nato smo protitelesa proti PD-L1 (BioXcell, številka izdelka: BE0101, številka klona: 10F.9G2) ivjicirali miši za skupini 4 in 5 2., 4. in 6. dan (15 mg na miš na injekcijo). Dolžino in širino vsakega tumorja smo spremljali vsak drugi dan. Po 14 dneh zdravljenja smo zbrali krvni serum miši za oceno interferona gama (IFN-g) (#KMC4021) in faktorja tumorske nekroze (TNF-a) (#BMS607-3) z uporabo testa ELISA (eBioscience ). Tumorje smo zbrali, disociirali, obdelali s pufrom za lizo rdečih krvnih celic in s centrifugiranjem sprali s PBS. Nato smo celično suspenzijo obarvali z anti-CD3-FITC (#MA1-10187, klon 145-2C11, eBioscience) in anti-CD8a-PE (#12-0081-85, klon 53-6.7, eBioscience). Nato je bila infiltracija citotoksičnih limfocitov T (CTL) v desnem in levem tumorju po različnih zdravljenjih ovrednotena s pretočno citometrijo.

3. Rezultati in razprava

3.1. Sinteza, izdelava in karakterizacija COS-BA/Ce6 NP

V tej študiji oblikujemo novo predzdravilo z majhno molekulo COS-BA na osnovi vodotopnega hitozanskega oligosaharida (COS), ki lahko poveča kemoterapevtsko aktivnost pentaciklične triterpenske betulinske kisline (BA) z izboljšanjem privzema celic s povečanjem hidrofilnosti. COS (stopnja polimerizacije, DP: 2e6), uporabljena tukaj, je bila pripravljena z našo prej opisano metodo30. Nato je bil COS-BA sintetiziran z reakcijo dehidracijske kondenzacije. V kombinaciji z analizo glavne komponente COS se je domnevalo, da je kemijska struktura COS-BA disaharid (DP:2) modificiran BA (podporne informacije, slika S1), kar je bilo potrjeno z 1H NMR, 13C NMR in ESIeMS (Slike podpornih informacij S2eS4). Analiza reprezentativnega 1H NMR je pokazala izrazit protonski signal COS okoli 2,64e3,93 ppm in vrhove C]CH2 (4,60, 4,73 ppm) BA, kar kaže na uspešno sintezo COS-BA (slika 1A). Za pripravo sestavljenega sinergističnega protitumorskega reagenta COS-BA/Ce6 NPs je bil uporabljen vsestranski pristop ponovnega obarjanja s sodelovanjem z visoko učinkovitim fotosenzibilizatorjem Ce6. S spremembo začetnih molskih razmerij lahko obe formulaciji za sosestavljanje COS-BA/Ce6 tvorita sferične nanostrukture z moduliranimi velikostmi (slika 1B in podporne informacije, slika S5). V različnih vhodnih razmerjih COS-BA/Ce6 so bili hidrofilni premeri COS-BA/Ce6 NP blizu 200e300 nm z negativnim z-potencialom. Glede na to, da so NP, pripravljeni v formulaciji 8:1, pokazali nižji indeks polidisperznosti (PDI, 0,143) z relativno manjšo velikostjo (249 nm), je bila za kombinatorno zdravljenje potrebna tudi zadostna količina kemoterapevtika COS-BA. Zato smo za naslednjo študijo izbrali formulacije COS-BA/Ce6 (8:1). Pri tej optimizaciji so NP-ji COS-BA/Ce6 pokazali ozko porazdelitev velikosti (slika 1C) in dobro topnost v vodi, kar kaže na njihovo koloidno naravo (slika 1D). Da bi raziskali razloge za to uspešno sosestavljanje, je bilo primarno samosestavljanje prostega COS-BA raziskano z uporabo vrstične elektronske mikroskopije (SEM) (slika 1E), kar je nakazovalo, da bi COS-BA lahko tvoril zelo enotno nano- sfero w168 nm, kar pomeni, da kemična modifikacija COS ne spremeni sposobnosti samosestavljanja BA (podporne informacije, slika S6). To je tista lastnost, ki sčasoma povzroči uspešno gradnjo sosestavov. Poleg trdne nanostrukture, potrjene s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), so NP-ji COS-BA/Ce6 pokazali izrazito NP-je COS-BA brez strukture lupine, povprečna debelina lupine pa je bila približno 2,35 nm. Druga fizikalno-kemijska karakterizacija je povzeta na sliki 1F. Poleg tega so NP-ji COS-BA/Ce6 pokazali negativni z-potencial 5,38 mV in hidrodinamično velikost w249 nm, večjo od tiste, pridobljene s SEM (w182 nm). Hkrati sta bili učinkovitosti nalaganja in kapsulacije Ce6 8,1 oziroma 96%, kot je bilo ugotovljeno s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Podatki FT-IR (slika 1G) so dodatno potrdili to so-sestavljanje, ker so COS-BA/Ce6 NP pokazali značilne C]N, CeN in C]CH vrhove Ce6, ki so se pojavili pri 1633, 1078 in 633 cm 1 , oz.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

3.2. Sestavljeni mehanizem in oblikovanje strukture lupine

Kasneje smo za boljše razumevanje mehanizma so-sestavljanja najprej raziskali primarni proces tvorbe NP. Ugotovili smo, da je so-sestavljanje COS-BA s Ce6 lahko spontano, ker lahko ti dve vrsti tvorita sferično nanostrukturo tudi brez sonikacije (podporne informacije, slika S7), kar je lahko posledica negativne Gibbsove spremembe proste energije (DG ) v sozborih37. Ta spontana sestava je nakazovala tudi močnejšo medmolekularno interakcijo med COS-BA in Ce6. Na splošno so medmolekularne interakcije v supramolekularnih lastnih (ali ko-) sklopih nekovalentno p‒p-zlaganje, vodikove vezi in van der Waalsove sile 38,39. Za to analizo smo nato raziskali UV absorpcijo COS-BA/Ce6 NP (sl. 1H in F), kar je nakazovalo rdeče zamaknjena pasova Soret (410 nm) in Qy (667 nm) v primerjavi z prosti Ce6 (405 oziroma 665 nm). Medtem je mogoče najti tudi pomembno rdeče premaknjeno značilno absorpcijo COS-BA, kar kaže na možno medmolekularno zlaganje pp med COS-BA in Ce640. Poleg tega so po inkubaciji s površinsko aktivno snovjo natrijev dodecil sulfat (SDS, 0,2 % m/v) (podporne informacije, slika S8) NP-ji COS-BA/Ce6 pokazali na novo modro premaknjen pas Qy pri 641 nm in dramatično obnovili fluorescenco, kar dokazuje da so hidrofobne interakcije prispevale tudi k so-sestavitvi28. Ker so te asociativne nekovalentne interakcije, so sestavi pokazali izjemno dušenje fluorescence (98,2 %) v vodi (slika 1I). Skupaj je razumno verjeti, da so zlaganje p‒p in hidrofobne interakcije lahko glavne gonilne sile za konstrukcijo ko-sestavov. Nato smo za nadaljnjo vizualizacijo postopka sestavljanja bolj intuitivno in razkrili osnovne razloge, zakaj se lahko tvorijo lupinasto strukturirane NP, izvedli poenostavljen simulacijski model molekularne dinamike (MD), ki vsebuje 16 optimiziranih molekul COS-BA in dodatni dve Ce6 v vodni škatli . Na začetku smo ovrednotili možno interakcijo/vezavo samosestavov COS-BA v 5 ns časa simulacije (slika 2A in podporne informacije, slika S9). Ugotovili smo, da je razen številnih intramolekularnih vodikovih vezi v frakciji COS mogoče opaziti tudi več parov medmolekularnih H-vezi med COS-BA (slika 2B in podporne informacije, slika S10), kar kaže, da je lahko vodikova vez ena od glavnih gonilnih sil za oblikovanje NP COS-BA. Še posebej zanimivo je, da v samosestavitvah COS-BA vse molekule COS-BA tvorijo očitno simetrično strukturo (slika 2C). Ta fascinanten pojav nas je motiviral, da smo raziskali možno razmerje med to lastnostjo in tvorbo lupinasto strukturiranih COSBA NP. Nato smo poskušali razširiti enote škatle. Presenetljivo so bile povezane škatle, sestavljene iz molekul COS-BA, razporejene na pravilen način, kar je povzročilo "ortogonalne" votle mrežne strukture (podporne informacije, slika S11). Še pomembneje, naključno smo izračunali debelino lupinskih molekul in ugotovili, da so skladne s TEM (w2,35 nm) (slika 2D). Ta težnja po oblikovanju votlih mrežnih struktur je lahko odgovorna za nastanek lupinasto strukturiranih NP. Da bi preizkusili to idejo, je bila simulirana struktura MD ko-sestavov COS-BA/Ce6 (slika 2E in podporne informacije, slika S12). Podobno kot pri samosestavitvah COS-BA je bilo tudi v sosestavitvah najdenih veliko število intramolekularnih in medmolekularnih H-vezi (slika 2F in podporne informacije, slika S13). Poleg tega je bilo možno zlaganje pp med C]C COS-BA in aromatskim obročem Ce6 opaženo v ko-sestavih (slika 2G), kar je skladno s podatki iz prejšnjih UV preiskav. Po razširitvi števila škatel je še vedno mogoče najti podobne votle mrežne strukture, le z zmanjšano pravilnostjo in ortogonalnostjo (podporne informacije, slika S14). To je lahko možen razlog za neenotno morfologijo NP COS-BA/Ce6 v primerjavi z NP COSBA. Poleg tega je molekularna razdalja lupina-plast tudi blizu debeline lupine (w2,35 nm) NP, kot je razvidno z uporabo TEM (slika 2H). Skupaj smo špekulirali, da bi lahko nastanek lupinasto strukturiranih COS-BA/Ce6 NP ali COS-BA NP v veliki meri pripisali tej težnji molekul, da se sestavijo v mreže votlih lupin.

