Kloniranje, funkcionalna identifikacija in ekspresijska analiza kalkon sintaze iz Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Povzetek: Cilj Preučiti delovanje kalkon sintaze iz Guanhuaroucongronga (Cistanche tubulosa) in vzorec izražanja gena CtCHS v belih, rdečih in vijoličnih cvetovih.
Metode Gen CtCHS je bil kloniran z RT-PCR in opravljena bioinformatska analiza. Plazmid pET-28a-CtCHS smo prenesli v Escherichia coli, da induciramo ekspresijo proteina z IPTG. Rekombinantni protein CtCHS smo inkubirali s substratoma p-kumaroil CoA in malonil CoA, produkte pa smo odkrili s HPLC in MS. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS smo prenesli v protoplast Arabidopsis thaliana, da bi opazovali subcelično lokalizacijo proteina CtCHS. Ekspresijski vzorec gena CtCHS v cvetovihC. tubulosas tremi barvami je bila odkrita s qRT-PCR.
Rezultati Gen CtCHS je bil kloniran. Dolžina odprtega bralnega okvirja (ORF) je bila 1173 bp, ki kodira 390 aminokislin, molekulska masa proteina pa 42 8000. CtCHS je vseboval katalitične ostanke Cys164, His303, Asn336, ki so bili ohranjeni v halkon sintazi. Protein CtCHS smo eksprimirali v E. coli in ga očistili, da smo dobili rekombinantni protein. Protein CtCHS bi lahko kataliziral p-kumaroil CoA in malonil CoA za proizvodnjo naringenin halkona. Protein CtCHS je bil v glavnem lokaliziran v citoplazmi. Gen CtCHS je bil močno izražen v vijoličnih in rdečih cvetovih, relativna raven izražanja pa je bila 8,44-krat oziroma 3,21-krat višja kot pri belih cvetovih.
Zaključek Gen CtCHS je bil kloniran iz cvetaC. tubulosain beljakovine so bile izražene. Protein CtCHS ima funkcijo halkon sintaze, izražanje gena CtCHS pa je večje pri temnejših cvetovih, kar kaže, da lahko gen CtCHS uravnava barvo cvetov C. tubulosa, kar postavlja temelje za nadaljnje raziskave omehanizem regulacije barve cvetov C. tubulosa.
Ključne besede:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkon sintaza; analiza aktivnosti encimov; subcelularna lokalizacija; ekspresijska analiza
KLIKNITE TUKAJ ZA NARAVNI ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 30 % EHINAKOZIDA IN 12 % AKTEOZIDA
Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Biosintetikpot flavonoidovse začne s fenilpropanoidno potjo.Fenilalaninse najprej pretvori v cimetovo kislino poddelovanje fenilalanin amoniaze(PAL) in cimetovo kislino 4-hidroksilira cimetova kislina. Encim (-4-hidroksilaza cimetove kisline, C4H) in 4-kumaratkoencim A ligaza (4-kumaratkoencim A ligaza, 4CL) katalizirata reakcijo, da nastane 4-kumaroil-CoA [11 ]. Eno molekulo 4-kumaroil-CoA in tri molekule malonil-CoA katalizira kalkon sintaza (CHS), da nastane naringenin halkon, ki ima flavonoidne spojine. Osnovni skelet kalkon izomeraze, flavanon-3-hidroksilaze, dihidroflavonol 4-reduktaza itd. ustvarja različne flavonoide, kot so izoflavoni, flavonoli, antocianini itd. [12]. Kot ključni encim v biosintezni poti flavonoidov CHS uravnava vsebnost flavonoidov v rastlinah in ima tudi pomembno vlogo pri uravnavanju barve rastlinskih cvetov [13]. Na primer, posttranskripcijsko utišanje genov Gentiana scabra Bunge CHS lahko zavre biosintezo antocianinov in povzroči specifično beljenje venčnih rež [14]. Utišanje gena CHS Actinidia erianthaBenth. CHS zmanjša vsebnost antocianinov v cvetnih listih in naredi cvetne liste rdeče. Cvetni listi postanejo svetlejši [15]. Zato je bil v tej študiji gen CtCHS kloniran iz cvetov Cistanche tubulosa in na njem je bila izvedena bioinformatska analiza, prokariontska ekspresija in čiščenje, analiza aktivnosti encimov, analiza subcelične lokalizacije in analiza ekspresije v treh barvah cvetov, da bi raziskali funkcijo CtCHS proteina in ekspresijskega vzorca gena CtCHS smo uporabili za predhodno raziskovanje razmerja med CtCHS in barvo cvetov Cistanche tubulosa, kar je postavilo temelje za proučevanje regulacijskega mehanizmaBarva cvetov Cistanche tubulosa.
