Kloniranje, funkcionalna identifikacija in analiza izražanja kalkon sintaze iz Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Rezultati in analiza

3.1 Kloniranje gena CtCHS

Štiri sekvence, označene kot "halkon sintaza", so bile presejane z uporabo podatkov o transkriptomih cvetov Cistanches tubulosa. S primerjavo NCBI Blast je bilo ugotovljeno, da ima samo eno zaporedje celotno dolžino gena CHS in ima FPKM večji od 10. Specifični primerji so bili zasnovani na podlagi tega zaporedja in fragment približno 1200 bp je bil pridobljen s pomnoževanjem PCR z uporabo cDNA cveta Cistanches tubulosa kot predloga (slika 1). Produkt PCR smo pridobili v gelu in ga povezali z vektorjem pCE2TA/Blunt-Zero. Rezultati sekvenciranja so bili skladni z analizo transkriptoma. Gen so poimenovali CtCHS. Zaporedje je dolgo 1173 bp in kodira 390 aminokislin.

Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Nakupujte za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Bioinformatska analiza CtCHS

3.2.1 Fizikalne in kemijske lastnosti CtCHS ter analiza transmembranske domene

Spletna programska oprema ProtParam je bila uporabljena za analizo fizikalnih in kemijskih lastnosti proteina, ki ga kodira gen CtCHS. CtCHS kodira 390 aminokislin, molekulska formula je C1908H3041N511O562S22, relativna molekulska masa je 42 836.54, teoretična izoelektrična točka je 5,85, in je nestabilen. Koeficient II je 43,24, kar je nestabilen protein, skupna povprečna hidrofilnost (GRAVY) pa je -0,052, kar je hidrofilni protein. Spletno orodje Prot Scale je bilo nadalje uporabljeno za analizo hidrofilnosti/hidrofobnosti beljakovin. Rezultati analize so pokazali, da je bila največja vrednost hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina CtCHS 2,422 (342), najmanjša vrednost pa −2,489 (119). Peptidna veriga aminokislin, ki jo kodira gen CtCHS, ima več hidrofilnih aminokislinskih ostankov kot hidrofobnih aminokislinskih ostankov, zato je hidrofilna beljakovina. Spletna programska oprema TMHMM je bila uporabljena za napovedovanje transmembranske strukture proteina. Protein CtCHS nima transmembranske domene.

Slika 1 PCR pomnoževanje gena CtCHS

3.2.2 Napovedovanje sekundarne strukture in terciarne strukture proteina CtCHS

Za napovedovanje sekundarne strukture beljakovin je bilo uporabljeno spletno orodje SOPMA. Rezultati so prikazani na sliki 2-A. 44,87 % -vijačnic, 31,03 % naključnih zvitkov, 15,64 % podaljšanih verig in 8,46 % -listov sestavljajo sekundarno strukturo proteina CtCHS. nivojska struktura. Programska oprema za spletno analizo SWISS-MODEL je bila uporabljena za napoved terciarne strukture proteina, kristalna struktura riža CHS1 pa je bila uporabljena kot predloga za napovedovanje tridimenzionalne strukture proteina CtCHS. Rezultati so prikazani na sliki 2-B. Konzistenca med Cistanche tubulosa CtCHS in rižem CHS1 je 83,55 %.

3.2.3 Primerjava zaporedij ter analiza in uporaba filogenetskega drevesa

Programska oprema DNAMAN izvaja primerjavo homologije med CtCHS in aminokislinskimi sekvencami CHS drugih vrst. Rezultati so prikazani na sliki 3-C. Zaporedje aminokislin CtCHS je skladno s Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) in Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Aminokislinska zaporedja CHS so zelo podobna, podobnost je 90,93 %, 90,68 %, 90,18 %, 89,42 %, 89,42 % in 81,61 %.

NARAVNI ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 30% EHINAKOZIDOM IN 12% AKTEOZIDOM

Poleg tega je večkratna poravnava sekvenc pokazala tudi, da ima CtCHS ohranjene katalitične ostanke Cys164, His303 in Asn336. Za nadaljnje razumevanje evolucijskega položaja Cistanche tubulosa CtCHS v rastlinski družini CHS je bila uporabljena programska oprema MEGA-X za izdelavo filogenetskega drevesa med CtCHS in CHS proteini drugih rastlin. Rezultati so prikazani na sliki 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS je tesno povezan.