Slika 1 Izdelava in karakterizacija nanosestavov COS-BA/Ce6 NP, ki jih posreduje predzdravilo, modificirana betulinska kislina (COS-BA), modificirana z oligosaharidi hitozana. (A) Ojačani ključni položaji 1H NMR COS-BA. (B) Priprava so-sestavljenih COS-BA/Ce6 NP z različnimi razmerji COS-BA/Ce6. (C) Porazdelitev velikosti COS-BA/Ce6 NP z uporabo COS-BA in Ce6 (molarno razmerje, 8:1) kot gradnikov. (D) Topnost v vodi in Tyndallov učinek ko-sestavov kažeta na koloidno naravo. (E) Slike SEM in TEM prostih samosestavov COS-BA in sosestavljenih NP-jev COS-BA/Ce6. (F) Povzetek fizikalno-kemijskih lastnosti COS-BA/Ce6 NP. (G) FT-IR spektri, (H) UV Vis spektri in (I) spektri fluorescenčnih emisij prostega Ce6, COS-BA in so-sestavljenih COS-BA/Ce6 NP v vodi.

Slika 2 Strukture (A) samosestavljenih COS-BA in (E) sosestavljenih COS-BA/Ce6 NP po simulaciji molekularne dinamike (MD) za 5 ns z molskim razmerjem strukturne enote 8:1 (COS-BA /Ce6, izračunano na podlagi učinkovitosti obremenitve Ce6). Linijski model je bil uporabljen za H2O, palični modeli pa predstavljajo molekule COS-BA ali Ce6, kjer so atomi C Ce6 označeni z vijolično. Informacije o vodikovi vezi med molekulami COS-BA v (B) njenih samosestavitvah in (F) sosestavitvah COS-BA/Ce6 NP. (C) Navidezno simetrična struktura molekularne razporeditve COS-BA po simulaciji MD. (G) Možne molekularne interakcije med COS-BA in Ce6 kažejo potencialno zlaganje pp. Navedena debelina lupinskih molekul v "ortogonalni" votli mrežni strukturi po razširitvi ustreznih polj MD (D) prostih samosestavov COSBA in (H) sosestavov COS-BA/Ce6 NP.

3.3. Energijski mehanizem povečane generiranja 1 O2

Nato smo nadalje preučili nastajanje singletnega kisika (1 O2), ene od kritičnih reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) delovanja PDT z uporabo DPBF (1,3-difenilizobenzofurana) kot sonde. Po dolgotrajnem obsevanju mešanic raztopin COS-BA/Ce6 NP z DPBF se je UV absorpcija DPBF zmanjšala po intenzivnosti, kar kaže na 1 generacijo O2 (slika 3A). Po primerjavi z referenco metilen modrega (MB) je bil F ( 1 O2) COS-BA/Ce6 NP izračunan kot 0.26, nekoliko višji od prostega Ce6 (FZ0.19) (slika 3B). Na splošno bo energija, ki jo absorbirajo fotosenzibilizatorji, podvržena trem sprostitvenim potem, ki vključujejo fluorescenco, učinek segrevanja prek vibracijske sprostitve in generiranje ROS prek medsistemskega prehoda (ISC)41. V skladu z znatno ugasnjeno emisijo fluorescence tudi COS-BA/Ce6 NPs niso spodbujali nobenega učinka segrevanja v vodi (podporne informacije, slika S15), kar je impliciralo izboljšan proces ISC po sosestavitvi Ce6 s COS-BA, kar je vodilo do izboljšane 1 generacije O2. Za nadaljnjo razjasnitev molekularnega mehanizma takega učinka smo poskušali optimizirati in izračunati možni enomolekulski model COS-BA/Ce6, ki je sestavljen iz potencialnega zlaganja pp, pridobljenega s simulacijo MD s teorijo funkcij gostote (DFT) (slika 3C) . Presenetljivo je, da je COS-BA/Ce6 pokazal opazno UV-absorpcijo z rdečim zamikom 581,24 nm kot absorpcija prostega Ce6 (579,30 nm), kar kaže na pojav zlaganja pp (slika 3D). Čeprav je energijsko minimizirana geometrija COS-BA/Ce6 pokazala rahle strukturne razlike z vneseno konfiguracijo MD, je bilo še vedno mogoče opaziti značilno zlaganje p med vezmi C]C ali C]O COS-BA s porfinskim obročem Ce6, kar dodatno potrjuje, da nad p‒p je možno zlaganje. Medtem je bilo nedavno dokazano, da bi lahko povečana učinkovitost doniranja elektronov z zlaganjem p-p olajšala proces ISC42, medtem ko je stopnja ISC (KISC) sorazmerna z (1/DEST) 2,43. To pomeni, da bo nižja energijska vrzel (DEST) fotosenzibilizatorja izboljšala proces ISC in spodbujala učinkovito generiranje ROS. Nato izračunamo najnižje vzbujeno singletno stanje (S1) in tripletno stanje (T1) Ce6 oziroma COS-BA/Ce6 (slika 3E). Rezultati so pokazali, da je COS-BA/Ce6 pokazal zmanjšan DEST za 1,1892 eV v primerjavi s prostim Ce6 (1,2001 eV), kar potrjuje izboljšan proces ISC. Zmanjšanje DEST je koristno za proizvodnjo O2, kar je bilo preverjeno tudi pri drugih nanofotosenzibilizatorjih44. Skupaj se zdi, da p-zlaganje zmanjša DEST Ce6 po sosestavitvi s COS-BA, kar vodi do izboljšane 1 generacije O2.

Slika 3 Energijski mehanizem izboljšanega nastajanja 1 O2, induciranega z NP COS-BA/Ce6. (A) UV Vis spektri fotorazgradnje 1,3-difenilizobenzofurana (DPBF) po dolgotrajnem obsevanju COS-BA/Ce6 NP. (B) V grafih prvega reda sprememb UV absorpcije DPBF (DOD) je bil izkoristek 1 O2 ovrednoten z uporabo metilen modrega (MB) (FZ 0.52) v DMSO kot referenčne spojine. (C) Strukture z minimalno energijo možnega enomolekulskega modela COS-BA/Ce6, gledanega s strani in spredaj, ki je bil pridobljen glede na začetno molekularno konfiguracijo med Ce6 in COS-BA po simulaciji MD in po izračunih DFT. (D) Predvideni prehodi absorpcijskih spektrov UV Vis (navpične črte) prostega Ce6 in optimiziran model COS-BA/Ce6. (E) Izračunane ravni energije njihovega najnižjega vzbujenega singletnega stanja (S1) oziroma najnižjega tripletnega stanja (T1), [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Pri čemer je bil DEST izračunan kot ES1 ET1.