1 Materiali in instrumenti
1.1 Materiali
Cvetovi Cistanche tubulosa so bili zbrani v okrožju Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang maja 2018. Med vzorčenjem je bilo upoštevano naključno načelo in izbrani so bili cvetovi Cistanche tubulosa z dobrim fiziološkim stanjem in enakomerno višino rastline. Profesor Tu Pengfei s Pekinške fakultete za farmacijo je vzel tri sorte Cistanche tubulosa s tremi barvami cvetov bele, rdeče in vijolične in jih identificiral kot Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Hitro so jih zamrznili v tekočem dušiku in nato prepeljali v Peking v skladišču suhega ledu. Kemično kompetentne celice E. coli DH5 so bile kupljene pri Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., kemično kompetentne celice E. coli BL21 (DE3) pa so bile kupljene pri Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor je bil kupljen pri Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA je bil kupljen pri Sigma Company, 4-kumaroil-CoA, naringenin -halkon so kupili pri Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., naringenin pa pri Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenti
spektrofotometer Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, ZDA); gradient PCR instrument (Eppendorf Company, Nemčija); CFX 96 fluorescenčni kvantitativni PCR instrument, UVP gelski slikovnik, instrument za gelsko elektroforezo, instrument za elektroforezo proteinov (BioRad Company, ZDA); EnSpire
Čitalec mikroplošč (PerkinElmer Company, ZDA); inkubator s konstantno temperaturo (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D visoko zmogljiv oscilator polne temperature (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilator konstantne temperature vodne kopeli (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); ultra čista delovna miza AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); visokotlačni parni sterilizator (TOMY Company, Japonska); Instrument za čisto vodo Milli Q (Millipore, Združene države); LC-20Hromatograf s tekočo fazo visoke učinkovitosti (Shimadzu Company, Japonska); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap masna spektrometrija visoke ločljivosti (Thermo Fisher Company, ZDA); Laserski konfokalni mikroskop FV1200 (Olympus Company, Japonska).
2 Eksperimentalne metode
2.1 Ekstrakcija RNA in sinteza cDNA.
Cvetove Cistanche tubulosa smo zmleli v tekočem dušiku in nato podvrgli testu ekstrakcije RNK.
Celotna RNA je bila ekstrahirana s kompletom (Norgen, Cat 17200), koncentracija in kakovost RNA je bila zaznana z NanoDrop 2000C, vzorci RNA z razmerjem A260/A280 med 1,8 in 2,1 pa so bili izbrani za reverzno transkripcijo za sintezo cDNA. M-MLV reverzna transkriptaza (Promega, M170B) je bila uporabljena za reverzno transkripcijo kvalificirane celotne RNA v cDNA. Poskusne operacije smo izvedli po navodilih.
