Kloniranje, funkcionalna identifikacija in ekspresijska analiza kalkon sintaze iz Cistanche Tubulosa

Povzetek: Cilj

Za preučevanje delovanjakalkon sintaza iz Cistanche tubulosain vzorec izražanja gena CtCHS v belih, rdečih in vijoličnih cvetovih.

MetodeGen CtCHS je bil kloniran z RT-PCR in opravljena bioinformatska analiza. Plazmid pET-28a-CtCHS smo prenesli v Escherichia coli, da induciramo ekspresijo proteina z IPTG. Rekombinantni protein CtCHS smo inkubirali s substratoma p-kumaroil CoA in malonil CoA, produkte pa smo detektirali s HPLC in MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS smo prenesli v protoplast Arabidopsis thaliana, da bi opazovali subcelično lokalizacijo proteina CtCHS. Ekspresijski vzorec gena CtCHS v cvetovih C. tubulosa s tremi barvami je bil odkrit s qRT-PCR.

RezultatiGen CtCHS je bil kloniran. Dolžina odprtega bralnega okvirja (ORF) je bila 1173 bp, ki kodira 390 aminokislin, molekulska masa proteina pa 42 8000.

ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 30 % EHINAKOZIDA IN 12 % AKTEOZIDA

CtCHS je vseboval katalitične ostanke Cys164, His303, Asn336, ki so bili ohranjeni v halkon sintazi. Protein CtCHS smo eksprimirali v E. coli in ga očistili, da smo dobili rekombinantni protein. Protein CtCHS bi lahko kataliziral p-kumaroil CoA in malonil CoA za proizvodnjo naringenin halkona. Protein CtCHS je bil v glavnem lokaliziran v citoplazmi. Gen CtCHS je bil močno izražen v vijoličnih in rdečih cvetovih, relativne ravni izražanja pa so bile 8,44-krat oziroma 3,21-krat višje kot v belih cvetovih.

Zaključek Gen CtCHS je bil kloniran iz cveta C. tubulosa in izražen je bil protein. Protein CtCHS ima funkcijo halkon sintaze, izražanje gena CtCHS pa je večje pri temnejših cvetovih, kar kaže, da lahko gen CtCHS uravnava barvo cvetov C. tubulosa, kar postavlja temelje za nadaljnje raziskave mehanizma regulacije barve cvetov C. tubuloza.

Ključne besede: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkon sintaza; analiza aktivnosti encimov; subcelularna lokalizacija; analiza izražanja

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT je rastlina iz rodu Pyreal, ki je naravno razširjena v južnem Xinjiangu [1] na območju Hetian v Xinjiangu [2]. Cvetovi cevi imajo visoko zdravilno vrednost. Njena mesna stebla so eden od virov različice 2020 "Kitajska farmakopeja". [3] Raziskave o steblih mesnih stebel cevastega cvetja so se povečale, vendar je bioloških raziskav njegovih cvetov razmeroma malo. Obdobje cvetenja cevnega cvetja je od aprila do maja [4], v glavnem Obstajajo tri barve bele , rdeči in vijolični Cvetovi so bogate barve, vendar njihov mehanizem za uravnavanje barve cvetov ni povezan z vrsto, vsebino in porazdelitvijo tkiva cvetnih listov, pigmentom in uravnavanjem okoljskih dejavnikov in genetski dejavniki [5] Pigment v rastlinskih cvetovih vključuje predvsem tri kategorije: flavonoide, karoten in beetin, najširši obseg barv [7]. kot tri sorte Paeonia Lactiflora Pall.