3.4. Značilnosti mirovanja pri kemoterapiji

Nato za potrditev koncepta zasnove v tej študiji, da bi razvoj amfifilne molekule COS-BA lahko učinkovito povečal terapevtski učinek BA z izboljšanjem privzema celic s povečanjem hidrofilnosti in medtem nadaljnjim izgradnjo na dražljaje odzivnega in popolnoma hidrofilnega COS-BA/Ce6 NP so olajšali njegovo mirovanje v normalnih tkivih in aktivacijo na mestih tumorja. Da bi preizkusili to hipotezo, smo najprej raziskali obnašanje sproščanja zdravila COS-BA/Ce6 NP v različnih puferskih raztopinah (slika 4A). Rezultati so pokazali, da so COS-BA/Ce6 NP pokazali pH-odzivno obnašanje s kumulativnim sproščanjem Ce6 88 % pri pH 5,6 oziroma 57 % pri pH 7,4 po 24 urah. Ta značilnost je verjetno nastala zaradi uničenja številnih vodikovih vezi, ki so obstajale v COS-BA/Ce6 NP po uvedbi kislega Hþ45, kar je povzročilo povečano sproščanje Ce6 (slika 4B). To je bilo nadalje potrjeno z razstavljanjem COS-BA/Ce6 NP po neposredni inkubaciji v kislem okolju (slika 4C). Ta lastnost, ki se odziva na pH, je lahko koristna za učinkovito protitumorsko terapijo zaradi šibko kislega tumorskega mikrookolja34. Medtem so imeli NP-ji COS-BA/Ce6 boljšo stabilnost, ker po 10-dnevni inkubaciji v mediju celične kulture PBS in 1640-RMPI ni bilo mogoče opaziti pomembnih sprememb velikosti ali PDI (podporne informacije, slika S16), kar bi bilo pomembno za njihovo morebitno uporabo za nadaljnje biomedicinske aplikacije. Nato so bile izvedene nadaljnje preiskave z vrednotenjem citotoksičnosti prostega lipofilnega BA (kontaktni kot q: 133,3 ) in amfifilnega COS-BA (q: 52 ) (slika 4D) s standardnimi testi metil tiazolil-difenil tetrazolijevega bromida (MTT). Kot je bilo predvideno, bodisi za rakave celice 4T1 bodisi za normalne hepatocite LO2 posamezni COS v bistvu nima protirakavega delovanja pri relativno nizkih odmerkih. To je lahko posledica protiproliferacijskih učinkov COS, ki se aktivira prek induciranja signalne poti NF-kB samo pri visokih koncentracijah (približno na ravni miligrama)30. Medtem ko ima COS-BA izjemno povečano citotoksičnost z izjemno nizkimi vrednostmi IC50 (6,03 mg/mL za 4T1 in 9,92 mg/mL za LO2) v primerjavi z vrednostmi BA (17,63 mg/mL za 4T1 in 20,53 mg/mL za LO2) celo pri enakih masnih koncentracijah (sl. 4E in J). Izzvani rezultati so pokazali, da modifikacija vodotopnega COS močno poveča učinkovitost celičnega privzema lipofilne BA, kar vodi do močne protirakave aktivnosti COS-BA. Za količinsko opredelitev učinkovitosti privzema je bilo kopičenje BA ali COS-BA v celicah 4T1 neposredno določeno s HPLC (podporne informacije, slika S17). Rezultati so jasno potrdili, da ima amfifilni COS-BA znatno večji vnos kot prosti BA (približno 3.6-krat po 3 urah inkubacije), kar dokazuje izboljšano kemoterapevtsko aktivnost COS-BA. Zgornji sklep je bil dodatno podprt z znatno izboljšano citotoksičnostjo amfifilnega COSBA proti rakavim celicam HepG2 in MCF-7 (podporne informacije, slika S18), ki so dobro skladne s konceptom zasnove. Po so-sestavitvi s Ce6 smo ugotovili, da COS-BA/Ce6 NP brez obsevanja kažejo izjemno inhibirano citotoksičnost proti rakavim celicam 4T1 v primerjavi z enakovrednim COS-BA, zlasti pri 11,5 mg/mL, vendar osnovna aktivnost PDT ni bila prizadeta ( Slika 4F). Da bi v celoti potrdili ta pojav, smo nadalje raziskali in vitro citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP proti drugim rakavim celicam, vključno z MCF-7 in HepG2. Zanimivo je, da je amfifilni COS-BA pokazal zelo močnejšo citotoksičnost proti celicam MCF-7 (slika 4G), vendar se je kemoterapevtska aktivnost znatno zmanjšala po so-sestavitvi s Ce6, tj. neobsevanimi COS-BA/Ce6 NP. Podobne rezultate so opazili tudi v celicah HepG2 le z rahlim zmanjšanjem (slika 4H). Da bi dodatno podprli zgornje zaključke, smo ocenili tudi kemoterapevtske učinke nano-sklopov in COS-BA proti normalnim mišjim fibroblastnim celicam L929 in človeškim hepatocitom LO2 (slika 4I). Rezultati so pokazali, da so sestavljeni COS-BA/Ce6 NP znatno zmanjšali prvotno zelo toksično amfifilno zdravilo COS-BA, kar je pokazalo odlično biokompatibilnost. Z analizo citotoksičnosti so bile vrednosti IC50 amfifilnega COS-BA znatno nižje od vrednosti sočasno sestavljenih COS-BA/Ce6 NP, ne glede na rakave ali normalne celice (slika 4J). To pomeni, da lahko izdelava popolnoma hidrofilnih in na dražljaje odzivnih nano sestavov vnaprej učinkovito zatre visoko citotoksičnost amfifilnega zdravila COS-BA. Glede na značilno lastnost, ki se odziva na pH, se zdi, da bodo NP COS-BA/Ce6 mirujoči v normalnih tkivih z želeno nizko toksičnostjo kemoterapije, vendar aktivni v tumorskih tkivih zaradi njihovega stimulirajočega sproščanja zelo toksičnega COS-BA v šibko kislem tumorju mikrookolje. Skupaj, za razliko od široko poročane neofunkcionalizacije kemoterapevtskih reagentov, ki imajo povečano protirakavo delovanje 22, 23, amfifilni nano-sestavi, ki jih posreduje COS-BA, ne kažejo le pametne značilnosti "mirovanja" z zahrbtnimi učinki kemoterapije, ampak tudi ohranjajo specializirano aktivnost PDT, kar kaže ogromen potencial za pametno protitumorsko terapijo.

Slika 4 (A) In vitro profili sproščanja Ce6 iz COS-BA/Ce6 NP v PBS (pH 7,4, 6,5 ali 5,6), ki vsebuje Tween 80 (0,5%, v/v) pri 37 C. (B) Možen pH-odzivni mehanizem, ki Hþ sproži razstavljanje NP. (C) Razstavljanje NP COS-BA/Ce6 po neposredni inkubaciji v vodi s približno pH 4.0. (D) Kontaktni kot prostih BA, Ce6, COS-BA oziroma COS-BA/Ce6 NP. (E) Celična citotoksičnost prostega BA, COS in amfifilnega COS-BA proti reprezentativnim rakavim 4T1 in normalnim celicam LO2. Preživetje celic (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 rakavih celic po inkubaciji s prostimi COS-BA, COS-BA/Ce6 NP z/brez obsevanja pri navedeni ekvivalentni koncentraciji COS-BA za 24 ur. (I) Celična citotoksičnost prostih COS-BA, neobsevanih COS-BA/Ce6 NP proti normalnim celicam LO2 in L929. (J) IC50 analiza COS-BA proti raku in normalnim celicam. Podatki so izraženi kot srednje vrednosti SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0,01 in ***P ˂ 0,001 kažejo pomembne razlike.

