Cistanche Tubulosa ščiti dopaminergične nevrone z uravnavanjem apoptoze in nevrotrofnega faktorja, pridobljenega iz glialnih celic: in vivo in in vitro-Ⅰ

UVOD

Parkinsonova bolezen (PD) je pogosta nevrodegenerativna bolezen, ki se pojavi pri starejših ljudeh s patološkimi manifestacijami izgube dopaminergičnih nevronov v substantii nigra (SN) zaradi degeneracije. Resnost bolezni je povezana z izgubo nevronskih celic dopamina (DA) v SN, kar je v skladu s stališčem, da nevrodegenerativniproces napreduje več let, preden se pojavijo simptomi (Sawle in Myers, 1993). Progresivna narava bolezni kaže na zanimive možnosti za terapevtsko intervencijo z blokiranjem osnovnega nevrodegenerativnega procesa. Iskanje s terapijo povzročenih močnih in specifičnih učinkov nevrotrofičnih dejavnikov na preživetje nevronov DA je zato zelo zanimivo.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZAŠČITO DOPAMINERGIČNIH NEVRONOV PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nevrotrofni dejavniki so bistveni proteini, vključno z živčnim rastnim faktorjem (NGF), nevrotrofnim faktorjem, pridobljenim iz možganov (BDNF), in nevrotrofnim faktorjem, pridobljenim iz glialnih celic (GDNF), ki spodbujajo rast živcev, nevrološki razvoj, vodenje aksonov in delovanje nevronov. Med vsemi nevrotrofičnimi dejavniki, ki ščitijo in pospešujejo popravilo dopaminergičnih nevronov, ima GDNF najmočnejše učinke (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Pokazalo se je, da ima GDNF močne nevrotrofične učinke na nevrone DA in vitro (Lin et al., 1993) in ima nevroprotektivne učinke in vivo. Pokazalo se je, da GDNF rešuje nigralne DA nevrone pred celično smrtjo, ki jo povzroča lezija, po kirurški ali s toksinom povzročeni aksotomiji pri podganah (Beck et al., 1995; Kearns in Gash, 1995; Sauer et al., 1995) in delno tudi po sistemsko upravljanjeN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP)pri miših (Tomac et al., 1995). Povečana incidenca nevronske apoptoze in zmanjšani zaščitni učinki nevrotrofičnih dejavnikov, ki jih lahko sprožijo različni patološki dejavniki, so osnova degeneracije dopaminergičnih nevronov (Holden et al., 2006).

C. tubulosa je zdravilo rastlinskega izvora, ki izvira iz več rastlin iz rodu Cistanche. Je glavna terapevtska možnost za sindrom pomanjkanja ledvic, ki je tesno povezan z androgeni hormoni v tradicionalni kitajski medicini (TCM). Do danes je veliko kliničnih in temeljnih raziskav C. tubulosa pokazalo delovanje nevrodegenerativnih bolezni. Identifikacija receptov TKM za tonificiranje ledvic pri zdravljenju PD lahko tako zagotovi alternativno klinično zdravljenje PD.Ehinakozid (ECH)je glavna bioaktivna sestavina, ki jo najdemo v zdravilni rastlini C. tubulosa. Študije so pokazale terapevtske učinke glikozidov Cistanche in ECH,verbaskozid(VER) in icariin (ICA) pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo (AD), PD in drugimi bolniki z vaskularno demenco (Urano in Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) je predlagal, da izvlečki C. tubulosa, ki so vsebovali dovolj ECH in akteozida, izboljšajo kognitivno disfunkcijo, ki jo povzroča A -42, tako da blokirajo odlaganje amiloida in obrnejo delovanje holinergičnih in hipokampalnih dopaminergičnih nevronov. Tao et al. (2015) so ugotovili, dafeniletanoidni glikozidiiz C. tubulosa (Ph Gs-Ct) je preprečil možganski edem na visoki nadmorski višini z zmanjšanjem izražanja beljakovin in mRNA AQP4 v možganskem tkivu modelov podgan.