2.2 Kloniranje gena CtCHS
Na podlagi podatkov o transkriptomu cvetov Cistanche tubulosa naše raziskovalne skupine [16] je bil odstranjen CtCHS s popolnim odprtim bralnim okvirjem, programska oprema SnapGene pa je bila uporabljena za oblikovanje specifičnih primerjev na podlagi genskega zaporedja (tabela 1). Pomnoževanje PCR je bilo izvedeno z uporabo cDNA cveta Cistanche tubulosa kot matrice. Sistem za pomnoževanje je bil 2 × pufer Phanta Max 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, zgornji in spodnji primerji (10 μmol/L) po 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Reakcijski pogoji so bili: preddenaturacija pri 95 stopinjah 3 minute; 25 ciklov denaturacije pri 95 stopinjah za 15 s, žarjenju pri 55 stopinjah za 15 sekund in podaljšanju pri 72 stopinjah za 1 minuto; podaljšanje reakcije pri 72 stopinjah za 5 minut. Produkt PCR je bil zaznan z elektroforezo v 1 % agaroznem gelu in komplet za čiščenje DNK (Novizan, Cat DC301-01) je bil uporabljen za pridobivanje gela, nato pa je bila obnovljena DNK prečiščena s kompletom za hitro kloniranje (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNA smo povezali z vektorjem pCE2TA/Blunt-Zero, transformirali v kompetentne celice Escherichia coli DH5 in po gojenju čez noč pri 37 stopinjah izbrali enojne klonske seve in jih poslali podjetju na sekvenciranje.
Tabela 1 Primerna zaporedja
2.3 Bioinformatska analiza
Uporabite spletno programsko opremo ProtParam za analizo fizikalnih in kemijskih lastnosti beljakovin; uporabite spletno orodje Prot Scale za analizo hidrofilnosti/hidrofobnosti beljakovin; uporaba spletnega orodja SOPMA za napovedovanje sekundarne strukture beljakovin; uporabite programsko opremo za spletno analizo SWISS-MODEL za napoved terciarne strukture beljakovin; uporabite spletno programsko opremo TMHMM Predvidite transmembransko strukturo proteina; uporabite programsko opremo DNAMAN za primerjavo homologije CtCHS z aminokislinskimi zaporedji CHS drugih vrst; uporabite programsko opremo MEGA-X za izdelavo filogenetskega drevesa z uporabo sosednjega združevanja (NJ) in Poissonove korekcije. Evolucijska razdalja se izračuna z metodo Bootstrap, število ponovitev Bootstrapa pa je 1000-krat.
2.4 CtCHS prokariontska ekspresija in čiščenje
Načrtujte primerje z restrikcijskimi mesti BamHⅠ in XhoⅠ na podlagi zaporedja CtCHS in PCR pomnožite ustrezne ciljne fragmente. Vektor pET-28a in ciljni fragment sta bila razgrajena z uporabo endonukleaz BamHI in Klonirani sev je sekvenciran, plazmid pa ekstrahiran po pravilnem sekvenciranju. Plazmid pET-28a-CtCHS, preverjen s sekvenciranjem, smo prenesli v kompetentne celice Escherichia coli BL21 (DE3). Glejte metodo Ding Ning et al. [17] z izopropilom
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) je bil uporabljen za induciranje ekspresije proteina pri nizki temperaturi in je bil očiščen z Ni2+ afinitetno kromatografsko kolono (Cytiva, Cat 17531901). Protein smo koncentrirali s centrifugiranjem v ultrafiltracijski epruveti (Millipore, 30 000) in razsolili. Shranjujte v 20 mmol/L pufru KPB (pH 8,0, ki vsebuje 1 mmol/LEDTA) in shranjujte v hladilniku pri –80 stopinjah za dolgotrajno shranjevanje.
2.5 Analiza encimske aktivnosti CtCHS
Encimski reakcijski sistem CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, rekombinantni CtCHS protein 20 μL, v Po reakciji v vodni kopeli pri 37 stopinjah 12 ur smo zmes trikrat ekstrahirali z 800 μL etil acetata, posušili s pretokom dušika in nato raztopili v 100 μL metanola. Za odkrivanje produkta uporabite tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Pogoji so kolona Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura kolone 30 stopinj, prostornina vzorca 10 μL ter voda (A) in acetonitril (B) kot pretok. Faza, elucijski gradient: 0~10
min 30 % B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100%-30% B. Volumetrična hitrost pretoka je 1 ml/min in detekcija je pri valovni dolžini 290 nm.