3.3 CtCHS prokariontska ekspresija in čiščenje

Plazmid pET-28a-CtCHS smo transformirali v ekspresijski sev E. coli BL21 (DE3) in ekspresijo proteina inducirali z IPTG pri nizki temperaturi. Protein smo očistili z uporabo kolone za afinitetno kromatografijo z nikljevim ionom in očiščen protein smo detektirali z 10 % SDSPAGE. Rezultati so prikazani na sliki 3. Pas proteina CtCHS se je pojavil blizu 40,000, kar je skladno z relativno molekulsko maso proteina CtCHS 42.800.

3.4 Analiza encimske aktivnosti CtCHS

Za identifikacijo delovanja CtCHS smo očiščen protein CtCHS inkubirali z malonil-CoA, 4-kumaroil-CoA in produkte odkrili s HPLC in MS. V naravnih pogojih je naringenin-halkon nestabilen v raztopini in se zlahka ciklizira v naringenin. Zato sta bila kot standardna kontrola izbrana naringenin-halkon in naringenin.

Rezultati testa HPLC so prikazani na sliki 4-A in B. Retencijski čas produkta encimske reakcije je podoben tistemu pri standardu naringenina. Oba imata največjo absorpcijo pri 289 nm v UV absorpcijskem spektru, kar se razlikuje od retencijskega časa naringenin-halkona. Časovni in UV absorpcijski spektri so bili različni, vendar kot negativna kontrola produkt po inkubaciji visokotemperaturno inaktiviranega proteina CtCHS s substratom ni vseboval naringenina, kalkona in naringenina. Nadaljnja detekcija z masno spektrometrijo je masni spekter prve stopnje (slika 4-C, D) pokazala, da ima produkt encimske reakcije [MH]-vrh m/z271.060 97, medtem ko ima naringenin [MH ]-vrh m/z 271.060 91.

Če primerjamo spektre MS2 (slika 5-E, F), imata produkt encimske reakcije CtCHS in naringenin značilne vrhove fragmentov pri m/z 107, 151 in 177, kar je skladno s poročilom iz literature [19], kar kaže, da ima CtCHS halkonski kompleks. Z encimsko aktivnostjo lahko katalizira reakcijo malonil-CoA in 4-kumaroil-CoA v naringenin-halkon.

3.5 Analiza podcelične lokalizacije

Za preučevanje vloge proteina CtCHS v celicah je bil skonstruiran plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS in preoblikovan v protoplaste Arabidopsis thaliana za opazovanje njegove podcelične lokalizacije. Rezultati so prikazani na sliki 5. Kot kontrola je bil protein pCAMBIA1300-35S-GFP porazdeljen v jedru in citoplazmi, medtem ko je bil fuzijski protein pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS porazdeljen predvsem v citoplazmi, kar kaže, da lahko protein CtCHS deluje v citoplazmi rastlinskih celic. funkcija.

3.6 Analiza vzorca izražanja CtCHS

qRT-PCR je bil uporabljen za odkrivanje relativne ekspresije CtCHS v cvetovih Cistanche deserticola s tremi barvami: belo, vijolično in rdečo. Rezultati so prikazani na sliki 6. Ekspresija CtCHS v vijoličnih in rdečih cvetovih je bila znatno večja kot v belih cvetovih. količino. V primerjavi z belimi cvetovi je stopnja izražanja CtCHS v vijoličnih cvetovih 8,44-krat višja, stopnja izražanja CtCHS v rdečih cvetovih pa 3,21-krat višja. Ti rezultati kažejo, da so lahko spremembe ravni izražanja CtCHS povezane z razliko v barvi cvetov Cistanche deserticola. Višja kot je stopnja izražanja, temnejša je barva cvetov. , nižja kot je stopnja izražanja, svetlejša je barva cvetov.

