Polisaharid Cistanche Deserticola zavira izgubo kosti pri miših, ki jo povzroča OVX, in osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

POVZETEK

Osteoporoza je resna bolezen kosti, ki prizadene starajoče se prebivalstvo. Cistanche deserticola (CD), krepčilno in zdravilno živilo, ki se pogosto uporablja na Kitajskem, dokazano zagotavlja učinkovito zdravljenje osteoporoze. Polisaharid Cistanche deserticola (CDP), ekstrahiran iz CD, ima različne farmakološke lastnosti, vendar njegova vloga priosteoklastičnonastanek in delovanje ter osteoporoza ostaja neznanka. Namen te študije je bil ekstrahirati in očistiti CDP, da bi nadalje raziskali njegov potencialni mehanizem delovanja na osteoporozo. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje s CDP preprečilo osteoporozo, ki jo povzroča OVX, in izboljšalo izgubo kosti z zatiranjem aktivnosti in delovanja osteoklastov. Poleg tega je zdravljenje s CDP znatno zaviralo osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL, resorpcijo kosti in izražanje genov, specifičnih za osteoklaste. Mehansko je CDP zaviral aktivacijo signalnih poti NF-κB in MAPK, ki jih povzroča RANKL, in posledično vplival na aktivacijo NFATc1 navzdol. Ugotovitve te študije kažejo, da je CDP potencialno varno zdravilo za zdravljenje osteoporoze. (10 koristi, ki jih lahko prinese Cistanche)