PRIGRIZKI IZ NARAVNEGA IZVLEČKA CISTANCHE TUBULOSA IZBOLJŠAJO SPOMIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Prejšnje študije so pokazale, da so kitajske zeliščne spojine, vključno s tremi sestavinami C. tubulosa, epimedium in rhizoma polygonati, ublažile poškodbe dopaminergičnih nevronov in povečale ravni dopamina z uravnavanjem izražanja nevrotrofičnih dejavnikov (Wu et al., 2013). Tako še ni znano, ali so nevroprotektivni učinki, ki jih povzroča C. tubulosa, dolgotrajni in v kolikšni meri lahko reševanje nigralnih DA nevronov z dajanjem GDNF omogoči pomembno ohranitev motoričnega vedenja, ki je pomembno za simptomatologijo PD živali. Ta študija je uporabila recept TCM za tonificiranje ledvic, nanoprah C. tubulosa, ki je prejel nacionalni patent (številka patenta: 2011103028541) na Kitajskem in je že pokazal določen terapevtski učinek pri PD. Ta študija je bila zato zasnovana za preučevanje nevroprotektivnih in regenerativnih učinkov zdravljenja s C. tubulosa ter za raziskovanje apoptoze na celicah MES23.5 in vedenjskih dokončnih podganah ter regulacije GDNF, merjeno z nizom ciljnih testov. .

MATERIALI IN METODE

Materiali, reagenti in oprema

C. tubulosa je bila kupljena pri Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Peking, Kitajska. ECH, VER in ICA so prišli iz Nacionalnega inštituta za nadzor hrane in zdravil na Kitajskem. Dopaminergična nevronska celična linija MES23.5 je bila darilo profesorja Biao Chena, Laboratorija za nevrobiologijo, Capital Medical University, Peking, Kitajska. Petdeset mišjih samcev C57BL/6 (težki 20–25 g vsak) je bilo kupljenih pri Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (številka licence: SCXK2012-0002), Šanghaj, Kitajska.

MPP+, MTT in glutamin so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ZDA); Medij DMEM/F12 in fetalni goveji serum sta bila kupljena pri Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA); in standard MPTP, DA in standard homovanilne kisline (HVA) so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ZDA). -aktin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF družina receptorjev alfa (GFR 1) in protitelesa Ret so bila kupljena pri Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, ZDA); Komplet reagenta za barvanje 3,3'-diaminobenzidina (DAB) je bil kupljen pri Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Kitajska); in komplet za pripravo vzorcev gela SDS-PAGE, komplet za ultraobčutljivo izboljšano kemiluminiscenco (ECL) in test bicinhoninske kisline (BCA) so bili kupljeni pri Beyotime Institute of Biotechnology (Peking, Kitajska).

V tej študiji so bili uporabljeni naslednji instrumenti: čitalnik mikroplošč ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, ZDA); CO2 inkubator (Heraeus, Hanau, Nemčija); Gel DOC 2000 sistem za analizo slikanja gela, elektroforezna celica in elektroforezni rezervoar (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA); analizator beljakovin DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, ZDA); 5417R visokohitrostna hlajena centrifuga (Eppendorf, Hamburg, Nemčija); Dvojni planetarni kroglični mlin SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Kitajska); mešalni mlin MM400 (Retsch GmbH, Haan, Nemčija); Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA); PowerPac Basic elektroforeza, PowerPac Basic transmembranski prenosni sistem, Universal Hood II kemiluminescenčni slikovni aparat, S1000 Thermal Cycler RNA reverzni transkripcijski sistem (Bio-Rad); Sistem za analizo slik tkiv in celic Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Kitajska).