Videti je kot bela, glavna barva barve pa vsebuje barvo rdeče in zaradi čudovite kompetence so cvetovi prisotni vijolično-rdeči [8]. Barva cvetov je pomembna značilnost mnogih okrasnih rastlin in je tudi ključni dejavnik, ki privablja rožnate žuželke [9]. Študije so pokazale, da se prenaša. Najpogosteje žuželke obiščejo temno vijolično rastlino cistanche [10]. Za biološke raziskave o sintetičnih genetskih raziskavah cistanoidov v cvetovih cevastega cvetja cistanosaurus je ugodno za razjasnitev mehanizma za nadzor obarvanja kordona cevastega cveta, zagotavljanje teoretične podlage za izboljšanje barve tehnologije genskega inženiringa, spodbujanje njenih bogatejših barv, povečanje gledanosti, razširitev obsega aplikacij.

Biosintezna potflavonoidise začne zfenilpropanoidna pot. Fenilalanin se pod delovanjem fenilalanin amoniaze (PAL) najprej pretvori v cimetovo kislino, cimetova kislina pa se 4-hidroksilira s cimetovo kislino. Encim (-4-hidroksilaza cimetove kisline, C4H) in 4-kumarat koencim A ligaza (4-kumarat koencim A ligaza, 4CL) katalizirata reakcijo, da nastane 4-kumaroil-CoA [11]. Eno molekulo 4-kumaroil-CoA in tri molekule malonil-CoA katalizira kalkon sintaza (CHS), da nastane naringenin halkon, ki imaflavonoidne spojine.Osnovni skelet kalkon izomeraze, flavanon-3-hidroksilaze, dihidroflavonol 4-reduktaze itd. ustvarja različne flavonoide, kot so izoflavoni, flavonoli, antocianini itd. [12]. Kot ključni encim v biosintezni poti flavonoidov CHS uravnava vsebnost flavonoidov v rastlinah in ima tudi pomembno vlogo pri uravnavanju barve rastlinskih cvetov [13]. Na primer, posttranskripcijsko utišanje genov Gentiana scabra Bunge CHS lahko zavre biosintezo antocianinov in povzroči specifično beljenje venčnih rež [14]. Utišanje gena CHS Actinidia eriantha Benth. CHS zmanjša vsebnost antocianinov v cvetnih listih in povzroči, da barva rdečih cvetnih listov postane svetlejša [15]. Zato je bil v tej študiji gen CtCHS kloniran iz cvetov Cistanche deserticola in na njem je bila izvedena bioinformatska analiza, prokariontska ekspresija in čiščenje, analiza encimske aktivnosti, analiza subcelične lokalizacije in analiza ekspresije v treh barvah cvetov, da bi raziskali funkcijo CtCHS proteina in ekspresijskega vzorca gena CtCHS smo uporabili za predhodno raziskovanje razmerja med CtCHS in barvo cvetov Cistanche deserticola, kar je postavilo temelje za študij regulativnega mehanizma barve cvetov Cistanche deserticola.

1 Materiali in instrumenti

1.1 Materiali

Cvetovi Cistanche tuberosa so bili zbrani v okrožju Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang maja 2018. Med vzorčenjem je bilo upoštevano naključno načelo in izbrani so bili cvetovi Cistanche tuberosa z dobrim fiziološkim stanjem in enakomerno višino rastline. Profesor Tu Pengfei s Pekinške fakultete za farmacijo je vzel tri sorte Cistanche deserticola s tremi barvami cvetov bele, rdeče in vijolične in jih identificiral kot Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Na hitro so jih zamrznili v tekočem dušiku, shranili na suhem ledu in prepeljali v Peking. Kemično kompetentne celice E. coli DH5 so bile kupljene pri Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., kemično kompetentne celice E. coli BL21 (DE3) pa so bile kupljene pri Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor je bil kupljen pri Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA je bil kupljen pri Sigma Company, 4-kumaroil-CoA, naringenin -halkon so kupili pri Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., naringenin pa pri Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumenti

spektrofotometer Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, ZDA); gradient PCR instrument (Eppendorf Company, Nemčija); CFX 96 fluorescenčni kvantitativni PCR instrument, UVP gelski slikovnik, instrument za gelsko elektroforezo, instrument za elektroforezo proteinov (BioRad Company, ZDA); EnSpire