Za več informacij kliknite tukaj

Uvod

Osteoporoza – bolezen, za katero so značilni zmanjšana kostna masa, nenormalna mikrostruktura kostnega tkiva, povečana krhkost kosti in zlomi (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli in Ginaldi, 2006) – trenutno prizadene več kot 200 milijonov ljudi po vsem svetu in predstavlja precejšnjo medicinsko in socialno-ekonomsko breme sodobne družbe (Strom et al., 2011). Klinično zdravljenje osteoporoze se osredotoča predvsem na hormonsko nadomestno zdravljenje,bisfosfonatali zdravljenje z denosumabom. Te metode so učinkovite, vendar povzročajo dolgoročne stranske učinke, kot je možno tveganje za raka dojke in atipične zlome stegnenice (Black, Bauer, Schwartz, Cummings in Rosen, 2012; Rachner, Khosla in Hof Bauer, 2011). Zato je nujno treba raziskati zdravila, ki lahko ne le zavirajo osteoporozo, ampak imajo tudi manj neželenih stranskih učinkov. Cistanche deserticola (CD), krepčilno in zdravilno živilo, ki se pogosto uporablja na Kitajskem, poznano kot "puščavski ginseng", je posušeno sočno steblo z luskastimi listi C. deserticola YC Ma (Gu, Yang in Huang, 2016) in ima raznoliko in učinkovite farmakološke dejavnosti, kot je imunska regulacija,antioksidacija, in lastnosti proti osteoporozi (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Prejšnje študije o aktivnih snoveh CD pri zdravljenju osteoporoze so se osredotočale predvsem na feniletanoidne glikozide (Li, Jiang in Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao in Ma, 2017). Vendar CD vsebuje tudi druge učinkovite komponente, kot so iridoidi, lignani, polisaharidi (Wang, Zhang in Xie, 2012). Klinična uporaba tradicionalne kitajske medicine (TCM) je predvsem dekoktiranje vode. Polisaharidi so v vodi topne sestavine in so najverjetneje glavne farmakodinamične sestavine TKM. Za polisaharide, ekstrahirane iz tradicionalne kitajske medicine, so poročali, da imajo učinek proti osteoporozi in nekaj neželenih stranskih učinkov, ki se na splošno uporabljajo v klinikah (npr. polisaharidi, ekstrahirani izEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai in Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang in Yan, 2018) in Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Zato smo domnevali, daPolisaharid Cistanche deserticola(CDP), pridobljen iz CD, je lahko potencialno varno zdravilo za zdravljenje osteoporoze. Značilno je, da resorpcija kosti in tvorba kosti ohranjata dinamično ravnovesje med remodeliranjem kosti v koordinaciji z več vrstami celic, vključno z osteoklasti,osteoblasticelice kostne obloge in osteociti (Kular, Tickner, Chim in Xu, 2012). Kršitev tega ravnovesja lahko povzroči različne presnovne bolezni kosti, kot sta osteoporoza (Zhu et al., 2018) in osteoskleroza (Ihde et al., 2011). Osteoklasti, kot končno diferencirane celice, ki izhajajo iz mononuklearne/makrofagne linije, so edine celice s funkcijo resorpcije kosti (Teitelbaum, 20{{106}}0). Obstajata dva ključna citokina, ki sodelujeta pri diferenciaciji in zorenju osteoklastov (Koga et al., 2004): makrofagni kolonijo stimulirajoči faktor (M-CSF) in receptorski aktivator liganda jedrnega faktorja κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF posreduje pri diferenciaciji hematopoetskih matičnih celic v matične celice osteoklastov in spodbuja diferenciacijo osteoklastov s povečano ekspresijo receptorja RANK (Takayanagi, 2007). Vezava RANKL in RANK na celično površino osteoklasta povzroči naslednje: (1) rekrutiranje signalnih adapterskih molekul, kot je faktor 6, povezan z receptorjem TNF (TRAF6); (2) aktivacija več tarč v smeri toka, vključno z NF- κB in mitogenom aktiviranimi protein kinazami (MAPK); in (3) zvišanje ravni izražanja jedrnega faktorja aktiviranih T-celic, citoplazmatskih 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktivacija teh signalnih poti neposredno uravnava izražanje osteoklastnih genov, vključno s kislo fosfatazo 5 (Acp5) [ki kodira kislinsko fosfatazo, odporno na tartrat (TRAcP)], matrično metaloproteinazo 9 (MMP9) in katepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet). & Lacey, 2003). Zato je zaviranje signalnih poti, povezanih z diferenciacijo osteoklastov, ki jih povzroča RANKL, potencialna terapevtska metoda za osteoporozo. V tej študiji smo želeli ugotoviti učinke zdravljenja s CDP na mišji model osteoporoze, povzročene z ovariektomijo (OVX) in vivo in na aktivnost osteoklastov, povzročeno z RANKL, in vitro, s poudarkom na izražanju genov, specifičnih za osteoklaste, in aktivaciji NFATc1 ter signalnih poti NF-κB in MAPK. Naše ugotovitve lahko zagotovijo nov vpogled v potencial CDP kot varnega in učinkovitega zdravila za zdravljenje osteoporoze. 2. Materiali in metode 2.1. CD s kemikalijami in zbiranjem vzorcev (št. 180801) je bil kupljen pri Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Kitajska), identificiral pa ga je profesor Haibo Huang s Fakultete za farmacevtske znanosti, Univerza za kitajsko medicino Guangzhou, Guangzhou, Kitajska . Tablete estradiolvalerat so bile kupljene pri Bayerju (Leverkusen, Severno Porenje-Vestfalija, Nemčija). Alfa-modificiran minimalni esencialni medij (-MEM) in fetalni goveji serum (FBS) sta bila pridobljena pri Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Penicilin/streptomicin in komplet za obarvanje TRAcP sta bila pridobljena pri Solarbio (Peking, Kitajska). Rekombinantni mišji M-CSF in rekombinantni mišji RANKL sta bila nabavljena pri R&D Systems (Minneapolis, MN, ZDA). Plošče, prevlečene s hidroksiapatitom, so bile kupljene pri Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ZDA). Primarna protitelesa za NFATc1 in CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK in P-JNK (tehnologija celične signalizacije, Dan vers, MA, ZDA); in -aktin (CWBIO, Peking, Kitajska). Drugi reagenti, uporabljeni v tej študiji, so bili analitske kakovosti, voda pa je bila prečiščena s sistemom za čiščenje vode Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ZDA). 2.2. CDP ekstrakcija CD je bil zmlet v fin prah in trikrat pomešan s petrol etrom, da bi ga premagal. Trdni ostanek smo zbrali s filtracijo in nato posušili pri sobni temperaturi. Polisaharide smo ekstrahirali iz predhodno obdelanih vzorcev trikrat z vodo po 2 uri, koncentrirali, oborili z dodatkom brezvodnega etanola do končne koncentracije 80 odstotkov (v/v) in shranili pri 4 ◦C 24 ur. Oborine smo zbrali s centrifugiranjem pri 3000 obratih na minuto 20 minut, raztopili v destilirani vodi in očistili (odstranitev prostih proteinov) z metodo Sevag (Zhao et al., 2019). Pridobljene polisaharide smo dializirali, posušili in shranili do nadaljnje uporabe. Poleg tega so rezultati kemijske sestave pokazali, da je bila skupna vsebnost sladkorja, uronske kisline, sulfata in beljakovin v CDP 67,63 ± 0,98 odstotka, 21,05 ± 0,49 odstotka, 1,90 ± 0,24 odstotka in 8,81 ± 0,36 odstotka. Sestava monosaharida in infrardeča analiza CDP s Fourierjevo transformacijo sta bili prikazani na dodatni sliki 1 in 2. 2.3. Mišji model osteoporoze, povzročene z OVX. Vse poskuse na živalih je odobril Odbor za etiko živali Univerze kitajske medicine Guangzhou (odobren SYXK 2019-0202). Trideset 6-tednov starih samic miši C57BL/6 je dobavil Experiment Animal Center Univerze kitajske medicine Guangzhou. Po aklimatizaciji za 1 teden je bila ena skupina miši podvržena navidezni operaciji (skupina Sham), medtem ko so bile preostale miši podvržene operaciji ovariektomije (skupina OVX). Po operaciji so miši pustili okrevati 1-teden. Nato so uspešno modelirane miši naključno razdelili v 5 skupin, s 6 mišmi na skupino: (1) Lažna skupina: zdravljena z destilirano vodo, (2) Skupina OVX: obdelana z destilirano vodo, (3) skupina OVX plus E2 (E2) : zdravljeni s tabletami estradiolvalerata po 0,13 mg/kg, (4) skupina OVX plus CDP z nizkim odmerkom (CDP-L): zdravljeni s 300 mg/kg CDP, (5) skupina OVX plus CDP z visokim odmerkom (CDP H): zdravljeni s 600 mg/kg CDP. Destilirano vodo, E2 ali CDP so dajali z gavažo enkrat na dan. Vse miši so bile žrtvovane po 12--tedenskem obdobju zdravljenja (slika 1A). Maternice so bile zbrane in stehtane, leve golenice pa so bile zbrane za nadaljnje preiskave. Vzorce polne krvi smo zbrali in centrifugirali pri 5000 obratih na minuto 15 minut pri 4 ◦C. Supernatante seruma smo aspirirali in shranili pri – 80 ◦C do nadaljnje analize. 2.4. Analiza z mikroračunalniško tomografijo (mikro-CT) in histomorfometrija kosti. Leve golenice so bile fiksirane s 4 odstotki paraformaldehida za 48 ur in nato dane v centrifugalne epruvete, ki so vsebovale fiziološko raztopino. Fiksne vzorce smo skenirali z instrumentom Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgija) z naslednjimi nastavitvami: napetost, 80 kV; tok vira, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; velikost pikslov, 9,76 μm; in korak vrtenja 0,6◦. Več parametrov trabekularne kosti, vključno z mineralno kostno gostoto (BMD), volumskim deležem kosti (BV/TV), kostno površino na skupni volumen (BS/TV), trabekularnim številom (Tb. N) in trabekularnim razmikom (Tb.Sp ) so bile izmerjene s programsko opremo CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Tridimenzionalne slike so bile ustvarjene s programsko opremo CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Po mikro-CT analizi so bile leve tibije dekalcificirane v 14-odstotni raztopini EDTA in vstavljene v parafin za rez. Vzorci so bili z mikrotomom razrezani na 5 µm odseke pred poskusi obarvanja s hematoksilinom in eozinom (H&E) ter TRAcP. Obarvane odseke smo pregledali in dokumentirali z mikroskopom Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japonska). 2.5. Analiza seruma. Koncentracije kalcija (Ca) in fosforja (P) so bile določene v skladu z navodili za komplet, ki jih je oblikoval Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kitajska). Ravni TRAcP-5b in RANKL v serumu so bile analizirane s kompletom TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Kitajska) oziroma kompletom RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kitajska).