Priprava naC. tubulosaNanoprah

C. tubulosa smo stehtali, nato očistili in dehidrirali. Po običajnem mletju smo fin prah C. tubulosa presejali skozi 200-mrežasto sito in ga liofilizirali. Za pripravo nanopraška C. tubulosa sta bila uporabljena temperaturno nadzorovan vakuum in visokoenergijski kroglični mlin. Najprej je bil surovi nanoprah C. tubulosa postavljen v rezervoar za vakuumsko kroglično mletje, ki je bil napolnjen s karbidnimi brusnimi kroglami. Razmerje med mlevnimi kroglicami in nanoprahom C. tubulosa je bilo od 15:1 do 5:1. Za pridobitev finega prahu sta bila hitrost in trajanje visokoenergijskega krogličnega mlina nastavljena na 300 vrtljajev na minuto oziroma 20 minut. Fini prah je bil stehtan za obdelavo nanometrskih materialov in obdelan v mešalnem mlinu s frekvenco 25/s in oscilacijo 20 s v treh ponovitvah. PBS je bil uporabljen za raztapljanje in pripravo 25 mg/mL osnovne raztopine, čemur je sledilo 30 minut ultrazvočne obdelave, avtoklaviranja in nazadnje shranjevanje pri -20 °C.

Kontrola kakovosti aktivnih komponentC. tubulosas HPLC

ECH in VER sta vsebovala gradientno elucijo s silicijevim dioksidom, vezanim na oktadecilsilanu, kot polnilom, metanolom kot mobilno fazo A in 0.1 % raztopino mravljinčne kisline kot mobilno fazo B. Valovna dolžina detekcije je bila 330 nm. ICA je vsebovala gradientno elucijo s silicijevim dioksidom, vezanim na oktadecilsilan, kot polnilo in acetonitril-vodo (30:70) kot mobilno fazo. Valovna dolžina detekcije je bila 270 nm. Vzorec, kontrola in negativna kontrola so bili za test izmerjeni po 10 µL.

Celična kultura in test MTT za merjenje viabilnosti MPP+- Obdelane celice

Celice MES23.5 smo cepili s 5 % fetalnega telečjega seruma, 1 % glutamina, 2 % 50× Satove raztopine in medijem DMEM/F12 z 2 % penicilina/streptomicina. Inkubirali smo jih pri 37 °C v inkubatorju s 5% CO2 z nasičeno vlago. Celice smo izolirali in pasirali z 0,25 % tripsina in celično suspenzijo pobrali v fazi logaritemske rasti. Izolirane celice z gostoto 1 × 105 so bile posejane v s polilizinom prevlečene 96-vdolbinice, čemur je sledil dodatek različnih končnih koncentracij (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 in 800 µmol/L). ) medijev MPP+. Celice MES23.5, ki so bile inkubirane z normalnim gojiščem 24 in 48 ur, so bile uporabljene kot negativne kontrole v poskusih in vitro. Celice iz različnih zdravljenih skupin smo inkubirali z reagentom MTT 4 ure. Raztopino v vdolbinicah smo nato zavrgli in dodali 150 µL DMSO ter nihali 10 minut. Absorbanco vsakega vzorca pri valovni dolžini 570 nm smo izmerili z avtomatskim čitalcem mikroplošč. Odstotek viabilnosti celic (%)=povprečna absorbanca poskusne skupine/povprečna absorbanca negativne kontrolne skupine × 100 %.

Ustrezne koncentracije medija MPP+ smo dodali za 24--urno obdelavo v celicah MES23.5 z uporabo enakega pristopa kot za kulturo in vitro. Po obdelavi smo raztopino v vdolbinici zavrgli. Gojišča z različnimi koncentracijami (10, 50, 100, 200, 250, 500 in 1000 µg/mL) nanopraška C. tubulosa smo dodali celicam MES23.5 v različnih vdolbinicah in jih pustili inkubirati 24 h in 48 h. Celice MES23.5, ki so bile inkubirane z normalnim gojiščem 24 in 48 ur, so bile uporabljene kot negativne kontrole. Kot nosilec so bile uporabljene celice MES23.5, ki so bile inkubirane z medijem MPP+. Meritve so bile izvedene v treh izvodih za vsak vzorec. Izmerili smo absorbanco ustrezne tretirane in kontrolne skupine za izračun viabilnosti celic.