Da bi raziskali možne razloge za to značilnost mirovanja kemoterapije, je bilo časovno odvisno celično privzemno obnašanje COS-BA/Ce6 NP zaporedno ocenjeno z inkubacijo z rakavimi celicami 4T1. Rezultati so pokazali, da čeprav so COS-BA/Ce6 NP-ji pokazali izjemno dušenje fluorescence, so še vedno pokazali povečano fagocitno učinkovitost v primerjavi s prostim Ce6 zaradi močnejše citoplazemske rdeče fluorescence, kot je bilo ugotovljeno s kvantitativno analizo pretočne citometrije (slika 5A). To izboljšano celično internalizacijo NP lahko pripišemo endocitozi21. Skupaj smo špekulirali, da čeprav visoko vodotopni ko-sestavi COS-BA/Ce6 NP (kontaktni kot q: 36,7) kažejo izboljšano celično endocitozo kot lipofilni Ce6 (q: 132,6, blizu BA), je zmanjšana učinkovitost fagocitoze NP-ji se lahko pojavijo v primerjavi z amfifilno molekulo COS-BA, kar kaže na zatiranje kemoterapevtske citotoksičnosti NP-jev COS-BA/Ce6. To pomeni, da je učinkovitost privzema celice od visoke do nizke kot takšno zaporedje: amfifilni COS-BA, hidrofilni COS-BA/Ce6 NP, lipofilni BA ali Ce6. Še pomembneje je, da je neustrezna razgradnja celičnih NP lahko še en pomemben razlog za oslabljen kemoterapevtski učinek, ki je lahko povezan s pametnim mirovanjem kemoterapije COS-BA/Ce6 NP. Poleg tega, ker je bila razgradnja NP posebej izvedena v kislem okolju tumorskih celic, da bi dokazali pH-odzivnost, smo nadalje poskušali primerjati učinke privzema COS-BA/Ce6 NP v normalnih celicah LO2 (slika 5B) . Vendar NP COS-BA/Ce6 niso pokazali bistveno inhibirane rdeče fluorescence Ce6 v celicah LO2. V nasprotju s tem je bilo obnašanje privzema LO2 podobno kot pri rakavih celicah 4T1, kar kaže na to, da se NP COS-BA/Ce6 lahko razgradijo tudi v normalnih celicah, kar je lahko posledica šibko kislega pH znotrajceličnih predelkov (endosomov/lizosomov), ki obstajajo v notranjosti. tako rakavih kot normalnih celic46. Ker je celični vnos NP odvisen od procesa endocitoze, neposredna inkubacija zdravila morda ne bo poudarila pH-odzivnosti NP COS-BA/Ce6 na celični ravni. Kljub temu je tumorsko mikrookolje (TME) zelo kislo v primerjavi z normalnimi tkivi47. Ne glede na intracelularni rak ali TME so lahko COS-BA/Ce6 NP odzivni na pH in razstavljeni, da sprožijo sproščanje zelo strupenega COS-BA. Medtem ko je bilo v normalnih tkivih COS-BA/Ce6 NP mogoče razstaviti šele po vstopu v normalno celično okolje, kar zmanjša verjetnost sproščanja COSBA. Zato sklepamo, da je značilnost kemoterapevtskega mirovanja COS-BA/Ce6 NP za tumorsko mikrookolje veljavna in zanesljiva, zasnova v tej študiji pa je izvedljiva.

3.5. In vitro kemoterapija/PDT učinkovitost COS-BA/Ce6 NPs proti raku

Poleg tega pred podrobno in vitro kemoterapijo/PDT protirakavo učinkovitostjo COS-BA/Ce6 NPs in za nadaljnje odkrivanje mehanizma endocitoze preučujemo štiri glavne poti endocitoze z dodajanjem ustreznih endocitnih inhibitorjev, vključno s klorpromazinom (posredovanim s klatrinom), klorokin fosfatom ( zaviralec zakisljevanja lizosomov), nistatin (posredovan s kaveolami) in zaviralec makropinocitoze EIPA (etilizopropil amilorid) (sliki 5C in D). Opažamo, da bi lahko uvedba nistatina in klorpromazina učinkoviteje zavirala fagocitno učinkovitost kot EIPA in klorokin fosfat, kar kaže na znatno zmanjšano celično fluorescenco v primerjavi z normalnimi 37 C. Ti rezultati so pokazali, da so bili NP COS-BA/Ce6 internalizirani z več mehanizmi, predvsem prek poti endocitoze, posredovane s klatrinom in kaveolami. Od povečane generacije 1 O2 prek medmolekularnih interakcij, kažejo NP COS-BA/Ce6 znatno povečan medcelični izkoristek ROS kot Ce6, kot kaže močnejša zelena fluorescenca sonde DCFH (slika 5E), kar pomeni večjo fotodinamično učinkovitost. Testi MTT kažejo, da NP COS-BA/Ce6 pod obsevanjem izvajajo izjemno povečan inhibicijski učinek na celice 4T1 kot ekvivalentni Ce6, medtem ko imajo relativno zmerno citotoksičnost brez obsevanja (slika 5F). Pomembno je, da je bil IC50 Ce6 ​​(0,53 mg/mL) v COS-BA/Ce6 NP veliko nižji od prostega Ce6 (1,39 mg/mL) (slika 5G), kar kaže na izjemno izboljšano učinkovitost PDT, ki je bila nadalje odlično prikazano s citotoksičnostjo NP COSBA/Ce6 proti človeškim rakavim celicam MCF-7 in HepG2 (podporne informacije, slika S19). Podobno so bile v primerjavi s prostim Ce6 relativno nižje vrednosti IC25, IC50 in IC75 opažene tudi v ko-sestavih (slika 5G). Medtem pa so v primerjavi s samo Ce6 PDT in eno samo kemoterapijo NP v temi COS-BA/Ce6 NP pod obsevanjem dosegli učinkovitejšo kombinirano kemoterapijo/PDT proti zgornjim trem rakavim celicam, kar je pokazalo sinergizem (kombinacijski indeks: CI ˂ 1) ( Slika 5I). Poleg tega je dvojno obarvanje s fluorescenco živih/mrtvih celic z uporabo kalcein-acetoksimetil estra (kalcein-AM) in propidijevega jodida (PI) dodatno potrdilo, da lahko NP COS-BA/Ce6 učinkovito inducirajo celično apoptozo in nekrozo, saj so bile obdelane celice skoraj obarvane. z rdečim PI fluorescenčnim signalom, ko ga gojimo dodatnih 10 ur po obsevanju (slika 5H). Medtem so imeli neobsevani COS-BA/Ce6 NP (višji odmerek Ce6: 3,2 mg/mL) prav tako določeno kemoterapevtsko aktivnost, kot je razvidno iz signalov AM in PI hkrati. Ta izjemno izboljšana aktivnost PDT NP-jev COS-BA/Ce6 je bila dodatno potrjena z barvanjem AM/PI po zdravljenju dodatnih 20 ur (podporne informacije, slika S20). Poleg tega je pri dodajanju natrijevega azida (SA) in D-manitola (DM), ločenega posebnega dušilca ​​1 O2 in $OH48, celicam 4T1, obdelanim s COS-BA/Ce6 NPs-PDT, očitno povečana viabilnost celic pomenila, da Fotoreakcije tipa I ($OH) in tipa II (1 O2) so se pojavile hkrati v procesu PDT, posredovanem s COSBA/Ce6 NP (slika 5J). Poleg tega imajo COS-BA/Ce6 NP zlasti boljšo združljivost s krvjo, kot kaže zanemarljiva hemoliza rdečih krvnih celic (slika 5K), kar kaže na potencial za biomedicinske aplikacije z intravenskim dajanjem.

3.6. In vivo biodistribucija COS-BA/Ce6 NP

Nato smo pred preiskavo porazdelitve in vivo ocenili farmakokinetiko NP COS-BA/Ce6 s spremljanjem koncentracije Ce6 v krvi po intravenskem injiciranju z enakovrednimi NP Ce6 ali COS-BA/Ce6. Profili koncentracije Ce6 v krvi (slika 6A) in primerjalni farmakokinetični parametri (tabela s podpornimi informacijami S1) jasno potrjujejo, da imajo NP COS-BA/Ce6 podaljšan obtok v krvnem obtoku, kar lahko omogoči večje kopičenje pri tumorju strani. Zlasti COS-BA/Ce6 NP so pokazali hitro izločanje krvi v 2 urah, kar nakazuje ugodno biorazgradljivost. V skladu s tem smo nato raziskali in vivo biodistribucijo in sposobnost kopičenja tumorjev COS-BA/Ce6 NP (sl. 6B in C). Podobno kot splošno prijavljeni nanokompoziti Ce633 se lahko COS-BA/Ce6 NP hitro porazdelijo po celem telesu. Zlasti v prvih 4 urah so sklopi pokazali očitno močnejšo fluorescenčno emisijo na mestih tumorja kot prosti Ce6, kar kaže na izboljšano zadrževalno in tumorsko usmerjeno sposobnost kopičenja COS-BA/Ce6 NP, verjetno pripisano učinku pasivne povečane prepustnosti zadrževanja (EPR). ki jih omogočajo nanodelci14. Po 6 urah po injiciranju se je intenzivnost fluorescence na mestih tumorja postopoma hitro zmanjšala. Predvsem za razliko od nanokompozitov, o katerih se pogosto poroča, z znatno povečanim kopičenjem tumorja v primerjavi s prostim pozitivnim zdravilom29, NP COS-BA/Ce6 niso pokazali zelo izrazitega kopičenja na mestih tumorja 24 ur po injiciranju kot prosti Ce6 (slika 6C), ki je bil dodatno podprto s slikanjem izrezanega tumorja (sliki 6D in E). Odlična biorazgradljivost NP je lahko odgovorna za vnos naravnih majhnih organskih molekul. To so opazili tudi pri drugih nano-sklopih terpenoidov, posredovanih z majhnimi molekulami49. Poleg tega so NP-ji COS-BA/Ce6 pokazali podobno porazdelitev v tkivu kot prosti Ce6 (slika 6E), povprečna intenzivnost fluorescence ex vivo pa je bila na splošno nižja od tiste, predstavljene in vivo, kar nadalje pomeni dobro biorazgradljivost. Poleg tega, ob upoštevanju tesne razlike v ravni fluorescence med 2 in 4 h po injiciranju NP in Ce6, kot tudi eksperimentalne operabilnosti, ki omogoča zadostne intervale za obsevanje, je bilo 4 ure po dajanju izbrano kot svetlobna časovna točka za nadaljnjo terapijo s PDT.