CD s kemikalijami in zbiranjem vzorcev (št. 180801) je bil kupljen pri Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Kitajska) in ga je identificiral profesor Haibo Huang s šole za Farmacevtske znanosti, Univerza kitajske medicine Guangzhou, Guangzhou, Kitajska. Tablete estradiolvalerat so bile kupljene pri Bayerju (Leverkusen, Severno Porenje-Vestfalija, Nemčija). Alfa-modificiran minimalni esencialni medij (-MEM) in fetalni goveji serum (FBS) sta bila pridobljena pri Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Penicilin/streptomicin in komplet za obarvanje TRAcP sta bila pridobljena pri Solarbio (Peking, Kitajska). Rekombinantni mišji M-CSF in rekombinantni mišji RANKL sta bila nabavljena pri R&D Systems (Minneapolis, MN, ZDA). Plošče, prevlečene s hidroksiapatitom, so bile kupljene pri Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ZDA). Primarna protitelesa za NFATc1 in CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK in P-JNK (tehnologija celične signalizacije, Dan vers, MA, ZDA); in -aktin (CWBIO, Peking, Kitajska). Drugi reagenti, uporabljeni v tej študiji, so bili analitske kakovosti, voda pa je bila prečiščena s sistemom za čiščenje vode Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ZDA). 2.2. CDP ekstrakcija CD je bil zmlet v fin prah in trikrat pomešan s petrol etrom, da bi ga premagal. Trdni ostanek smo zbrali s filtracijo in nato posušili pri sobni temperaturi. Polisaharide smo ekstrahirali iz predhodno obdelanih vzorcev trikrat z vodo po 2 uri, koncentrirali, oborili z dodatkom brezvodnega etanola do končne koncentracije 80 odstotkov (v/v) in shranili pri 4 ◦C za 24 ur. Oborine smo zbrali s centrifugiranjem pri 3000 rpm 20 min, raztopili v destilirani vodi in očistili (odstranitev prostih proteinov) z uporabo metode Sevag (Zhao et al., 2019). Pridobljene polisaharide smo dializirali, posušili in shranili do nadaljnje uporabe. Poleg tega so rezultati kemijske sestave pokazali, da je bila skupna vsebnost sladkorja, uronske kisline, sulfata in beljakovin v CDP 67,63 ± 0,98 odstotka, 21,05 ± 0,49 odstotka, 1,90 ± 0,24 odstotka in 8,81 ± 0,36 odstotka. Sestava monosaharida in infrardeča analiza CDP s Fourierjevo transformacijo sta bili prikazani na dodatni sliki 1 in 2. 2.3. Mišji model osteoporoze, povzročene z OVX. Vse poskuse na živalih je odobril Odbor za etiko živali Univerze kitajske medicine Guangzhou (odobren SYXK 2019-0202). Trideset 6-tednov starih samic miši C57BL/6 je dobavil Experiment Animal Center Univerze kitajske medicine Guangzhou. Po aklimatizaciji za 1 teden je bila ena skupina miši podvržena navidezni operaciji (skupina Sham), medtem ko so bile preostale miši podvržene operaciji ovariektomije (skupina OVX). Po operaciji so miši pustili okrevati 1-teden. Nato so uspešno modelirane miši naključno razdelili v 5 skupin, s 6 mišmi na skupino: (1) Lažna skupina: zdravljena z destilirano vodo, (2) Skupina OVX: obdelana z destilirano vodo, (3) skupina OVX plus E2 (E2) : zdravljeni s tabletami estradiolvalerata po 0,13 mg/kg, (4) skupina OVX plus CDP z nizkim odmerkom (CDP-L): zdravljeni s 300 mg/kg CDP, (5) skupina OVX plus CDP z visokim odmerkom (CDP H): zdravljeni s 600 mg/kg CDP. Destilirano vodo, E2 ali CDP so dajali z gavažo enkrat na dan. Vse miši so bile žrtvovane po 12--tedenskem obdobju zdravljenja (slika 1A). Maternice so bile zbrane in stehtane, leve golenice pa so bile zbrane za nadaljnje preiskave. Vzorce polne krvi smo zbrali in centrifugirali pri 5000 obratih na minuto 15 minut pri 4 ◦C. Supernatante seruma smo aspirirali in shranili pri – 80 ◦C do nadaljnje analize. 2.4. Analiza z mikroračunalniško tomografijo (mikro-CT) in histomorfometrija kosti. Leve golenice so bile fiksirane s 4 odstotki paraformaldehida za 48 ur in nato dane v centrifugalne epruvete, ki so vsebovale fiziološko raztopino. Fiksne vzorce smo skenirali z instrumentom Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgija) z naslednjimi nastavitvami: napetost, 80 kV; tok vira, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; velikost pikslov, 9,76 μm; in korak vrtenja 0,6◦. Več parametrov trabekularne kosti, vključno z mineralno kostno gostoto (BMD), volumskim deležem kosti (BV/TV), površino kosti na skupni volumen (BS/TV), trabekularnim številom (Tb. N) in trabekularnim razmikom (Tb. Sp ) so bile izmerjene s programsko opremo CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Tridimenzionalne slike so bile ustvarjene s programsko opremo CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Po mikro-CT analizi so bile leve tibije dekalcificirane v 14-odstotni raztopini EDTA in vstavljene v parafin za rez. Vzorci so bili z mikrotomom razrezani na 5 µm odseke pred poskusi obarvanja s hematoksilinom in eozinom (H&E) ter TRAcP. Obarvane odseke smo pregledali in dokumentirali z mikroskopom Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japonska). 2.5. Analiza seruma. Koncentracije kalcija (Ca) in fosforja (P) so bile določene v skladu z navodili za komplet, ki ga je oblikoval Nanjing.

Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kitajska). Ravni TRAcP{{0}}b in RANKL v serumu so bile analizirane s kompletom TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Kitajska) in kompletom RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kitajska) , oz. 2.6. Preizkus osteoklastogeneze in vitro BMM so izolirali iz golenice in stegnenice 6-teden starih samic miši C57BL/6. Izolirane celice smo gojili v gojišču -MEM, ki je vsebovalo 25 ng/mL M-CSF, 10 % FBS in 1 % penicilina/streptomicina. Ko so dosegli sotočje, so BMM (1 × 104 celice/vdolbinico) zasejali v 96-plošče z vdolbinicami in obdelali s CDP v prisotnosti 50 ng/mL RANKL. Medij in CDP sta bila zamenjana vsaka 2 dni. Po 7 dneh so bile celice fiksirane s 4 odstotki paraformaldehida in obarvane na prisotnost sledi. Število osteoklastov, definiranih kot TRAcP pozitivne celice s tremi ali več jedri, je bilo prešteto in dokumentirano s svetlobnim mikroskopom. 2.7. Test celične proliferacije BMM (1 × 104 celic/vdolbinico) smo zasejali v 96-ploščo z vdolbinicami in inkubirali čez noč. Po tem smo celice 48 ur obdelali z različnimi koncentracijami CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 in 40 µg/mL). Sotočje celic je bilo odkrito in analizirano z uporabo IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, ZDA), dolgoročnega dinamičnega sistema za slikanje živih celic v realnem času. 2.8. Test resorpcije hidroksiapatita BMM (1 × 104 celic/jamico) smo zasejali v ploščo, prevlečeno s hidroksiapatitom, obdelali s CDP pri navedenih koncentracijah (0, 5 in 10 µg/mL) in gojili v popolnem -MEM, ki je vseboval 25 ng/ml. mL M-CSF in 50 ng/mL RANKL. Po 7 dneh smo celice sprali z 10-odstotno raztopino belila, da smo odstranili celične komponente. Slike območij resorpcije hidroksiapatita so bile zajete z uporabo IncuCyte ZOOM® in analizirane s programsko opremo ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ZDA) (Abramoff, Magelhaes in Ram, 2003). 2.9. Izolacija RNK in analiza kvantitativnega PCR (RT-qPCR) v realnem času. BMM (1 × 105 celic/vdolbinico) smo zasejali v 6-ploščo z vdolbinicami in stimulirali z RANKL in M-CSF v prisotnosti CDP v različnih koncentracijah (0, 5 in 10 µg/mL) 5 dni. Totalno RNK smo izolirali iz celic ali kostnega tkiva miši z uporabo reagenta TRIzol (Sigma Aldrich). Komplementarna DNA je bila sintetizirana iz 2 µg celotne RNA z uporabo kompleta za reverzno transkriptazo (TransGen Biotech, Peking, Kitajska). Reakcije RT-qPCR so bile pripravljene z uporabo PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) in zaznane s sistemom ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ZDA). Parametri cikla za PCR so bili nastavljeni na naslednji način: 95 ◦C za 5 minut, čemur je sledilo 40 ciklov 95 ◦C za 15 s in 60 ◦C za 30 s. Uporabljeni specifični primerji so prikazani v tabeli 1, količina vsakega ciljnega gena pa je bila normalizirana na GAPDH (notranja kontrola).