NARAVNI IZVLEČEK CISTANCHE TUBULOSA PROTI UTRUJENOSTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Izražanje TH, izmerjeno z imunocitokemijo

Ko je bil nanoprah C. tubulosa v 100, 200 in 250 µg/ml, se je stopnja preživetja celic znatno povečala (slika 2G). Tako smo v naslednjih poskusih preizkusili tri koncentracije: skupine z nizkimi odmerki, srednjimi odmerki in skupine z visokimi odmerki. Za vsako skupino C. tubulosa so testirali tri ponovitve. Sterilizirana, s polilizinom prevlečena pokrovna stekelca so bila postavljena v 6-plošče z vdolbinicami. Nato smo v vsako vdolbinico zasejali 5 × 104 celic in jih inkubirali 24 ur. Konvencionalno sveže gojišče je bilo zamenjano v normalni kontrolni skupini in končna koncentracija 100 µmol/L MPP+ medija je bila zamenjana v preostalih zdravljenih skupinah za 24-urno inkubacijo. Konvencionalna sveža gojišča so bila nato zamenjana v običajnih kontrolnih skupinah in skupinah nosilca ter končne koncentracije 100, 200 in 250 µg/mL nanopraha C. tubulosa inkubirane s celicami 24 ur v nizkih, zmernih in visokih odmerkih skupine za zdravljenje C. tubulosa oz. Celice MES23.5 v različnih skupinah smo trikrat sprali v PBS, da smo odstranili supernatant in nadalje fiksirali v 4% paraformaldehidu 15 minut. Po izpiranju s PBS smo celice inkubirali z zaviralcem peroksidaze pri 37 °C 30 minut in nato ponovno sprali s PBS. Za permeabilizacijo celic smo 10 minut uporabili 0,2 % raztopino Triton X-100, čemur je sledilo pranje s PBS. Vsakemu vzorcu smo dodali normalni kozji serum in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut. Normalni kozji serum smo nato odstranili in vsakemu vzorcu dodali primarno protitelo, razredčeno 1:400 v PBS, in inkubirali pri 4 °C čez noč. Celice v negativni kontrolni skupini so bile inkubirane s PBS pri 4 °C čez noč. Po izpiranju s PBS smo celice inkubirali s sekundarnimi protitelesi, označenimi z biotinom, v vlažni komori pri 37 °C 20 minut. Vsak vzorec smo nato sprali v PBS in označili s konjugati hrenove peroksidaze-streptavidina (delovna raztopina C) pri 37 °C 20 minut. Po izpiranju s PBS smo celice obarvali z reagentom DAB v temi približno 1–10 minut in spremljali razvoj rjave barve pod svetlobnim mikroskopom. Vsak vzorec smo nato dvakrat sprali v destilirani vodi 1–2 minuti in jedra 0,5–1 minuto obarvali z raztopino hematoksilina. Po temeljitem izpiranju vsakega vzorca v vodi smo celice potopili v 1% alkohol klorovodikove kisline za diferenciacijo in 1% vodno raztopino amoniaka, čemur je sledilo temeljito spiranje celic v vodi. Celice iz vsakega vzorca smo nato dehidrirali v 70% etanolu 2 minuti, 80% etanolu 2 minuti, 90% etanolu 2 minuti dvakrat, 95% etanolu 2 minuti dvakrat in 100% etanolu 2 minuti dvakrat. Celice smo nato dvakrat za 2 minuti potopili v raztopino ksilena in jih namestili na stekelce z nevtralnimi smolami. Pod svetlobno mikroskopijo je bil vsak vzorec podvržen zajemanju slike in naključnemu izboru 5–10 učinkovitih vidnih polj, da bi določili izražanje izbranih proteinov v dopaminergičnih nevronih, označenih z intenzivnostjo rjavih delcev, in delno kvantificirali vsebnost proteina z njegovo povprečno sivo vrednostjo .