****P＜0.000 1Sl. 6 Relativna stopnja izražanja CtCHS v cvetovih različnih barv

4 Razprava

CHS je aključni encim v biosintetski poti flavonoidovin je povezan s the regulacija barve cvetovv mnogih rastlinah. Na primer, barva cvetovDianthus chinensisL.[20] in Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] vse jih prizadene CHS. nadzor.Cistanches tubulosavečinoma ima tri barve cvetov: belo, rdečo in vijolično, vendar o njegovem mehanizmu uravnavanja barve cvetov še niso poročali. V tej študiji je bil gen CtCHS kloniran z uporabo RT-PCR skozianaliza podatkov o transkriptomih cvetov Cistanches tubulosa, in njegovo

Bioinformatska analizain rezultati so pokazali, da ima CtCHS veliko podobnost in tesno genetsko povezavo z aminokislinskim zaporedjem ElCHS Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS je poliketidna sintaza tipa III (PKSIII) in študije so pokazale, da ima CHS ohranjeno katalitično triado Cys-His-Asn [23]. V tej študiji je analiza poravnave aminokislinskega zaporedja pokazala, da ima CtCHS ohranjene katalitične ostanke Cys164, His303 in Asn336, kar kaže, da ima lahko CtCHS tipično funkcijo halkon sintaze.

sposobni. Analiza encimske aktivnosti je bila izvedena z uporabo prokariontske ekspresije proteina CtCHS v Escherichia coli in detektirana s HPLC in MS. Ugotovljeno je bilo, da lahko protein CtCHS katalizira 4-kumaroil-CoA in malonil-CoA za proizvodnjo naringenin-halkona.

CHS je vključen v sintezo flavonoidov v številnih rastlinah, vendar je njegova subcelična lokacija pri različnih vrstah različna. Na primer Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] se vsi nahajajo v citoplazmi, medtem ko se Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], jajčevec Solanum melongena L. SmCHS [28] se nahaja v citoplazmi in jedru, pri grozdju Vitis vinifera L. VvCHS pa se nahaja v citoplazmi, jedru in celični steni [29]. V tej študiji je bil plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS uporabljen za transformacijo protoplastov Arabidopsis thaliana in ugotovljeno je bilo, da je protein CtCHS večinoma lokaliziran v citoplazmi in lahko katalizira proizvodnjo naringenin-halkona v citoplazmi spodbujajo kopičenje flavonoidov.

Fenilpropanoidna pot se od 4-kumaroil-CoA razveja na pot sinteze flavonoidov in biosintezo lignanov. CHS katalizira 4-kumaroil-CoA in malonil-CoA, da ustvarita naringenin in halkon za sprožitev flavonoidov. Biosintezna pot spojin podobnih spojin je prvi ključni encim na tej poti [30]. Zato je visoko izražen CHS koristen za rastline, da kopičijo višje ravni flavonoidov in proizvajajo temnejše cvetove. Na primer, stopnja izražanja CHS pri sortah Hosta plantaginea (Lam.) Aschers z vijoličnimi cvetovi je višja kot pri sortah z belimi cvetovi. Hosta HpCHS se pretvori v tobak, da se pridobi. V primerjavi z divjim tipom tobaka imajo rastline prekomerne ekspresije temnejše cvetne liste in večjo skupno vsebnost antocianinov [31].

V tej študiji je raven izražanja gena CtCHS povezana z barvo cvetov Cistanches tubulosa. Močno je izražen pri temnejših vijoličnih cvetovih in rdečih cvetovih, malo pa je pri svetlih belih cvetovih. Razlika v izražanju CtCHS je lahko posledica razlike v cvetovih Cistanches tubulosa. Eden od razlogov za različne obleke in barve. Če povzamemo, je ta študija klonirala gen CtCHS iz cvetov Cistanche deserticola in na njem izvedla bioinformatiko. Rekombinantni protein CtCHS je bil pridobljen z eksogeno ekspresijo v Escherichia coli. Analiza encimske aktivnosti je dokazala, da lahko protein CtCHS katalizira 4-kumaroil koencim. A in malonil-koencim A tvorita naringenin-halkon. Ugotovljeno je bilo, da je gen CtCHS močno izražen v vijoličnih in rdečih cvetovih ter malo v belih cvetovih. Ti rezultati kažejo, da lahko gen CtCHS uravnava proizvodnjo različnih barv cvetov pri Cistanche deserticola, kar je koristno za nadaljnje raziskave regulativnega mehanizma barve cvetov Cistanche tubulosa in zagotavlja referenco za nadaljnje raziskave o vlogi CtCHS pri regulaciji barva cvetov pri Cistanche deserticola.