2.10. Western blot analiza BMM (5 × 105 celic/vdolbinico) smo zasejali v 6-ploščo z vdolbinicami. Za kratke poskuse so bile celice predhodno inkubirane z različnimi koncentracijami CDP (0, 5 in 10 µg/mL) 1 uro in nato obdelane s 5{{ 58}} ng/mL RANKL 30 min. Dolgotrajno smo celice stimulirali s 50 ng/mL RANKL 3., 5. in 7. dan v prisotnosti CDP (0, 5 in 10 µg/mL). Celotne beljakovine smo ekstrahirali z uporabo liznega pufra RIPA (CWBIO). Proteine ​​smo ločili z 10 odstotki SDS-PAGE in prenesli na PVDF membrane. Membrane so bile blokirane s 5-odstotnim posnetim mlekom pri sobni temperaturi 2 uri, inkubirane s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 ◦C in nato z ustreznimi sekundarnimi protitelesi 1,5 ure. Membrane so bile razvite z uporabo reagentov ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, ZDA), slike pa so bile posnete s sistemom Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Šanghaj, Kitajska). 2.11. Odkrivanje translokacije NFATc1 z uporabo imunofluorescenčnega testa BMM so bili zasejani na 12-pokrivna stekelca vdolbinic, stimulirani z RANKL in M-CSF ter obdelani z 10 µg/mL CDP 5 dni. Celice so bile 15 minut fiksirane s 4 odstotki paraformaldehida, trikrat sprane s PBS in 10 minut permeabilizirane z 0,1 odstotkom Triton X-100. Celice smo zmešali z 10-odstotnim kozjim serumom (CWBIO) in inkubirali 2 uri. Nato smo celice inkubirali s primarnim protitelesom čez noč pri 4 °C in nato s sekundarnim protitelesom Alexa Fluor 488 kozje proti miši (Abcam, Cambridge, MA, ZDA) v temi 1 uro. Pokrovnice smo sprali s PBS, namestili v reagent Prolong Gold Antifade s 4', 6-diamidino-2-fenil indolom (DAPI) (Solar) in pregledali z Zeiss LSM 800 s konfokalnim mikroskopom Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, Nemčija). 2.12. Statistična analiza Vsi eksperimentalni podatki so bili analizirani s statistično programsko opremo SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, ZDA). Podatki za študije na živalih in celicah so izraženi kot povprečje ± SEM oziroma povprečje ± SD. Rezultati so pridobljeni z uporabo enosmerne analize variance ali Studentovega t-testa. Vrednosti p < 0,05="" so="" veljale="" za="" statistično="" pomembne.="" 3.="" rezultati="" 3.1.="" cdp="" in="" vivo="" preprečuje="" z="" ovx="" povzročeno="" izgubo="" kosti="" uporabili="" smo="" mišji="" model="" osteoporoze,="" povzročene="" z="" ovx,="" da="" bi="" raziskali="" učinke="" zdravljenja="" s="" cdp="" na="" osteoporozo="" in="" vivo.="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" sham="" se="" je="" telesna="" teža="" miši="" ovx="" znatno="" povečala,="" medtem="" ko="" se="" je="" maternični="" indeks="" zmanjšal,="" kar="" kaže,="" da="" je="" bil="" model="" osteoporoze="" uspešno="" izdelan="" (sliki="" 1b="" in="" d).="" mikro-ct="" analiza="" golenic="" v="" skupini="" ovx="" je="" pokazala="" obsežno="" izgubo="" kosti.="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" ovx="" se="" je="" število="" kostnih="" trabekul="" povečalo="" v="" skupini="" cdp-l,="" medtem="" ko="" je="" bilo="" povečanje="" v="" skupinah="" cdp-h="" in="" e2="" pomembnejše,="" trabekule="" v="" zadnjih="" dveh="" skupinah="" pa="" so="" postale="" grobejše="" in="" vrzel="" se="" je="" zmanjšala="" (="" slika="" 1c).="" kvantitativna="" analiza="" je="" potrdila,="" da="" je="" več="" histomorfometričnih="" parametrov="" kosti,="" vključno="" z="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" in="" tb.="" n="" je="" imel="" bistveno="" povečane="" vrednosti,="" medtem="" ko="" je="" tb.="" sp="" je="" pokazal="" znižane="" vrednosti="" v="" skupini="" cdp-h="" (sl.="" 1e="" in="" f).="" njegova="" patološka="" preiskava="" z="" barvanjem="" s="" h&e="" je="" pokazala,="" da="" je="" bilo="" število="" kostnih="" trabekul="" v="" skupinah="" cdp-h="" in="" e2="" znatno="" večje="" kot="" v="" skupini="" ovx,="" medtem="" ko="" v="" skupini="" cdp-l="" ni="" bilo="" pomembnega="" izboljšanja="" (slika="" 1g).="" poleg="" tega="" je="" barvanje="" s="" tracp="" pokazalo,="" da="" se="" je="" število="" osteoklastov="" izrazito="" povečalo="" v="" skupini="" ovx,="" vendar="" zmanjšalo="" v="" skupinah="" cdp-h="" in="" e2="" (slika="" 1h).="" skupine="" cdp-l,="" cdp-h="" in="" e2="" so="" pokazale,="" da="" so="" zavirale="" povečanje="" vsebnosti="" p,="" ki="" ga="" povzroča="" ovx,="" vendar="" so="" povečale="" vsebnost="" ca="" v="" krvnem="" serumu.="" označevalca="" absorpcije="" kosti,="" rankl="" in="" tracp-5b,="" sta="" pokazala="" trend="" padanja="" v="">