Za nadaljnjo detekcijo je bil uporabljen UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Pogoji tekoče faze so bili kolona Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stopinj, naringenin- kontrole kalkona in naringenina. Polnilni volumen produkta je 4 μL, polnilni volumen produkta encimske reakcije pa 7 μL. Kot mobilno fazo uporabimo vodo (A)-acetonitril (B). Gradient eluiranja je: 0 do 5 min, 30 % B; 5 do 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100%-30% B. Volumetrični pretok je 0,3 ml/min. Pogoji masne spektrometrije so elektrorazpršilni ionski vir, dušik kot nosilni plin, tlak plaščnega plina 3,5 MPa, tlak pomožnega plina 1,0 MPa, tlak razpršila 3500 V, kapilarna temperatura 350 stopinj, temperatura ogrevanja pomožnega plina 200 stopinj, načini pozitivnih in negativnih ionov, skeniranje območje ionov m/z je 100-1500, polna ločljivost MS je 35 000, ločljivost dd-MS2 je 17 500, (N)
CE/stopenjski nce nastavljen na 35, 60.
2.3 Bioinformatska analiza
Uporabite spletno programsko opremo ProtParam za analizo fizikalnih in kemijskih lastnosti beljakovin; uporabite spletno orodje Prot Scale za analizo hidrofilnosti/hidrofobnosti beljakovin; uporaba spletnega orodja SOPMA za napovedovanje sekundarne strukture beljakovin; uporabite programsko opremo za spletno analizo SWISS-MODEL za napoved terciarne strukture beljakovin; uporabite spletno programsko opremo TMHMM Predvidite transmembransko strukturo proteina; uporabite programsko opremo DNAMAN za primerjavo homologije CtCHS z aminokislinskimi zaporedji CHS drugih vrst; uporabite programsko opremo MEGA-X za izdelavo filogenetskega drevesa z uporabo sosednjega združevanja (NJ) in Poissonove korekcije. Evolucijska razdalja se izračuna z metodo Bootstrap, število ponovitev Bootstrapa pa je 1000-krat.
2.4 CtCHS prokariontska ekspresija in čiščenje
Načrtujte primerje z restrikcijskimi mesti BamHⅠ in XhoⅠ na podlagi zaporedja CtCHS in PCR pomnožite ustrezne ciljne fragmente. Vektor pET-28a in ciljni fragment sta bila razgrajena z uporabo endonukleaz BamHI in Klonirani sev je sekvenciran, plazmid pa ekstrahiran po pravilnem sekvenciranju. Plazmid pET-28a-CtCHS, preverjen s sekvenciranjem, smo prenesli v kompetentne celice Escherichia coli BL21 (DE3). Glejte metodo Ding Ning et al. [17] z izopropilom
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) je bil uporabljen za induciranje ekspresije proteina pri nizki temperaturi in je bil očiščen z Ni2+ afinitetno kromatografsko kolono (Cytiva, Cat 17531901). Protein smo koncentrirali s centrifugiranjem v ultrafiltracijski epruveti (Millipore, 30 000) in razsolili. Shranjujte v 20 mmol/L pufru KPB (pH 8,0, ki vsebuje 1 mmol/LEDTA) in shranjujte v hladilniku pri –80 stopinjah za dolgotrajno shranjevanje.