Glede na ne zelo izrazito kopičenje tumorja v 24 urah kot prosti Ce6, smo za nadaljnjo potrditev povečanega učinka EPR, ki ga imajo COS-BA/Ce6 NP, takoj spremljali ex vivo fluorescenčne slike tumorjev ob različnih časih po intravenskem injiciranju nanozdravil ( Sl. 6F in G). Zanimivo je, da so 20 minut ali 12 ur po injiciranju COS-BA/Ce6 NP dejansko pokazali močnejšo fluorescenčno emisijo na mestih tumorja kot prosti Ce6, kar kaže na odlično in povečano sposobnost kopičenja tumorja. Medtem, ko je čas mineval, so intenzivnosti fluorescence, ki so se ohranile v tumorskem tkivu, postopoma oslabele (slika 6G), kar je popolnoma skladno z rezultati in vivo živalskega fluorescenčnega slikanja. Jasno je, da sta se s tem hitrim biološkim metabolizmom in povečanim kopičenjem tumorja izognila morebitni dolgoročni toksičnosti kopičenja, kar je zagotovilo visoko učinkovito protitumorsko terapijo z boljšo biološko varnostjo.

Slika 5 In vitro učinkovitost NP COS-BA/Ce6 proti raku. Celična internalizacija (A) rakavih celic 4T1 in (B) normalnih celic LO2, inkubiranih v prostih Ce6 ali COS-BA/Ce6 NP za 0.5 in 3 ure, in ustrezna pretočna citometrična analiza intenzivnosti fluorescence. (C) Študije zaviranja specifične endocitne poti in (D) ustrezna intenzivnost fluorescence celic, izmerjena s pretočno citometrijo po inkubaciji s COSBA/Ce6 NP z/brez endocitnih inhibitorjev, vključno s klorpromazinom, klorokinom, nistatinom in etilizopropil amiloridom (EIPA). Merilno merilo Z 20 mm. (E) Celična generacija ROS, inducirana s prostimi Ce6 ali COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 1,6 mg/mL). Merilno merilo Z 20 mm. (F) Preživetje celic celic 4T1 po različnih obdelavah 24 ur. (G) IC25, IC50, IC75 analiza prostih Ce6 in COS-BA/Ce6 NP proti celicam 4T1, MCF-7 oziroma HepG2. (H) Barvanje živih/mrtvih kalcein-AM/propidijevega jodida (PI) celic 4T1, obdelanih s COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,6 mg/mL), po dodatnih 10 urah inkubacije, kot tudi neobsevanih COS- BA/Ce6 NPs (Ce6: 3,2 mg/mL). Merilna merila Z 50 mm. (I) Indeks kombinacije (CI) COS-BA/Ce6 NP na celicah 4T1, MCF-7 in HepG2, kot je določen z izračunom izreka Chou Talalay. (J) Mehanizmi PDT (tip I in tip II), inducirani z obsevanjem COS-BA/Ce6 NP in ovrednoteni s specifičnim 1 O2 in $OH dušilcem natrijevega azida (SA) oziroma D-manitola (DM). (K) Odstotek hemolize rdečih krvnih celic po 4-urni inkubaciji s COS-BA/Ce6 NP. Podatki so izraženi kot srednje vrednosti SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 in ***P ˂ 0,001 kažejo pomembne razlike.

Slika 6 In vivo krvni obtok in biodistribucija COS-BA/Ce6 NP. (A) Profili koncentracije Ce6 v krvi po iv injekcijah enakovrednega Ce6 ali so-sestavljenih COS-BA/Ce6 NP (n Z 3). (B) Fluorescenčne slike celega telesa miši, ki nosijo tumor 4T1, po iv injekcijah navedenih zdravil v različnih časovnih točkah. (C) Povprečna intenzivnost fluorescence, pridobljena iz tumorskih mest v (B). (D) Ex vivo fluorescenčne slike tumorjev in glavnih organov, izrezanih zgornjim mišim po 24 urah, in ustrezen (E) kvantitativni rezultat intenzivnosti fluorescence (n Z 3). (F) Ex vivo fluorescenčne slike tumorjev in glavnih organov v različnih časih po iv injekcijah Ce6 ali COS-BA/Ce6 NP in (G) ustrezna analiza intenzivnosti fluorescence tumorjev. Podatki so izraženi kot srednje vrednosti SD (n Z 3).

3.7. Kombinirano protitumorsko zdravljenje s kemoterapijo in PDT in vivo 

Na podlagi edinstvene lastnosti mirovanja, dobre biorazgradljivosti in aktivnosti PDT so raziskali in vivo kombinirano protitumorsko terapijo s kemoterapijo/PDT. Miši s tumorjem 4T1 so bile naključno razdeljene v 6 skupin in intravensko injicirane z ekvivalentom Ce6 (3,5 mg/kg telesa) vsaka 2 dni za skupno tri odmerke. 4 ure po injiciranju so bila mesta tumorja miši v svetlobnih skupinah obsevana 15 minut (slika 7A). Medtem so bili ustrezni volumni tumorja ali telesne mase zabeleženi vsak drugi dan. Po 14 dneh zdravljenja (slika 7B) sta bila prosti Ce6 z obsevanjem in prosti COS-BA neučinkovita pri supresiji tumorja, verjetno zaradi omejenega kopičenja zdravila v tumorskem tkivu. Nasprotno pa so po obsevanju COS-BA/Ce6 NP opazili najpomembnejšo inhibicijo tumorja, kar potrjuje odlično učinkovitost kombinacije kemoterapije/PDT. Povprečne teže tumorjev (slika 7D) in ustrezne fotografije razrezanih tumorjev (slika 7E) so pokazale najboljšo protitumorsko učinkovitost COS-BA/Ce6 NP pri obsevanju, saj so zdravljene miši pokazale najmanjšo velikost tumorja kot tiste iz drugih skupin. Povprečno razmerje inhibicije tumorja s PDT-jem COS-BA/Ce6 NPs je doseglo 80,3 %, kar je bilo več kot pri prostem Ce6 PDT (42,4 %) in prostem COS-BA (38,5 %). Čeprav so prejšnje študije in vitro pokazale, da so COS-BA/Ce6 NP brez svetlobe pokazale mirujočo funkcijo kemoterapevtske aktivnosti, še vedno izvajajo izboljšano protitumorsko učinkovitost (49,5 %) v primerjavi s prostim COS-BA (slika 7D). Špekulirali smo, da dva možna razloga prispevata k temu rezultatu, eden je večje kopičenje tumorja COS-BA/Ce6 NP zaradi učinka EPR, o katerem se pogosto poroča. Drugi dejavnik je šibko kislo tumorsko mikrookolje, ki je spodbudilo sproščanje zelo strupenega COS-BA. Zaradi višje kritične koncentracije micelov (CMC, 187 mg/mL) COS-BA (podporne informacije, slika S21) lahko obstaja v monomernem stanju v tumorskem okolju, kar daje prednost izboljšani kemoterapiji neobsevanih COS-BA BA/Ce6 NP. Poleg tega je bilo za nadaljnje preverjanje vrhunske protirakave učinkovitosti COS-BA/Ce6 NP izvedeno obarvanje tumorjev s hematoksilinom in eozinom (H&E) (slika 7G).

Slika 7 Študija učinkovitosti s subkutanim modelom ksenotransplantata 4T1. (A) Shematski prikaz in vivo zdravljenja PDT. (B) Profili rasti tumorja, (C) spremembe telesne teže in (D) mase izrezanih tumorjev, ki vsebujejo razmerja inhibicije tumorja miši, ki so nosile 4T1-, po različnih zdravljenjih v navedenih skupinah (n Z 5 za vsako skupino). (E) Slike izrezanih tumorjev reprezentativnih miši po zdravljenju. (F) Biokemijska analiza seruma po zdravljenju s COS-BA/Ce6 NP 14 dni. (G) Reprezentativno H&E barvanje izrezanih tumorskih odsekov po različnih zdravljenjih. Merilna lestvica Z 50 mm. (H) TUNEL barvanje prostih Ce6 in COS-BA/Ce6 NPs tumorskih odsekov, obdelanih s PDT. Lestvice Z 20 mm **P < 0,01 označuje pomembne razlike.