skupini brez statistične razlike, medtem ko so se v skupini CDP-H znatno zmanjšale (slika 1I). Poleg tega smo preučili učinek CDP na izražanje markerskih genov osteoklastov v kostnem tkivu z RT-qPCR. Ravni mRNA NFATc1, Acp5, Mmp9 in CTSK v skupini OVX so bile znatno višje od tistih v skupini Sham. Skupine CDP-H so pokazale znižanje ravni mRNA NFATc1, Acp5 in CTSK za 1.74-, 1.70- in 2.{14}}krat v primerjavi s skupino OVX. (slika 1J). 3.2. CDP in vitro zavira osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL. Spremljali smo celično proliferacijo BMM, obdelanih s CDP, z uporabo dolgoročnega analizatorja dinamičnega slikanja živih celic v realnem času. V primerjavi s kontrolno skupino se sotočje celic v skupinah, zdravljenih s CDP, ni spremenilo pri odmerku<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 µg/mL CDP je pokazal znatno zmanjšano velikost in število (sliki 2B in C). Ti rezultati so pokazali, da je CDP učinkovito zaviral pričakovano osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL, ne da bi vplival na viabilnost celic. 3.3. CDP zavira osteoklastično resorpcijsko aktivnost, ki jo povzroča RANKL, in za osteoklaste specifično ekspresijo gena. Nadalje smo ugotavljali učinke zdravljenja s CDP na kostno resorpcijsko aktivnost osteoklastov z uporabo plošč, prevlečenih s hidroksiapatitom. Resorpcija kosti je glavna funkcija in standard za merjenje aktivnosti in sposobnosti osteoklastov (Novack & Faccio, 2011). Rezultati so pokazali, da lahko CDP znatno zmanjša kostno resorpcijsko območje osteoklastov na način, ki je odvisen od odmerka, kar kaže, da je CDP zaviral kostno resorpcijsko aktivnost, ki jo povzroča RANKL (sliki 3A in B). Zlasti osteoklastično kostno resorptivno območje se je zmanjšalo na približno 6,3 odstotka po zdravljenju z 10 µg/mL CDP. Da bi bolje ugotovili oviro CDP na osteoklastogenezo, smo izmerili nivoje transkripcije genov, povezanih z osteoklasti. Brez zdravljenja s CDP je indukcija z RANKL spodbudila izražanje genov NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 in Mmp9. Nasprotno, sočasna uporaba CDP in RANKL je teh pet genov bistveno zmanjšala (sl. 3C in D).

3.4. CDP zavira aktivacijo NFATc1, ki jo povzroči RANKL. Barvanje s TRacP je pokazalo, da je zdravljenje s CDP znatno zmanjšalo pričakovano povečanje števila zrelih osteoklastov po stimulaciji RANKL 3–7 dni (sliki 4A in B). Poleg tega smo raziskali, ali lahko zdravljenje s CDP učinkovito zmanjša diferenciacijo osteoklastov z zaviranjem izražanja NFATc1. Rezultati so pokazali, da je bil NFATc1 močno izražen po 5-dnevni stimulaciji RANKL, kar je bilo znatno inhibirano po zdravljenju s CDP (sliki 4C in D). Poleg tega je zdravljenje s CDP zavrlo ravni ekspresije CTSK, proteina, potrebnega za normalno tvorbo in delovanje osteoklastov (Bossard et al., 1996) (sliki 4E in F). Izbrali smo časovno predstavitev stimulacije RANKL za 5 dni, da bi nadalje raziskali učinek zdravljenja z 10 µg/mL CDP na translokacijo NFATc1. Kot je bilo pričakovano, je zdravljenje s CDP znatno zaviralo jedrsko translokacijo NFATc1, ki jo povzroča RANKL (sl. 4G in H).