2.5 Analiza encimske aktivnosti CtCHS
Encimski reakcijski sistem CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, rekombinantni CtCHS protein 20 μL, v Po reakciji v vodni kopeli pri 37 stopinjah 12 ur smo zmes trikrat ekstrahirali z 800 μL etil acetata, posušili s pretokom dušika in nato raztopili v 100 μL metanola. Za odkrivanje produkta uporabite tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Pogoji so kolona Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura kolone 30 stopinj, prostornina vzorca 10 μL ter voda (A) in acetonitril (B) kot pretok. Faza, elucijski gradient: 0~10
min 30 % B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100%-30% B. Volumetrična hitrost pretoka je 1 ml/min in detekcija je pri valovni dolžini 290 nm.
Za nadaljnjo detekcijo je bil uporabljen UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Pogoji tekoče faze so bili kolona Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stopinj, naringenin- kontrole kalkona in naringenina. Polnilni volumen produkta je 4 μL, polnilni volumen produkta encimske reakcije pa 7 μL. Kot mobilno fazo uporabimo vodo (A)-acetonitril (B). Gradient eluiranja je: 0 do 5 min, 30 % B; 5 do 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100%-30% B. Volumetrični pretok je 0,3 ml/min. Pogoji masne spektrometrije so elektrorazpršilni ionski vir, dušik kot nosilni plin, tlak plaščnega plina 3,5 MPa, tlak pomožnega plina 1,0 MPa, tlak razpršila 3500 V, kapilarna temperatura 350 stopinj, temperatura ogrevanja pomožnega plina 200 stopinj, načini pozitivnih in negativnih ionov, skeniranje območje ionov m/z je 100-1500, polna ločljivost MS je 35 000, ločljivost dd-MS2 je 17 500, (N)
CE/stopenjski nce nastavljen na 35, 60.
2.6 Podcelična lokalizacija proteina CtCHS
Na podlagi zaporedja CtCHS in principa brezšivnega kloniranja so bili oblikovani primerji z mesti rezanja encimov Kpn Ⅰ in BamH Ⅰ, ustrezni ciljni fragmenti pa so bili pomnoženi s PCR. Plazmid pCAMBIA1300-35S-GFP smo razgradili z restrikcijskima endonukleazama Kpn Ⅰ in BamH Ⅰ, ciljni fragment in vektor pa smo povezali prek kompleta za brezšivno kloniranje (Novizan, Cat C115-01) in nato prenesli v kompetentne celice E. coli DH5. , izberite posamezne klonske seve za sekvenciranje in ekstrahirajte plazmide iz pravilnih sevov. Plazmida pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS in pCAMBIA 1300-35S-GFP smo transformirali v protoplaste Arabidopsis thaliana z uporabo PEG4000 in gojili pri šibki svetlobi 8 do 10 ur. Podcelično lokalizacijo proteina CtCHS smo opazili pod laserskim konfokalnim mikroskopom.
2.7 Analiza vzorca izražanja CtCHS
Fluorescentni kvantitativni primerji v realnem času so bili zasnovani z uporabo DNAMAN na podlagi zaporedja CtCHS, s F-boxom kot notranjim referenčnim genom. Sekvence primerjev so prikazane v tabeli 1. Relativno izražanje CtCHS v cvetovih Cistanche tubulosa različnih barv je bilo odkrito s fluorescenčno kvantitativno PCR v realnem času. Uporabite TransStart Green qPCR SuperMix (polno zlato, AQ101-02) za merjenje z metodo fluorescentnega barvila SYBRGreen. Reakcijski sistem: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, zgornji in spodnji primerji (10 μmol/L) 0.2 μL vsak, cDNA predloga 0,5 μL, 4,1 μL vode brez nukleotidaze je bilo uporabljeno za reakcijo z uporabo dvostopenjske metode. Reakcijski postopek je temeljil na metodi Dong Xianjuan et al. [18]. Vsak vzorec je vseboval 3 biološke ponovitve, poskus pa smo ponovili trikrat. Eksperimentalne podatke smo analizirali z uporabo Excela, relativni izraz CtCHS smo izračunali z metodo 2−ΔΔCt, GraphPadPrism 8 pa smo uporabili za izvedbo analize pomembnosti in risanje histogramov.