Rezultati so pokazali, da so tumorski deli, zdravljeni s COS-BA/Ce6 NPs-PDT, pokazali resno propadanje tkiva in pomanjkanje jeder, medtem ko so v drugih skupinah opazili zmerno nekrozo tkiva. Hkrati so COS-BA/Ce6 NP pod obsevanjem v primerjavi s prosto svetlobo Ce6 izjemno povečali število TUNEL-pozitivnih celic, ki kažejo močnejše rjavo jedrsko obarvanje (slika 7H), kar dodatno potrjuje odlično kombinirano terapijo s kemoterapijo/PDT. Poleg tega v vseh skupinah niso opazili očitnih variacij telesne teže (slika 7C). Tudi če so skupine COSBA/Ce6 NP ali Ce6 light med dajanjem skromno izgubile telesno težo, so se telesne teže po nekaj dneh vrnile v normalno stanje. V glavnih organih, pobranih ob koncu zdravljenja, ni bilo mogoče najti nobene očitne poškodbe ali vnetne lezije (podporne informacije, slika S22), kar oboje kaže na nizko/brez sistemske toksičnosti in dobro biološko varnost COS-BA/Ce6 NP. Poleg tega, čeprav se COS-BA/Ce6 NP večinoma kopičijo v jetrnem tkivu, ustrezni označevalci delovanja jeter (ALT, AST in ALP) niso pokazali pomembnih sprememb v primerjavi z normalnimi zdravimi mišmi (slika 7F), kar kaže na boljšo biokompatibilnost. Poleg tega so se kazalci ledvične funkcije (BUN, CRE in UA) in biokemični parametri (ALB in TBIL) prav tako izkazali za podobne kot pri normalnih miših, kar nadalje pomeni boljšo biološko varnost. Jasno je, da imajo ta predzdravila organske majhne molekule, posredovane s COS-BA, COS-BA/Ce6 NP, več ugodnih terapevtskih lastnosti, ki odpirajo privlačne možnosti za uporabo v klinični medicini.

3.8. Protitumorska imunost kombinirane kemoterapije/PDT in blokade proti PD-L1

V zadnjem času so številne inovativne študije pokazale, da bi lahko kombinacija imunoterapije proti raku z drugimi načini zdravljenja učinkovito spodbudila tumorsko specifične imunske odzive na odpravo primarnih ali oddaljenih tumorjev1. Spodbujeni z edinstveno funkcijo mirovanja pri kemoterapiji in odlično protitumorsko učinkovitostjo kemoterapije/PDT NP-jev COS-BA/Ce6 se sprašujemo, ali bi lahko sprožil tudi imunološke odzive s pomočjo imunskega adjuvansa anti-PD-L1, da bi povzročil visoko učinkovito protitumorsko terapijo . Ali bi lahko zdravil oddaljene tumorje, ki jih ni mogoče zdraviti neposredno z zdravljenjem s PDT, in s tem zagotovil alternativno strategijo za klinične aplikacije proti raku? Za preizkušanje te hipoteze je bil v tej študiji vzpostavljen model "dveh tumorjev" in podrobni poskusni postopki so bili prikazani na sliki 8A. Običajno sta bila dva tumorja 4T1 cepljena v levi in ​​desni bok vsake miši. Glede na to, da sam anti-PD-L1 nima vidnega imunoterapevtskega učinka50, so bili poskusi razdeljeni v 5 skupin, vključno z nezdravljeno skupino, COS-BA/Ce6 NPs, COS-BA/Ce6 NPs z anti-PD-L1, COS- NPs BA/Ce6 s svetlobo, NPs COS-BA/Ce6 s svetlobo in anti-PD-L1. Po eni sami iv injekciji NP (Ce6: 3,5 mg/kg) so bili desni tumorji (primarni tumor) v svetlih skupinah obsevani 15 minut, da bi ocenili imunološke učinke PDT/kemoterapije, medtem ko so bili levi tumorji (oddaljeni tumorji) v vseh skupinah brez zdravljenja so bili izbrani za individualno kemoterapijo. Nato so 2., 4. in 6. dan miši v imunskih skupinah ivjicirali protitelesa proti PD-L1 (15 mg na miš na injekcijo) za skupno tri odmerke. Pomembno je, da lahko ne glede na zdravljenje s PDT ali ne, COS-BA/Ce6 NP in anti-PD-L1 učinkovito zavirajo napredovanje primarnega tumorja (slika 8B). Ustrezna povprečna razmerja inhibicije tumorja so ločeno dosegla 86.7 % (obsevanje) in 76,5 % (brez obsevanja), kar je veliko več kot posamezna kemoterapija (5,7 %) ali zdravljenje s kemoterapijo/PDT (27,4 %) (slika 8C). . Fotografije razrezanih tumorjev (slika 8D) in miši, ki nosijo 4T1- (podporne informacije, slika S23) po 14 dneh zdravljenja so tudi vizualno podprle zgornji sklep. Ti rezultati kažejo, da lahko tako kemoterapija na osnovi NPs kot kemoterapija/PDT učinkovito aktivirata protitumorsko imunost. Medtem pa je najbolj presenetljivo, da je blokada anti-PD-L1 plus NP ponudila tudi izjemen učinek zaviranja tumorja na neobsevane oddaljene (levo) tumorje (sliki 8E in F), na splošno močnejši od samih NP COS-BA/Ce6, kar je bilo potrjeno tudi z ustreznimi razrezanimi tumorji in slikami miši po zdravljenju (sl. 8D in sl. S23), kar dodatno dokazuje učinkovit protitumorski imunski odziv, ki ga povzročajo NP COS-BA/Ce6.

Da bi v celoti raziskali ta učinkovit protitumorski imunski odziv, so CD8þ citotoksične limfocite T (CTL), kritične imunocite za imunoterapijo raka4, dodatno ovrednotili z analizo imunskih celic v desnem ali levem tumorju po 14 dneh zdravljenja. Ugotovljeno je bilo, da COS-BA/Ce6 NP in anti-PD-L1 z ali brez zdravljenja s PDT povzročijo močno infiltracijo CD8þ CTL v primarnih tumorjih (sliki 8H in J). Infiltracija CD8þ CTL je bila do 11,3 % po kemoterapiji na osnovi COS-BA/Ce6 NPs/PDT plus zdravljenju z anti-PD-L1, nekoliko višja kot COS-BA/Ce6 NPs plus anti-PD-L1 (9,63 %) in veliko več kot pri drugih skupinah brez anti-PD-L1, vključno z zdravljenjem s kemoterapijo na osnovi COS-BA/Ce6 NPs (5,12 %) ali samo s kemoterapijo/PDT (4,07 %). Podobno so v primerjavi z neimunimi skupinami znatno povečano infiltracijo CTL opazili tudi pri levih (oddaljenih) tumorjih pri miših po NP COS-BA/Ce6 plus antiPD-L1 z ali brez zdravljenja s PDT (sliki 8I in K), nadalje kar pomeni visoko učinkovite imunske odzive, ki jih povzroči kemoterapija ali kombinirano zdravljenje s kemoterapijo/PDT. Medtem sta po uvedbi anti-PD-L1 tako kemoterapija, ki temelji na COS-BA/Ce6-, kot kemoterapija/PDT privedli do močne proizvodnje več citokinov, ki igrajo ključno vlogo pri uravnavanju citotoksičnih funkcij CTL8, vključno s tumorjem faktor nekroze-alfa (TNF-a) (slika 8L) in interferon-gama (IFN-g) (slika 8M) v vzorcih seruma miši po 14 dneh zdravljenja, kar še dodatno podpira, da so obstajali učinkoviti protitumorski imunski odzivi. Poleg tega v različnih zdravljenih skupinah niso opazili nobenih očitnih sprememb telesne mase (slika 8N), kar kaže na ugodno biološko varnost te kombinirane kemoterapije/PDT/imunoterapije. Skupaj smo ugotovili, da čeprav so anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 NP s svetlobo pokazali nekoliko višje razmerje inhibicije tumorja (86,7 %) kot neobsevana skupina (76,5 %) proti desnim tumorjem zaradi vpliva PDT (slika 8B–D) niso opazili pomembnih razlik v terapevtskih učinkih na leve tumorje v prisotnosti (77,8 %) ali odsotnosti (78,4 %) PDT (slika 8E–G). Špekuliramo o naslednjih možnih razlogih, ki vodijo do tega pojava. Prvič, za mehanizem kemoterapije ali PDT, ki krepi imunološke učinke blokade kontrolne točke anti-PD-L1, so številne študije pokazale, da lahko ti načini zdravljenja sprožijo akutno vnetje v območju tumorja in tako povečajo predstavitev s tumorjem povezanih antigenov T celic, kar povzroči rakave celice, da se podvržejo ICD8,9. Tumorske celice, ki bi bile podvržene ICD, bi navzgor uravnavale signale "pojej me" z izpostavitvijo kalretikulina (CRT) na površinah imunogeno umirajočih tumorskih celic in signale "nevarnosti" s sproščanjem polja 1 skupine z visoko mobilnostjo (HMGB1), kar bi spodbudilo aktivacijo dendritičnih celic za aktiviranje CTL, katerih aktivnost bi lahko okrepila anti-PD-L1, kar bi povzročilo bistveno izboljšano imunoterapijo proti raku51.