Stopnja apoptoze celic MES23.5, merjena s pretočno citometrijo

Adherentne celice smo enkrat sprali s PBS. Za izolacijo celic smo dodali ustrezno količino raztopine tripsina brez EDTA pri sobni temperaturi in raztopino nežno pipetirali, da so se prilepljene celice lahko ločile. Nato smo dodali gojišče celične kulture, da zaustavimo tripsinizacijo. Zmes smo prenesli v novo centrifugirno epruveto in nato centrifugirali 5 minut pri 1500 obratih na minuto, da smo zbrali izolirane celice. Po zavrženju supernatanta smo celične pelete nežno resuspendirali z uporabo PBS in celice prešteli. Približno 1 × 105 do 5 × 105 resuspendiranih celic smo centrifugirali 5 minut pri 1500 obratih na minuto in supernatant zavrgli. Pet mikrolitrov raztopine za vezavo Annexin V-FITC je bilo dodanih celični peleti, da se celice nežno ponovno suspendirajo. Dodali smo še 5 µL Annexin V-FITC in temeljito premešali. Pet mikrolitrov raztopine propidijevega jodida smo uporabili za obarvanje celic z inkubacijo pri sobni temperaturi 10 minut malo pred pretočno citometrijo.

Western blot analiza zain vitro

Celice so bile razdeljene v normalno skupino, skupino za zdravljenje z MPP+, z nizkimi odmerkiC. tubulosaskupina za zdravljenje, skupina za zdravljenje z zmernim odmerkom C. tubulosa in skupina za zdravljenje z visokim odmerkom C. tubulosa. Ekspresija Bcl2 in Bax je bila izmerjena v vsakem. Skupaj 1 × 105 celic na vdolbino v 6-plošči z vdolbinicami je bilo uporabljenih za modeliranje in zdravljenje v vsaki skupini pred nabiranjem celic. Dodali smo mešani lizat, ki je vseboval pufer RIPA, inhibitor proteaze in inhibitor fosfataze, da so celice lizirale 30 min na ledu. Po centrifugiranju smo supernatant uporabili za analizo beljakovin. Celoten protein je bil kvantificiran z uporabo BCA testa in ločen z 10 % SDS-PAGE. Ločene proteine ​​smo prenesli na membrano in inkubirali s 5% pufrom za blokiranje posnetega mleka pri sobni temperaturi 2 uri. Membrano smo nato inkubirali v primarnem protitelesu (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, razredčitev 1:200) pri 4 °C čez noč. Po koraku pranja smo membrano inkubirali v sekundarnem protitelesu (0,5 mg/ml, razredčitev 1:5000) pri 4 °C 1 uro in nato v ECL razvijalcu 2 minuti za konvencionalni razvoj. Programsko opremo Quantity One smo uporabili za polkvantitativno analizo izražanja beljakovin.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZAŠČITO JETER PROTI UTRUJENOSTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Modeliranje eksperimentalnih živali in administracija zdravil

Petdeset 8-tednov starih samcev miši brez specifičnih patogenov je bilo naključno razdeljenih v pet skupin: normalna skupina, skupina za zdravljenje z MPTP (nosilec), skupina za zdravljenje z nizkim odmerkom C. tubulosa, zdravljenje z zmernim odmerkom C. tubulosa skupina in skupina za zdravljenje z visokimi odmerki C. tubulosa. Živali so bile nameščene pri 20–22 °C s prostim dostopom do hrane in vode. Miši v normalni skupini so sedem zaporednih dni intraperitonealno injicirali enako količino fiziološke raztopine. Miši v drugih zdravljenih skupinah so intraperitonealno injicirali MPTP (30 mg/kg/dan) sedem zaporednih dni, da so določili nosilce.

Med modeliranjem PD so miši v skupinah za zdravljenje z nizkim odmerkom, zmernim odmerkom in visokim odmerkom C. tubulosa intragastrično dajali ekvivalentne klinične količine 4 g/kg/dan, 8 g/kg/dan in 16 g/dan. kg/dC. tubulosa nanoprah14 zaporednih dni. Miši v kontrolni skupini in skupini z vehiklom so 14 zaporednih dni intragastrično dajali enake količine normalne fiziološke raztopine. Vse eksperimentalne postopke je odobril Etični odbor Univerze Fujian TCM in so bili izvedeni v skladu z mednarodno sprejetimi načeli za uporabo in oskrbo laboratorijskih živali. V tej študiji so si prizadevali čim bolj zmanjšati trpljenje živali.