Čitalec mikroplošč (PerkinElmer Company, ZDA); inkubator s konstantno temperaturo (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D visoko zmogljiv oscilator polne temperature (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilator konstantne temperature vodne kopeli (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); ultra čista delovna miza AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); visokotlačni parni sterilizator (TOMY Company, Japonska); Instrument za čisto vodo Milli Q (Millipore, Združene države); LC-20Hromatograf s tekočo fazo visoke učinkovitosti (Shimadzu Company, Japonska); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap masna spektrometrija visoke ločljivosti (Thermo Fisher Company, ZDA); Laserski konfokalni mikroskop FV1200 (Olympus Company, Japonska).

2 Eksperimentalne metode

2.1 Ekstrakcija RNA in sinteza cDNA. Cvetove Cistanche deserticola smo zmleli v tekočem dušiku in nato podvrgli testu ekstrakcije RNK.

Celotno RNK smo ekstrahirali s kompletom (Norgen, Cat 17200), koncentracijo in kakovost RNK smo zaznali z NanoDrop 2000C, vzorce RNK z razmerjem A260/A280 med 1,8 in 2,1 pa smo izbrali za sintezo cDNK z reverzno transkripcijo. M-MLV reverzna transkriptaza (Promega, M170B) je bila uporabljena za reverzno transkripcijo kvalificirane celotne RNA v cDNA. Poskusne operacije smo izvedli po navodilih.

2.2 Kloniranje gena CtCHS

Na podlagi podatkov o transkriptomu cvetov Cistanche deserticola naše raziskovalne skupine [16] je bil odstranjen CtCHS s popolnim odprtim bralnim okvirjem, programska oprema SnapGene pa je bila uporabljena za oblikovanje specifičnih primerjev na podlagi genskega zaporedja (tabela 1). Pomnoževanje PCR je bilo izvedeno z uporabo cDNA cveta Cistanche deserticola kot matrice. Sistem za pomnoževanje je bil 2 × pufer Phanta Max 25 μL, mešanica dNTP (10 mmol/L) 1 μL, zgornji in spodnji primerji (10 μmol/L) po 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max SuperFidelity

DNA polimeraza 1 μL, ddH2O 17 μL. Reakcijski pogoji so bili: preddenaturacija pri 95 stopinjah 3 minute; 25 ciklov denaturacije pri 95 stopinjah za 15 s, žarjenju pri 55 stopinjah za 15 sekund in podaljšanju pri 72 stopinjah za 1 minuto; in podaljšanje reakcije pri 72 stopinjah za 5 minut. Produkt PCR je bil zaznan z elektroforezo v 1 % agaroznem gelu in komplet za čiščenje DNA (Novizan, Cat DC301-01) je bil uporabljen za pridobivanje gela, nato pa je bila pridobljena DNA prečiščena s kompletom za hitro kloniranje (Novizan, Cat C 601-01). Fragment DNA smo povezali z vektorjem pCE2 TA/Blunt-Zero, transformirali v kompetentne celice Escherichia coli DH5 in po gojenju čez noč pri 37 stopinjah izbrali enojne klonske seve in jih poslali podjetju na sekvenciranje.

Tabela 1 Primerna zaporedja

2.3 Bioinformatska analiza

Uporabite spletno programsko opremo ProtParam za analizo fizikalnih in kemijskih lastnosti beljakovin; uporabite spletno orodje Prot Scale za analizo hidrofilnosti/hidrofobnosti beljakovin; uporaba spletnega orodja SOPMA za napovedovanje sekundarne strukture beljakovin; uporabite programsko opremo za spletno analizo SWISS-MODEL za napoved terciarne strukture beljakovin; uporabite spletno programsko opremo TMHMM Predvidite transmembransko strukturo proteina; uporabite programsko opremo DNAMAN za primerjavo homologije CtCHS z aminokislinskimi zaporedji CHS drugih vrst; uporabite programsko opremo MEGA-X za izdelavo filogenetskega drevesa z uporabo sosednjega združevanja (NJ) in Poissonove korekcije. Evolucijska razdalja se izračuna z metodo Bootstrap, število ponovitev Bootstrapa pa je 1000-krat.