Slika 8 Protitumorski učinek kemoterapije/PDT na osnovi COS-BA/Ce6 NP in imunoterapije proti PD-L1 z blokado kontrolnih točk. (A) Shematski prikaz kemoterapije/PDT na osnovi CNP s terapijo proti PD-L1. (BeD) (B) Profili rasti tumorja, (C) povprečne teže tumorja in (D) slike izrezanih tumorjev reprezentativnih miši za primarne (desne) tumorje po različnih zdravljenjih 14 dni, kot je navedeno. (EeG) (E) Krivulje rasti tumorja, (F) povprečne teže tumorja in (G) slike izrezanih tumorjev za neobsevane oddaljene (levo) tumorje po različnih zdravljenjih, kot je navedeno. (H) Populacije CD8þ T celic v desnih tumorjih in (J) odstotki infiltracije CTL so bili kvantitativno odkriti s pretočno citometrijo po 14 dneh zdravljenja. (I, K) Populacije CD8þ T celic v levih tumorjih na 14. dan so kvantitativno odkrili s pretočno citometrijo (n Z 3). Izločanje citokinov v serumih po 14 dneh zdravljenja, vključno z (L) IFN-g in (M) TNF-a, izmerjeno s testom ELISA (n Z 3). (N) Spremembe telesne teže miši med različnimi zdravljenji. *P < 0.05, **P < 0.01 in ***P < 0.001 kažejo pomembne razlike.

Drugič, v tem delu bi lahko COS-BA/Ce6 NP hkrati porazdelili na levi in ​​desni tumor, tako leva kemoterapija kot desna kemoterapija/PDT imata velik potencial za induciranje tumorskih celic, ki so podvržene ICD. Medtem se NP-ji COS-BA/Ce6 dajejo samo v enem odmerku, imunoterapija je v glavnem odvisna od treh odmerkov anti-PD-L1, ne glede na to, ali gre za kemoterapijo ali kemoterapijo/PDT, so le začetni. Terapevtske razlike v indukciji ICD tumorskih celic med posamezno kemoterapijo in kombinirano kemoterapijo/PDT zdravljenjem morda niso zelo izrazite. Odstotek CD8þ CTL na levem (sliki 8I in K) in desnem tumorju (sliki 8H in J) je prav tako podprl zgornjo špekulacijo; v prisotnosti ali odsotnosti PDT niso opazili pomembne razlike v CD8þ CTL. Zato so COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 z ali brez obsevanja dosegli podobno učinkovitost proti raku proti levim tumorjem. Nadalje, ker celice 4T1 izražajo nizke ravni PD-L152, je bilo splošno dokazano, da ima sam anti-PD-L1 kakršen koli opazen imunoterapevtski učinek na raka dojke 4T153,54. Kljub temu, da učinki ICD, ki jih posredujejo NP COS-BA/Ce6, zahtevajo nadaljnje preiskave, so predstavljeni rezultati pokazali, da NP COS-BA/Ce6 dosežejo izjemno okrepljen imunski odziv s pomočjo anti-PD-L1. Skupaj se zdi, da so COS-BA/Ce6 NP resnično okrepili imunoterapijo raka z anti-PD-L1, ne le kombinirano terapijo. Čeprav anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 NP z ali brez zdravljenja s PDT niso pokazali pomembnih razlik v terapevtskih učinkih, sta oba pokazala očitno povečano protitumorsko učinkovitost v primerjavi z enim odmerkom COS-BA/Ce6 NP. To pomeni, da se po uvedbi imunskega adjuvansa antiPD-L1 po uvedbi imunskega adjuvansa po kemoterapiji COS-BA/Ce6 NPs lahko okrepi imunogenost tumorskih ostankov, kar povzroči izjemne sistemske protitumorske imunske odzive, kar vodi do učinkovite supresije. primarnih ali oddaljenih tumorjev. Tako bi moralo biti mogoče odstraniti primarne in metastatske tumorje med klinično imunoterapijo proti raku s ponavljajočimi se zdravljenji z NP. Jasno je, da ti rezultati skupaj zagotavljajo dokaze o zelo učinkovitih in sinergističnih protitumorskih imunskih odzivih, ki jih povzročajo COS-BA/Ce6 NP v kombinaciji z blokado anti-PD-L1, bodisi s samo kemoterapijo bodisi v kombinaciji s kemoterapijo/PDT.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

4. Sklepi

Če povzamemo, namenoma smo zasnovali, sintetizirali in razvili biokompatibilno, biološko razgradljivo, nizko toksično, a zelo učinkovito in klinično dostopno transformirano fotokemoterapevtsko nano-predzdravilo COS-BA/Ce6 NP s kombiniranjem treh večnamenskih komponent, samosestavljene naravne majhne molekule betulinske kisline (BA), vodotopni COS in nizko toksični fotosenzibilizator Ce6 za kombinirano kemoterapijo/PDT. Nato sproži zelo učinkovite in sinergistične protitumorske imunske odzive v kombinaciji z blokado proti PD-L1, bodisi s samo kemoterapijo bodisi v kombinaciji s kemoterapijo/PDT. Natančneje, pokažemo, da bi molekularna ureditev votle mreže lahko olajšala tvorbo nanodelcev s strukturo lupine. Modifikacije vodotopnega COS bi lahko močno povečale protirakavo aktivnost lipofilnih naravnih majhnih molekul s konstruiranjem amfifilnega predzdravila. Pokazali smo tudi, da so nastala nanozdravila pokazala več ugodnih terapevtskih lastnosti, zlasti pametno funkcijo "mirovanja" z zahrbtnimi učinki kemoterapije. V kombinaciji z značilno odzivnostjo na pH so ti ko-sestavi nizko toksični in biološko varni za normalno tkivo, vendar so zelo strupeni za tumorska tkiva. Skupaj z izboljšano generacijo 1 O2, dobro biorazgradljivostjo in biokompatibilnostjo je vse to prispevalo k zelo učinkoviti, sinergistični in varni kemoterapiji proti raku/PDT/imunoterapiji. Zlasti posamezna kemoterapija brez zdravljenja s PDT lahko aktivira sistemske protitumorske imunske odzive, kar odpira privlačne možnosti za klinično sinergistično imunoterapijo s kemoterapijo proti raku. Na splošno to delo zagotavlja obetaven vpogled v razvoj naravnih večnamenskih visoko bioaktivnih in nizko toksičnih nanoimunostimulantov za klinično imunoterapijo.