Slika 4. CDP zavira aktivacijo NFATc1, ki jo povzroči RANKL. (A) BMM so bili zasejani v 6-ploščo z jamicami in stimulirani z RANKL in M-CSF v prisotnosti CDP (0, 5 in 10 µg/mL) za navedene dni. Reprezentativne slike, ki prikazujejo TRacP-pozitivne večjedrne celice. Povečava, ×100. Lestvice {{10}} μm. (B) Kvantifikacija TRAcP-pozitivnih večjedrnih celic (jedra večja ali enaka 3). (CF) Western blot analiza izražanja beljakovin NFATc1 in CTSK v BMM, stimuliranih z M CSF in RANKL 3–7 dni v prisotnosti CDP. (G) BMM so bili obdelani z 10 ug/mL CDP in stimulirani z M-CSF in RANKL 5 dni, nato imunsko obarvani z NFATc1 (zeleno) in DAPI (modro) in opazovani s konfokalnim mikroskopom. Povečava, ×200. Lestvice=20 μm. (H) Intenzivnost fluorescence je bila analizirana z uporabo Image-Pro Plus. Vrednosti so izražene kot srednje vrednosti ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" rankl.="" 3.5.="" cdp="" zavira="" aktivacijo="" signalnih="" poti="" nf-κb="" in="" mapk,="" ki="" jo="" povzroča="" rankl.="" da="" bi="" razjasnili="" mehanizme,="" vključene="" v="" inhibicijo="" diferenciacije="" osteoklastov,="" ki="" jo="" povzroči="" cdp,="" smo="" preučili="" vpliv="" zdravljenja="" s="" cdp="" na="" poti="" nf-κb="" in="" mapk.="" rezultati="" so="" pokazali,="" da="" ima="" zdravljenje="" s="" cdp="" supresivne="" učinke="" na="" razgradnjo="" iκb="" in="" fosforilacijo="" p65="" na="" način,="" ki="" je="" odvisen="" od="" odmerka="" (sliki="" 5a="" in="" b).="" fosforilacija="" treh="" članov="" družine="" mapk,="" zlasti="" zunajcelične="" signalno="" regulirane="" kinaze="" (erk),="" c-jun="" n-terminalne="" kinaze="" (jnk)="" in="" p38,="" je="" bila="">