Za nadaljnjo detekcijo je bil uporabljen UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Pogoji tekoče faze so bili kolona Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stopinj, naringenin , halkon in naringenin. Polnilni volumen kontrolne snovi je 4 μL, polnilni volumen produkta encimske reakcije pa 7 μL. Kot mobilno fazo uporabimo vodo (A)-acetonitril (B). Gradient eluiranja je: 0 do 5 min, 30 % B; 5 do 15 min. , 30%~60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Volumetrični pretok je 0,3 ml/min. Pogoji masne spektrometrije so elektrorazpršilni ionski vir, dušik kot nosilni plin, tlak plaščnega plina 3,5 MPa, tlak pomožnega plina 1,0 MPa, tlak razpršila 3500 V, kapilarna temperatura 350 stopinj, temperatura ogrevanja pomožnega plina 200 stopinj, načini pozitivnih in negativnih ionov, skeniranje območje ionov m/z je 100-1500, polna ločljivost MS je 35 000, ločljivost dd-MS2 je 17 500, (N)

CE/stopenjski nce nastavljen na 35, 60.

2.6 Podcelična lokalizacija proteina CtCHS

Na podlagi zaporedja CtCHS in principa brezšivnega kloniranja so bili oblikovani primerji z mesti rezanja encimov Kpn Ⅰ in BamH Ⅰ, ustrezni ciljni fragmenti pa so bili pomnoženi s PCR. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP smo razgradili z restrikcijskima endonukleazama Kpn Ⅰ in BamH Ⅰ, ciljni fragment in vektor pa smo povezali prek kompleta za brezšivno kloniranje (Novizan, Cat C115-01) in nato prenesli v kompetentne celice E. coli DH5. , izberite posamezne klonske seve za sekvenciranje in ekstrahirajte plazmide iz pravilnih sevov. Plazmida pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS in pCAMBIA 1300-35S-GFP smo transformirali v protoplaste Arabidopsis thaliana z uporabo PEG4000 in gojili pri šibki svetlobi 8 do 10 ur. Podcelično lokalizacijo proteina CtCHS smo opazili pod laserskim konfokalnim mikroskopom.

2.7 Analiza vzorca izražanja CtCHS

Na podlagi zaporedja CtCHS je bil DNAMAN uporabljen za načrtovanje kvantitativnih primerjev fluorescence v realnem času, z F-boxom kot notranjim referenčnim genom. Sekvence primerjev so prikazane v tabeli 1. Relativno izražanje CtCHS v cvetovih Cistanche deserticola različnih barv je bilo odkrito s kvantitativno PCR s fluorescenco v realnem času. Uporabite TransStart Green qPCR SuperMix (polno zlato, AQ101-02) za merjenje z metodo fluorescentnega barvila SYBR Green, reakcijski sistem: 2 × TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, zgornji in spodnji primerji (10

μmol/L) {{0}}.2 μL vsak, matrica cDNA 0,5 μL, voda brez nukleotidaze 4,1 μL, za reakcijo je bila uporabljena dvostopenjska metoda, reakcijski postopek pa je temeljil na metodi Dong Xianjuan et al. [18]. Vsak vzorec je vseboval 3 biološke ponovitve, poskus pa smo ponovili trikrat. Eksperimentalni podatki so bili analizirani z uporabo Excela do 2

Relativni izraz CtCHS je bil izračunan z metodo −ΔΔCt, GraphPad Prism 8 pa je bil uporabljen za izvedbo analize pomembnosti in risanje histogramov.