Reference

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Nedavni napredek v sinergistični kombinirani imunoterapiji raka na osnovi nanomaterialov. Chem Soc Rev 2019; 48: 3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. Imunoterapije raka, ki temeljijo na nanomedicini, so bile razvite z reprogramiranjem makrofagov, povezanih s tumorjem. Nano merilo 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. Kombinirana lokalna imunostimulacijska radioizotopna terapija in sistemska blokada imunske kontrolne točke dajeta močne protitumorske odzive. Nat Biomed Eng 2018; 2: 611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, et al. Integrirani nanodelci fototermalne kemoterapije z odzivom tumorskega mikrookolja so povečali indukcijo imunogene celične smrti za učinkovito zdravljenje kolorektalnega raka. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. Znotrajcelično združevanje peptidno reprogramiranih nanosestavov majhnih molekul izboljša kemoterapijo raka in kombinatorno imunoterapijo. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. Izboljšana imunoterapija, ki temelji na fotodinamični terapiji za izkoreninjenje primarnega in pljučnega metastaznega tumorja. ACS Nano 2018; 12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Imunološki odzivi, ki jih sproži fototermalna terapija z ogljikovimi nanocevkami v kombinaciji z anti-CTLA-4 terapijo za zaviranje metastaz raka. Adv Mater 2014; 26: 8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. Koordinacijski polimeri jedra in lupine na nanometrskem merilu združujejo kemoterapijo in fotodinamično terapijo za okrepitev imunoterapije proti raku pri blokadi kontrolnih točk. Nat Commun 2016; 7: 12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Imunogena celična smrt pri raku in nalezljivih boleznih. Nat Rev Immunol 2017; 17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. Kombinacija magnetnih nanodelcev na osnovi fukoidana in imunomodulatorjev izboljša tumorsko lokalizirano imunoterapijo. Nat Nanotechnol 2018; 13: 746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. Biorazgradljivi nanovezikel derivata hipokretina kot teranostik, ki ga poganja skoraj infrardeča svetloba, za dvojno fotoaktivno slikanje in zdravljenje raka. Biomateriali 2018; 185: 133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Peptid in proteinski konjugati nanodelcev so vsestranske platforme za biomedicinske aplikacije. Chem Soc Rev 2018; 47: 3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. Nedavni napredek nanomaterialov za dostavo nukleinske kisline pri imunoterapiji raka. Biomater Sci 2019; 7: 2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Nedavni napredek pri sonofotodinamični terapiji raka: od razvitih novih senzibilizatorjev do nanotehnoloških strategij za izboljšanje učinkovitosti. Acta Pharm Sin B 2021; 11: 2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Supramolekularna fotodinamična metalo-nano zdravila na osnovi pametnih peptidov, oblikovana s samosestavljanjem večkomponentne koordinacije. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Samosestavljen gel za naravni izdelek z majhnimi molekulami za dostavo zdravil: preboj v novi uporabi naravnih izdelkov z majhnimi molekulami. Acta Pharm Sin B 2020; 10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. Nanodelci, sestavljeni iz posameznih majhnih molekul, posredujejo učinkovito peroralno dajanje zdravil. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. Gelatorji naravnih proizvodov in splošna metoda za njihovo pridobivanje iz organizmov. Nanoscale 2018; 10: 3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Samosestavljene naravne diterpenske kisline z majhnimi molekulami z ugodno protirakavo aktivnostjo in biološko varnostjo za sinergistično izboljšano protitumorsko kemoterapijo. J Mater Chem B 2021; 9: 2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Raziskovanje naravnega aktivnega procesa nalaganja zdravil z majhnimi molekulami in visoko učinkovite sinergistične protitumorske učinkovitosti. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Preprosti in večnamenski naravni samosestavljeni steroli s supramolekularnimi fotosenzibilizatorji, posredovanimi protirakavim delovanjem, za izboljšano protitumorsko fotodinamično terapijo. ACS Appl Mater Interfaces 2019; 11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Bioaktivna naravna z majhnimi molekulami prilagojena sestava fotosenzitivnih zdravil za visoko učinkovito sinergistično in izboljšano fotokemoterapijo tipa I. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-carrier s so-sestavljanjem naravnih majhnih izdelkov za sinergistično okrepljeno protitumorsko delovanje z zaščitnimi učinki tkiv. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Nedavni napredek pri oblikovanju amfifilnih zdravil in cepiv s samooddajanjem. Adv Ther 2019; 3: 1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Izboljšanje celičnega vnosa terapevtskih entitet z interakcijo s komponentami celične membrane. Drug Deliv 2019; 26: 328e42.

26. Pujals S, Giralt E. S prolinom bogati peptidi, ki prodirajo v amfipatske celice. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: 473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Pametni mikro/nanodelci v sistemih za dostavo zdravil/genov, ki se odzivajo na dražljaje. Chem Soc Rev 2016; 45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Triterpenska predzdravila brez nosilcev z odzivom na glutation in biološko varnostjo za sinergistično izboljšano fotokemoterapijo. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Supramolekularni fotosenzibilizatorji pomlajujejo fotodinamično terapijo. Chem Soc Rev 2018; 47: 1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. Strukturna karakterizacija in protitumorski učinki oligosaharidov hitozana proti ortotopnemu tumorju jeter preko signalne poti NF-kB. J Funct Foods 2019; 57: 157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. Hitozanski oligosaharidi inducirajo apoptozo pri človeškem ledvičnem karcinomu preko stresa endoplazmatskega retikuluma, odvisnega od vrste reaktivnega kisika. J Agric Food Chem 2019; 67: 1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. Anti-edemska in antioksidativna kombinirana terapija za ishemično možgansko kap prek nanodelcev betulinske kisline, napolnjenih z gliburidom. Theranostic 2019; 9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Preprosta peptidno prilagojena samosestava fotosenzibilizatorjev za fotodinamično terapijo proti raku. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. Nanozdravilo, ki se odziva na tumorsko mikrookolje in samotarčno usmerjeno virusno spremembo oblike, za slikovno vodeno fototermalno kemoterapijo skoraj infrardeče II. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Nanogel hibridni sklop za znotrajcelično dostavo eksosomov: učinki na endocitozo in fuzijo z inženiringom površinskih polimerov eksosomov. Biomater Sci 2020; 8: 619e30.

36. Chou TC. Teoretične osnove, eksperimentalni načrt in računalniška simulacija sinergizma in antagonizma v študijah kombinacij zdravil. Pharmacol Rev 2006; 58: 621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. Dvojnofunkcionalne nanopalice brez nosilcev s samosestavljanjem čistih molekul zdravil za sinergistično kemo-fotodinamično terapijo. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Biomedicinske aplikacije supramolekularnih sistemov, ki temeljijo na interakcijah gostitelj-gost. Chem Rev 2015; 115: 7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. Nanoinženiring novo zasnovanega derivata klorina e6 za ojačano fotodinamično terapijo z uravnavanjem metabolizma laktata. Nano merilo 2021; 13: 11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. Nanozdravilo brez nosilcev, ki je mogoče regulirati mitohondrijski metabolizem, za povečanje občutljivosti fototermalne terapije. Chem Commun (Camb) 2021; 57: 8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Enostaven supramolekularni pristop k aktivirajoči nanoteranostiki, ki jo poganja nukleinska kislina, ki premaguje pomanjkljivosti fotodinamične terapije. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hibridni TiO2-rutenijev nano-fotosenzibilizator sinergistično proizvaja reaktivne kisikove vrste v hipoksičnih in normoksičnih pogojih. Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56: 10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. Uravnavanje singlet-tripletne energijske vrzeli: edinstven pristop k učinkovitim fotosenzibilizatorjem z značilnostmi emisij, ki jih povzroča agregacija (AIE). Chem Sci 2015; 6: 5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. Fotosenzibilizacija s polimerizacijo. Chem 2018; 4: 1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Svetlobno nadzorovana samosestava fotoneodzivnih nanodelcev. Nat Chem 2015; 7: 646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. pH-občutljivi polimerno modificirani liposomi na osnovi hialuronske kisline za celično specifične intracelularne sisteme za dostavo zdravil. Bioconjug Chem 2018; 29: 44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Selektivno slikanje in odmiranje rakavih celic prek fluorescence blizu infrardeče svetlobe s preklopom pH in fototermičnih učinkov. Chem Sci 2016; 7: 5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. Enostavna sinteza multifunkcionalnih magnetnih Fe3O4@ SiO2@CS@pyropheophorbide-a s pomočjo hitozana fluorescentnih nanodelcev za fotodinamično terapijo. New J Chem 2016; 40: 8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Raziskovanje mehanizma samosestavljanja in učinkovite sinergistične protitumorske kemofototerapije biorazgradljivega in na glutation odzivnega predzdravila ursolne kisline, posredovanega s fotosenzitivnim nanozdravilom. Biomater Sci 2021; 9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. Logična računalniška reakcija na živih celicah, ki temelji na aptamerju, da omogoči terapijo blokade imunske kontrolne točke brez protiteles. J Am Chem Soc 2021; 143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. Odprava uveljavljenih tumorjev s kombinirano kemoimunoterapijo na osnovi nanodiska. Sci Adv 2018; 4: eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. Odkrivanje PD-L1 v tumorjih z uporabo [(64)Cu]atezolizumaba s PET. Bioconjug Chem 2016; 27: 2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Terapevtsko protitumorsko imunost z blokado kontrolnih točk poveča ibrutinib, zaviralec BTK in ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. Notranja radioizotopna terapija, posredovana z nanodelci, za lokalno povečanje prepustnosti vaskulature tumorja za sinergistično izboljšane terapije raka. Biomateriali 2019; 197: 368e79.