Diskusija

Osteoporoza je pogosta in degenerativna bolezen kosti. Trenutno obstaja veliko zdravil s kemično sintezo, ki se uporabljajo v kliničnem zdravljenju osteoporoze, kot sta estrogen in bisfosfonat. Vendar pa bo dolgotrajna uporaba teh zdravil postopoma oslabila klinično učinkovitost in celo povzročila številne resne neželene učinke, vključno s povečanim tveganjem za raka jajčnikov, dojk in endometrija ter osteonekrozo čeljusti (Beral, 2003 ; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). Medtem ko smo v tej študiji izbrali CDP, učinkovito komponento, ekstrahirano iz CD, kot terapevtsko sredstvo in dokazali, da ima CDP zaščitni učinek proti izgubi kosti pri miših OVX in zavira tvorbo in delovanje osteoklastov, ki jih povzroča RANKL. Medtem pa se po teoriji tradicionalne kitajske medicine o "ledvicah, ki upravljajo s kostmi" izguba kostne mase pripisuje pomanjkljivostim ledvic. Kot medicinska hrana, ki krepi ledvice, CD dokazano zagotavlja učinkovito zdravljenje osteoporoze (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li in Zhang, 2016). Tako je CDP, pridobljen iz te naravne rastline, boljša in varnejša možnost zdravila. Trenutno je mišji model OVX klasičen model izgube kosti po menopavzi pri ženskah, ki raziskuje vzroke izgube kosti in izvaja intervencijo (Wehrle et al., 2015). V skladu s tem smo izvedli dvostransko ooforektomijo na mišjih samicah C57BL/6J, da smo zgradili model osteoporoze. V prejšnjih študijah so bili odmerki CDP, dani živalim, 50–200 mg/kg (nizek odmerek) in 1800 mg/kg (visok odmerek) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Tu je bil visok odmerek CDP pri miših 600 mg/kg, kar je temeljilo na visokem kliničnem odmerku 30 g CD v decokciji; tako je podoben trenutni klinični praksi. V tej študiji je zdravljenje s CDP znatno zaviralo povečanje telesne mase, ki ga povzroča OVX, kar je pogost pojav, opažen pri miših OVX (Davis et al., 2019). Z uporabo mikro-CT skeniranja in 3D rekonstrukcije smo ugotovili, da je OVX povzročil opazno zmanjšanje BMD, BV/TV, BS/TV in Tb.N ter povečanje Tb.Sp, medtem ko je zdravljenje s CDP odpravilo vse te spremembe. . Zlasti v primerjavi s pozitivnim zdravilom bi lahko CDP bistveno izboljšal BMD miši OVX, ki je pomemben pokazatelj kakovosti kosti in se uporablja za odražanje stopnje osteoporoze (Fuggle et al., 2019), kar kaže, da ima CDP prednost nad pozitivnim zdravilom pri izboljšanju BMD. Poleg tega so histološki rezultati pokazali, da bi zdravljenje s CDP lahko zmanjšalo povečano količino TRAcP-pozitivnih osteoklastov, ki jih povzroča OVX. Ti rezultati kažejo, da je dajanje CDP učinkovito ublažilo izgubo kosti pri osteoporozi, ki jo povzroča OVX, verjetno z zaviranjem tvorbe osteoklastov. V skladu z zgornjimi rezultati smo ugotovili, da je CDP odvisno od odmerka zaviral RANKL-inducirano osteoklastično tvorbo in delovanje, medtem ko je imel CDP majhen učinek na proliferacijo osteoklastnih prekurzorskih celic, ki jih povzroča M-CSF, v naših poskusih in vitro. Vezava RANKL in RANK lahko vodi do rekrutiranja TRAF6 in posledične aktivacije več spodnjih signalnih poti, kot so NF-κB in MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). Signalna pot NF-κB igra pomembno vlogo pri regulaciji diferenciacije osteoklastov in utišanje genov, ki kodirajo ključne proteine ​​na tej poti, lahko privede do nenormalnega razvoja kosti (Leibbrandt & Penninger, 2008). Dobro ugotovljeno je, da je NF-κB prisoten v citoplazmi nestimuliranih celic v kompleksu z IκB, vendar hitro vstopi v jedro po stimulaciji RANKL (Boyle et al., 2003). Sproščeni IκB se nato hitro razgradi, medtem ko NF-κB aktivira specifično gensko transkripcijo, posledično spodbuja diferenciacijo, zorenje in apoptozo osteoklastov (Abdelmagid et al., 2015). V tej študiji so rezultati pokazali, da je zdravljenje s CDP zavrlo aktivacijo signalne poti NF-κB, ki jo povzroča RANKL, kar je dokazano z inhibicijo razgradnje IκB in fosforilacije p65 na način, odvisen od odmerka, kar lahko vključuje njegov anti-osteoklastogeni učinek . Poleg tega so signalne poti MAPK, vključno z ERK, JNK in p38, tesno vključene v osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL (Li et al., 2002). Poleg tega lahko prevladujoči zaviralci p38 in JNK preprečijo osteoklastogenezo, ki jo povzroči RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), medtem ko ima ERK pomembno vlogo pri preživetju osteoklastov (Miyazaki et al., 2000). Ugotovljeno je, da RANKL aktivira signalno pot MAPK s povečanjem fosforilacije ERK, JNK in p38 (Mizukami et al., 2002). V naši študiji smo dokazali, da je CDP zaviral fosforilacijo, ki jo povzroča RANKL, ključnih proteinov v signalni poti MAPK. Ti rezultati skupaj kažejo, da zaviranje aktivacije signalnih poti NF-κB in MAPK prispeva k zaviralnemu učinku CDP proti osteoklastogenezi. Aktivacija signalnih poti NF-κB in MAPK spodbuja izražanje več ključnih transkripcijskih faktorjev, kot so celični onkogen fos, aktivatorski protein 1 in NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, pomemben član družine NFAT, je vključen v končno diferenciacijo osteoklastov kot glavni transkripcijski regulator (Asagiri et al., 2005). Poročalo se je, da se embrionalne izvorne celice s pomanjkanjem NFATc1- ne morejo diferencirati v osteoklaste pod stimulacijo RANKL, ektopična ekspresija NFATc1 pa povzroči diferenciacijo predhodnih celic mimo signalizacije RANKL, kar nakazuje, da ima NFATc1 kritično vlogo pri diferenciacijo osteoklastov (Takayanagi et al., 2002). Rezultati naše študije so pokazali supresivni učinek CDP na izražanje NFATc1 in njegovega naslednjega proteina CTSK. Zanimivo je, da smo opazili, da se je raven ekspresije proteina NFATc1 najprej povečala in nato zmanjšala ter dosegla najvišjo raven 5. dan po stimulaciji RANKL. To je bilo skladno z rezultati Baek et al. (2014), ki je opazil M-CSF inducirano razgradnjo NFATc1 med pozno fazo osteoklastogeneze prek Cbl-inducirane ubikvitinacije NFATc1 na način, ki je odvisen od Src kinaze. Rezultati imunofluorescenčnega testa so dosledno podpirali zaviralni učinek CDP na aktivacijo transkripcije NFATc1. Poleg tega so geni, specifični za osteoklaste, vključno s CTSK, Acp5, Mmp9 in Atp6v0d2, vsi neposredno regulirani z NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), zatrti s CDP. Te ugotovitve ponazarjajo, da je NFATc1 tarča inhibitornega učinka CDP na signalne poti NF-κB in MAPK.

Zaključek

Če povzamemo, ekstrahirali in očistili smo aktivni polisaharid iz CD-ja in dokazali, da je CDP pokazal zaščitni učinek na osteoporozo, ki jo povzroča OVX, in izboljšal izgubo kosti z zatiranjem aktivnosti in delovanja osteoklastov. Poleg tega lahko CDP zavira diferenciacijo in delovanje osteoklastov, ki jih povzroča RANKL, tako da moti signalne poti NF-κB in MAPK in posledično vpliva na aktivacijo NFATc1 navzdol. Skratka, naše ugotovitve zagotavljajo osnovo za razširitev in uporabo CDP pri zdravljenju osteoporoze.

Ta članek izhaja iz seznamov vsebin, ki so na voljo na domači strani revije ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff