Nastavljiv nadzor ravni izražanja genov, ki ga posreduje CRISPRi, z zgrajeno RNA z enim vodilom v Escherichia Coli

POVZETEK

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-zgib). Te sgRNA so omogočile tudi modularno regulacijo z različnimi ciljnimi sekvencami DNA. Ta sistem smo uporabili za prerazporeditev presnovnega toka za proizvodnjo derivatov violaceina v predvidljivem razmerju in optimizirali proizvodnjo likopena. Ta sistem bi pomagal pospešiti procese optimizacije toka v presnovnem inženirstvu in sintetični biologiji.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

UVOD

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/povezan s CRISPR (Cas) sistem tipa II je sistem cepitve DNK, ki ga vodi RNA, sestavljen iz CRISPR RNA (crRNA), trans-aktivirajoče CRISPR RNA (tracrRNA) in proteina Cas9 (1 ,2). Cas9 iz Streptococcus pyogenes se pogosto uporablja v genomskem inženirstvu zaradi njegovih dobro opredeljenih lastnosti (3,4). Kompleks proteina spCas9, tracrRNA in crRNA veže in cepi protoprostor ciljne DNA, ki je komplementaren 20-nukleotidnemu (nt) zaporedju distančnika crRNA v prisotnosti sosednjega motiva 5'-NGG-3' protospacerja (PAM ) zaporedje (5,6). Za poenostavitev sistema je mogoče uporabiti himerično eno vodilno RNA (sgRNA), kjer sta crRNA in tracrRNA združeni z umetnim povezovalnikom, imenovanim tetraloop (5). Omogoča zamenjavo dveh ločenih RNA z eno samo molekulo RNA, zaradi česar je sistem bolj obvladljiv. Eden od sistemov, ki temeljijo na CRISPR, CRISPR interference (CRISPRi), uporablja katalitično neaktiven Cas9 (dCas9) z zamenjavo določenih aminokislin iz vsake domene endonukleaze (7). Ta modifikacija tvori ribonukleoproteinski (RNP) kompleks, ki lahko usmerja in se veže na ciljno DNA ter moti RNA polimerazo (RNAP), da zavira začetek ali elongacijo transkripcije (7). V nasprotju z izločitvijo s sistemom CRISPR/Cas9 CRISPR omogoča reverzibilno uničenje genov z izražanjem dCas9 ali sgRNA pod inducibilnim promotorjem, kar omogoča večjo prožnost pri regulaciji genov (7). Sistem CRISPRi je stokrat učinkovito utišal ciljne gene (7,8). Ciljno specifična genska represija omogoča visoko zmogljivo fenotipizacijo z uporabo skupine sgRNA v celotnem genomu (9) ali preusmeri tok ogljika v spremenjenih bakterijah proti ciljni kemikaliji (10–12). Poleg tega je bil multipleksni CRISPRi dokazan pri različnih gostiteljih z uporabo različnih metod za stabilno izražanje več sgRNA, vključno z dolgimi nizi crRNA, integracijo stikala za prste in neponavljajočimi ekstradolgimi nizi sgRNA (13–16). Te tehnike zaviranja več genov hkrati so bile uporabljene za izvajanje bolj zapletenih nalog, kot je zmanjšanje toksičnih intermediatov ali blokiranje konkurenčnih poti pri bakterijski fermentaciji (13, 16–19). Vendar popolna represija ni vedno zaželena za presnovni inženiring. Ravni izražanja genov je treba natančno nadzorovati, da se doseže optimalna encimska aktivnost med rastnimi in produkcijskimi potmi, pri čemer se uravnotežijo znotrajcelične koncentracije prekurzorja in prepreči kopičenje toksičnih intermediatov (20–22). Razvite so bile različne tehnike za inženiring učinkovitosti zatiranja CRISPRi. Manipulirali so z več dejavniki, kot je količina sgRNA in proteina dCas9 ali izbira sgRNA. Nadzor ekspresije dCas9 ali ekspresije dCas9 in sgRNA z uporabo inducibilnega promotorja je reguliral ekspresijo ciljnega gena za več kot 30--krat oziroma 300--krat (23, 24). Vendar pa je bilo ugotovljeno, da lahko modulacija koncentracije dCas9 vodi do nedosledne učinkovitosti zatiranja na različnih protoprostorcih (23). Omejeno število razpoložljivih inducibilnih promotorjev je kljub številnim prizadevanjem tudi izziv pri načrtovanju (25). Druga strategija je vstavitev za ligand specifičnega aptamera RNA v sgRNA, kjer lahko majhna sorodna molekula izpostavi distančnik in tako omogoči od odmerka odvisen nadzor CRISPRi (26). Za ligand specifična sgRNA je v pomoč, če je na voljo ustrezen par liganda in aptamera. Na učinkovitost CRISPRi vplivata tudi oddaljenost od mesta začetka transkripcije in orientacija vezave dCas9 (7). Prilagajanje razdalje med mestom vezave sgRNA in mestom začetka transkripcije lahko optimizira pot v presnovnem inženirstvu (17,27,28). Učinkovitost hibridizacije med sekvencami distančnika in protoprostornika spremeni tudi učinkovitost vezave kompleksa RNP (29–31). Zato so bila za diverzifikacijo učinkovitosti CRISPRi uvedena neskladja, ki so bila zasnovana zunaj semenske regije za spreminjanje proste energije (31, 32). Vendar pa je oblikovanje sgRNA potrebno za vsako novo ciljno sekvenco in doseganje znatne razlike v prosti energiji samo z neujemanjem je lahko izziv. Poleg tega obstaja možnost povečane netarčne vezave (33). Kljub temu je še vedno omejen na natančno zatiranje več genskih izrazov na modularen način, ne glede na ciljno zaporedje. V tej študiji smo razvili nastavljiv sistem CRISPRi, ki uravnava izražanje genov z visoko natančnostjo in predvidljivostjo. Z iterativnim razvrščanjem celic na osnovi fluorescence knjižnice sgRNA, ki cilja na tetraloop in njegovo bočno regijo, smo dosegli do 45--kratno učinkovitost transkripcijske represije, tudi če je ciljna DNK spremenjena. Ta sistem omogoča predvidljivo prerazporeditev presnovnega toka brez manipulacije gostiteljskega genoma ali sintetičnih poti, kar zagotavlja obetavno orodje za optimizacijo presnovnih poti.

MATERIALI IN METODE

Bakterijski sevi, plazmidi in reagenti

Sevi Escherichia coli in plazmidi, uporabljeni v tej študiji, so navedeni v dodatni tabeli S1. Primerji, uporabljeni v tej študiji, so navedeni v dodatni tabeli S2. Postopki kloniranja so opisani v dopolnilnih metodah. Ciljni geni in njihova ciljna zaporedja DNK za sistem CRISPR so prikazani v dodatni tabeli S3. Mach1-T1R je bil uporabljen za splošno kloniranje. Knjižnica je bila izdelana z uporabo NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Rutinske kulture za konstruiranje plazmidov in sevov so bile izvedene pri 37 °C v bujonu Luria-Bertani (LB) ali na plošči z agarjem LB, ki je vsebovala ustrezne antibiotike (34 g/ml kloramfenikola, 50 g/ml spektinomicina). PCR je bil izveden z uporabo Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Plazmide in produkte PCR smo očistili z uporabo GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit in Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology). Učinkovitost zatiranja mutantov sgRNA Nočno gojišče je bilo osveženo na OD600 0.05 in inkubirano, dokler ni doseglo vrednosti med 0,6 in 0,8. Gojišče smo nato razredčili na OD600 0,05 z 20 ng/ml aTc in inkubirali 4 ure. Fluorescenco posamezne kolonije smo izmerili pri 575 nm/616 nm z uporabo bralnika mikroplošč Hidex Sense (Hidex), vrednost OD600 pa smo določili s spektrofotometrom Jenway 7300 (Jenway). Relativna fluorescenca je bila izračunana kot fluorescenčne enote na vrednost OD600, pri čemer je bila vrednost za PC nastavljena na 100 %.

Učinki Cistanche tubulosa - zdravljenje zaprtja

presejanje knjižnice sgRNA

Uporabljena je bila enaka kulturalna metoda, kot je opisana zgoraj. Gojišča so bila razredčena na [celica]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

Ekstrakcija RNA

Celotna RNA je bila ekstrahirana z uporabo RNeasy Mini Kit (Qiagen) samo, ko je bil miRNeasy Mini Kit (Qiagen) za kvantifikacijo sgRNA, po obdelavi z RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) in shranjevanju pri –80 °C. Med postopkom ekstrakcije je bila izvedena razgradnja DNK na koloni z uporabo DNase brez RNaze (Qiagen). Kontaminacija DNK je bila preverjena s PCR brez reverzne transkripcije. Koncentracija in čistost vsakega vzorca sta bili določeni z NanoDrop One (Thermo Scientific), kakovost pa je bila ovrednotena z DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) na LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Analiza RT-qPCR

Primerji za RT-qPCR so bili pridobljeni iz laboratorijskih zalog ali zasnovani z orodjem Primer3Plus (34) in navedeni v dodatni tabeli S4. Gen CysG je bil uporabljen kot referenčni gen (35) za vse poskuse RT-qPCR. Standardna krivulja je bila ustvarjena s 10-kratnim redčenjem predloge iz 107 kopij/l na 10−1 kopij/l. Meja kvantifikacije je bila določena s prilagajanjem števila kopij in stopnje pozitivnega pomnoževanja sigmoidni funkciji ter izračunom vrednosti 95 % pozitivnega števila kopij. Linearni dinamični razpon je bil opredeljen kot najnižje število kopij, pri katerem je za nazaj izračunana variacija Cq manjša od 35 %. Vrednosti Cq nad 30 ali tiste, ki niso bile pomnožene pri kontroli brez predloge, so bile validirane. Podatki o standardni krivulji so na voljo v dodatni tabeli S5 in dodatni sliki S1. V 10 l reakciji RT-qPCR z Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB) je bilo uporabljenih skupno 2,5 ng celotne RNK. RT-PCR smo izvedli v treh izvodih na sistemu StepOnePlus™ RealTime PCR (Applied Biosystems) z naslednjimi koraki: (i) reverzna transkripcija pri 55 °C za 10 minut, čemur je sledila denaturacija pri 95 °C za 1 minuto; (ii) 40 toplotnih ciklov pri 95 °C za 10 s in 60 °C za 1 minuto; (iii) analiza talilne krivulje pri 95 °C za 15 s in 60 °C za 1 minuto, čemur sledi rampa od 60 °C do 95 °C s hitrostjo 0,3 °C/min. Relativno kvantifikacijo RNA smo določili z metodo delta-deltaCt (36) in analizirali s programsko opremo StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

RNA-sekvenciranje (RNA-seq) in analiza podatkov

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 na podlagi FPKM (fragmentov na kilobazo transkriptov na milijon preslikanih branj). Diferencialno izraženi geni so bili pridobljeni iz praga 1,5 (na osnovi log2-) in 0,01 (q-vrednost).

Proizvodnja in vzorčenje proviolaceina in prodeoksiviolaceina

Za proizvodnjo violaceina in prodeoksiviolaceina smo uporabili naslednjo sestavo medija: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 g/l ekstrakta kvasa in 1{{20}} g/l glukoze. Gojišče čez noč smo osvežili na OD600 0.1 in gojili, dokler OD600 ni dosegel med 0,6 in 0,8. Gojišče smo nato razredčili na OD600 0,1 in mu dodali 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG in 0,1 g/l L-triptofana do končnega volumna 5 ml. Vzorčili smo 300 l gojišča kulture in ga centrifugirali pri 14 000 vrtljajih na minuto 5 minut, da smo dobili celični pelet za analizo HPLC, 300 l gojišča kulture pa smo vzorčili za ekstrakcijo RNA.

HPLC analiza

Za analizo biosintetske poti violaceina smo celično peleto resuspendirali v {{0}}volumenskem metanolu, 5 minut obdelovali z ultrazvokom, centrifugirali in filtrirali skozi 0.22-m najlonski filter. HPLC analiza je sledila metodi (42) s Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m kolona (Agilent). Dve mobilni fazi, A z 0,1 % mravljinčne kisline v DDW in B z 0,1 % mravljinčne kisline v acetonitrilu, sta bili uporabljeni pri pretoku 0,6 ml/min z naslednjim profilom gradienta: 95 % A za 1,5 min, povečanje A od 95 % do 2 % za 4 minute, vzdrževanje 2 % A 2 minuti, povečevanje A od 2 % do 95 % za 30 s in vzdrževanje 95 % A 10 minut. Vzorce smo detektirali z detektorjem PDA in območje HPLC smo določili pri 600 nm za violacein in 610 nm za prodeoksiviolacein.

Proizvodnja in vzorčenje likopena

Za proizvodnjo likopena smo uporabili naslednjo sestavo medija: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0.1 ml 1 M CaCl2 in 4 g/l glukoze (22). Uporabili smo 27 g/ml kloramfenikola in 50 g/ml spektinomicina. Gojišče kulture čez noč smo osvežili na OD600 0.1 do končnega volumna 5 ml. Ko je OD600 dosegel med 0,5 in 0,6, smo dodali aTc do končne koncentracije 500 ng/ml, in ko je OD600 dosegel med 0,9 in 1, smo dodali IPTG do končne koncentracije 0,02 mM. Likopen smo ekstrahirali z acetonom, kot je opisano v referenci (22). Koncentracija likopena je bila pridobljena iz absorbance pri 475 nm z uporabo spektrofotometra Jenway 7300 z uporabo standardne krivulje. Za ekstrakcijo RNA smo vzorčili 300 l gojišča.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

REZULTATI IN RAZPRAVA

Učinki mutacij v sgRNA na učinkovitost represije sistema CRISPR

Sistem CRISPRi lahko zavre izražanje genov, ko se ternarni kompleks dCas9–sgRNA–DNA močno veže skupaj. Domnevali smo, da bi lahko učinkovitost zatiranja sistema CRISPRi spremenili na določeno raven z modulacijo tvorbe kompleksa RNP. Za količinsko opredelitev učinkovitosti represije sistema CRISPR smo zasnovali sistem poročanja o fluorescenci, ki temelji na genetskem vezju, kjer je dCas9 iz S. pyogenes induciran z anhidrotetraciklinom (aTc) in sta tako reporterski gen (mCherry) kot različice sgRNA konstitutivno izraženi (slika 1A). Ko je aTc dodan v medij, ternarni kompleks dCas9–sgRNA–DNA blokira transkripcijo reporterskega gena in raven fluorescence obratno kaže učinkovitost represije sistema CRISPR. SgRNA vsebuje skupaj 96 nukleotidov (nt). Distančna regija (prvih 20 nt) se veže na ciljno zaporedje DNA, ostalih 76 nt pa prispeva k nastanku in stabilnosti kompleksa. Ker lahko neskladja v distančni regiji izgubijo specifičnost in povečajo neciljne učinke v sistemu, ki temelji na CRISPR (33, 43), je največja dolžina sgRNA, ki jo je mogoče oblikovati, 76 nt. V tem primeru je treba pridobiti velikost knjižnice 476 (približno 1045), vendar je prevelika, da bi jo sestavili. Zato je potrebno zožiti velikost knjižnice z določitvijo specifičnih položajev na sgRNA. Najprej smo raziskali, kako mutacije v sgRNA v vsaki regiji vplivajo na represijo v sistemu CRISPR. Prejšnja študija je poročala, da so mutacije v zanki stebla 1 (sg mut01 in sg mut02) povzročile znatno zmanjšanje aktivnosti nukleaze Cas9, medtem ko so mutacije v zanki stebla 2 (sg mut03) ali zanki stebla 3 (sg mut04) ni vplival na njegovo aktivnost (44). Rekonstruirana sgRNA (sg mut05), ki vsebuje mutacije v regiji stem-loop 1 in regijah ponovitev, tetraloop, anti-repeat in stem-loop 2, je prav tako zmanjšala aktivnost nukleaze (44). Vendar je imelo v sistemu CRISPRi vseh pet različic sgRNA majhen učinek na učinkovitost represije v primerjavi z divjim tipom sgRNA (sg WT), pri čemer je vsaka različica pokazala 2–4 ​​% stopnjo fluorescence v primerjavi s pozitivno kontrolo brez distančne regije ( sg PC) (slika 1B). Ti rezultati kažejo, da je tvorba kompleksa dCas9–sgRNA manj občutljiva na modifikacijo zaporedja v regiji stebla–zanke 1 v sistemu CRISPRi, v nasprotju s sistemom CRISPR/Cas9. Domnevali smo, da je lahko odstranitev regij, povezanih s stabilnostjo kompleksa, izhodišče za nadaljnji nadzor izražanja na več ravneh. V ta namen smo izdelali okrnjeno sgRNA (sg trcSL1), ki nima povezovalca, stebla-zanke 2 in stebla-zanke 3. Ta okrnjena sgRNA ima minimalno število komponent in se je pokazalo, da znatno zmanjša aktivnost nukleaze v CRISPR/ Sistem Cas9 (5,44). Pri testiranju v sistemu CRISPRi je ta okvarjeni mutant pokazal 8-odstotno stopnjo fluorescence v primerjavi s sg PC, kar nakazuje, da se lahko še vedno veže na dCas9 in zatre gen, ki nas zanima, na določeni ravni, tudi z zmanjšano stabilnostjo ternarnega kompleksa (slika 1B). Strukturna analiza kompleksa RNP nakazuje, da so regije povezovalca, stebla–zanke 2 in stebla–zanke 3 sgRNA odgovorne za stabilizacijo kompleksa prek njihovih interakcij z nukleazno domeno dCas9, kar vodi do znatnega zmanjšanja indel učinkovitost v sistemu CRISPR/Cas9 (44). Nasprotno pa ponavljanje: regija proti ponavljanju in steblo-zanka 1 sgRNA v glavnem interagirata z domeno prepoznavanja in domeno dCas9, ki interagira s PAM, in ne vplivata bistveno na učinkovitost indela v sistemu CRISPR/Cas9 (44). Ta rezultat podpira ugotovitev, da je sg trcSL1 pokazal znatno zmanjšanje aktivnosti nukleaze v sistemu CRISPR/Cas9, medtem ko je le rahlo vplival na afiniteto vezave v sistemu CRISPRi.

Slika 1. Konstrukcija sistema in učinek mutacije sgRNA na učinkovitost represije. (A) Dvoplazmidni sistem za kvantifikacijo učinkovitosti represije. En plazmid z izvorom p15A vsebuje gen dCas9 pod aTc-inducibilnim promotorjem in gen mCherry pod konstitutivnim promotorjem. Drugi plazmid z izvorom cloDF13 vsebuje divji tip ali mutirano sgRNA pod konstitutivnim promotorjem. (B) Relativna fluorescenca vsakega mutanta sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 in sg trcSL1) in sg WT v primerjavi s sg PC. +1 do + 20 so zaporedje presledkov, ki se veže na gen mCherry. sg PC: sgRNA brez distančnika kot pozitivne kontrole, sg WT: divji tip sgRNA. Vrstice napak označujejo standardno odstopanje (n=3). P-vrednosti so bile določene z neparnim t-testom. ns: ni pomembno, **P< 0.01

Spreminjanje učinkovitosti tvorbe kompleksa za nadzor izražanja na več ravneh

Tetraloop je umetni povezovalec, ki povezuje crRNA in tracrRNA v sistemu CRISPR-Cas9 (5). Kristalna struktura ternarnega kompleksa, sestavljenega iz dCas9, crRNA in tracrRNA, je pokazala, da imajo tetraloop in njegove 5 in 3 bočne regije le malo stika z dCas9 (44). Obenem sta za funkcionalni kompleks kritični regiji ponavljanje: proti ponavljanju in steblo-zanka 1 (44). Ker ne sodeluje neposredno z dCas9, so tetraloop in njegove bočne regije raziskali kot potencialna mesta za inženiring sgRNA z dodatnimi komponentami, kot je vključevanje aptamernih sekvenc za rekrutiranje dodatnih proteinov v sgRNA (45, 46). Verjetno je, da bi mutacije v tej regiji lahko diverzificirale vezavno afiniteto med sgRNA in dCas9, ne da bi v celoti motile kompleks. Naključna knjižnica 12- mer (4 nt regije tetraloop in 4 nt 5 oziroma 3 bočnih regij) je bila zgrajena z uporabo sg trcSL1 kot predloge za nadaljnje znižanje učinkovitosti tvorbe kompleksa med sgRNA in dCas9 (slika 2A). ). Uporabili smo dvostopenjsko strategijo razvrščanja, da smo pridobili različne mutante sgRNA, ki pokrivajo učinkovitost represije med sg WT (stanje popolne represije) in sg PC (stanje brez represije). Prvotno knjižnico smo razdelili na manjše knjižnice z različnimi razponi intenzivnosti fluorescence in nato posamično identificirali fluorescenco vsake različice sgRNA iz manjše knjižnice. Porazdelitev fluorescence izvirne knjižnice, pridobljene s pretočno citometrijo, je bila skoraj enaka porazdelitvi sg PC (slika 2B). Vendar je imela po treh zaporednih korakih razvrščanja vsaka knjižnica (visoka, srednja in nizka) 63 %, 24 % in 14 % mediano ravni fluorescence v primerjavi s sg PC (slika 2B). Iz teh manjših knjižnic je bilo izoliranih dvainosemdeset kolonij s stopnjami fluorescence od 8 % do 104 % (slika 2C). Ti rezultati kažejo, da lahko mutirajoča tetraloop in njegova bočna regija sgRNA modulirata vezavno afiniteto med dCas9 in sgRNA za različne učinkovitosti zatiranja. Analiza kvantitativne PCR z reverzno transkripcijo (RT-qPCR) 10 mutantov sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, dodatna tabela S6) z različnimi fluorescenčnimi signali med sg WT in sg PC med 82 kolonijami sgRNA je pokazala, da so ravni fluorescence linearno naraščale z naraščajočimi transkripti mCherry , kar kaže, da naš sistem CRISPRi nadzoruje izražanje genov na ravni transkripcije (dodatna slika S2). Naš nastavljiv sistem CRISPRi uporablja zasnovane sgRNA, ki lahko dosežejo do 45-kratni nadzor represije, kar omogoča natančno nastavitev učinkovitosti represije brez spreminjanja količin dCas9 ali sgRNA. Pomembna prednost našega sistema je, da lahko natančno nastavi učinkovitost represije s posebnimi različicami sgRNA brez možnosti za nenamerne posledice, čeprav je potrebno dodatno kloniranje. Poleg tega krivulja rasti kaže, da naš sistem ne nalaga znatnega celičnega bremena (dodatna slika S3). Poleg tega je RNA-Seq na treh različicah sg trcSL1 z različnimi stopnjami učinkovitosti represije pokazala, da je bila ekspresija 51 do 83 genov spremenjena, v nasprotju z 262 geni, spremenjenimi v sg WT (dodatna slika S4). Ti rezultati kažejo, da so imele različice sg trcSL1 celo nižje učinke izven cilja kot običajni sistem CRISPRi. To je še posebej pomembno v aplikacijah presnovnega inženiringa, kjer optimizacija presnovnih poti pogosto vključuje manipulacijo več genov. Sposobnost natančnega prilagajanja izražanja genov brez povzročanja negativnih stranskih učinkov lahko bistveno pospeši proces optimizacije in izboljša splošno učinkovitost in produktivnost sistema.

Slika 2. Struktura knjižnice sgRNA in pregled knjižnice. (A) ogrodje sgRNA, uporabljeno v tej študiji. 12-mer, ki vsebuje tetraloop in njegovo bočno zaporedje, je naključno mutiran iz sg trcSL1, da se pridobi knjižnica sgRNA. (B) Porazdelitev fluorescence, pridobljena s pretočno citometrijo pred (levo) in po (desno) razvrščanju. Vsaka porazdelitev vsebuje 100,000 celic. (C) Fluorescenca posameznih kolonij, dobljenih iz (B). Vrstice napak označujejo standardno odstopanje (n=2).

Učinki količine dCas9 in sgRNA na učinkovitost represije

Ker bi modulacija količine dCas9 ali sgRNA lahko spremenila učinkovitost zatiranja sistema CRISPRi (23, 24), je bistveno preučiti vpliv količine dCas9 in sgRNA na učinkovitost zatiranja. Preizkusili smo delovanje našega sistema v različnih pogojih s spreminjanjem količin dCas9 in sgRNA z uporabo desetih mutantov sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Za izražanje dCas9 smo uporabili tri različne koncentracije (20, 100 in 500 ng/ml) induktorja. V primerjavi z ravnjo mRNA dCas9 pri uporabi 20 ng/ml induktorja se je dodatno povečala za 15--krat (100 ng/ml) in 22--krat (500 ng/ml) (dodatna slika S5A ). Obstajajo pomisleki glede prekomerne ekspresije dCas9, saj je lahko visoka raven dCas9 strupena za celice (47, 48) ali včasih ne (49). Vendar se je hitrost rasti zmanjšala za manj kot 10 %, ko je bilo uporabljenih do 500 ng/ml aTc, glede na krivulje rasti pri različnih koncentracijah induktorja (dodatna slika S6). To nakazuje, da količina dCas9 ni imela toksičnega učinka na E. coli v testiranih pogojih. Učinkovitost represije se je rahlo spremenila, ko je bila izražena različna količina dCas9 (slika 3A). Skladno s prejšnjo študijo je bilo, da je sistem CRISPRi dosegel največjo učinkovitost zatiranja pri [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Slika 3. Karakterizacija in modularnost nastavljivega sistema CRISPRi. (A) Relativna fluorescenca pri različnih koncentracijah aTc (20, 100 in 500 ng/ml). (B) Relativna fluorescenca pod različnimi promotorji (J23100 in UPJ23119). (C) Relativna fluorescenca pod različnimi protoprostorci. Os x označuje relativno fluorescenco mCherry, os y pa relativno fluorescenco lacI33-mCherry (rdeča) in araC33-mCherry (modra). 33 bp dodatnih zaporedij iz lacI in araC je bilo dodanih na 5-konec mCherry (56). (D) Prosta energija 12-mera in relativna fluorescenca. Črtkane črte označujejo 95-odstotni interval napovedi, polne črte pa regresijsko črto. Vrednosti dG sg trcSL1c2 ni bilo mogoče dobiti z uporabo mFold in je bila zato izključena iz analize. (A–D) Vse vrstice napak kažejo standardni odklon (n=3).

Modularnost nastavljivega sistema CRISPRi

Naš pristop z uporabo specifičnih variant sgRNA za vzdrževanje določene ravni izražanja za ciljno DNK ima potencial za uporabo kot modularni sistem. Da bi prikazali izvedljivost nastavljivega sistema CRISPRi za ciljanje na različne protospacerje, smo izdelali dva fuzijska gena (lacI{{0}}mCherry in araC33-mCherry) z dodajanjem 33 bps zaporedij iz lacI in araC do 5 -konca mCherry (56). Genom E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) vsebuje dve kopiji zaporedja protospacer za lacI33- mCherry in eno kopijo za araC33-mCherry. Vendar ta kromosomska zaporedja nimajo zaporedij PAM in jih zato kompleks dCas9-sgRNA ne more usmeriti (43). Ko so bile siRNA zasnovane tako, da ciljajo na vsak protospacer, se je učinkovitost represije dosledno vzdrževala za vse protospacerje iz lacI33, araC33 in mCherry (slika 3C). Te ugotovitve kažejo, da lahko naš nastavljiv sistem CRISPRi učinkovito uravnava izražanje genov na določeni ravni ne glede na sekvenco protospacerja. Ena možna razlaga za opaženo razmerje med tvorbo kompleksa RNP in učinkovitostjo represije je sprememba proste energije, ko se kompleks oblikuje. Umetni povezovalec tetralente in njegova bočna regija vsebujeta dva para baz A: U in G: C Watson-Crick in par baz A: G, ki ni Watson–Crick (44). Ker sta vezava crRNA in tracrRNA ključnega pomena za tvorbo kompleksa, bi mutacije, ki ciljajo na tetraloop, vplivale na vezavno afiniteto med dCas9 in sgRNA. To afiniteto je mogoče izračunati iz razlike proste energije med vezanim in neomejenim stanjem. Vendar pa je računanje proste energije omejenih stanj zahtevno (57). Domnevali smo, da se splošna struktura in stabilnost omejenega stanja ne spremenita, saj sgRNA, razvrščene iz knjižnice, niso popolnoma motile njenega delovanja. Poleg tega imata tetraloop in njegova bočna regija malo stika z dCas9 (44). Zato bi na vezavno afiniteto med dCas9 in sgRNA vplivala predvsem stabilnost sekundarne strukture tetraloopa in njegovega bočnega zaporedja. Na podlagi te zamisli smo z uporabo kalupa (58) izračunali prosto energijo tetraloopa in njegovih bočnih zaporedij. Razlika v prosti energiji zvijanja zaradi mutacij je definirana kot razlika med prosto energijo mutiranega in divjega tipa sekvenc. Lahko bi jo neposredno izračunali iz proste energije zvijanja mutantov, saj je energija zvijanja divjega tipa sekvence konstantna pri –4,3 kcal/mol. Ko se je prosta energija zgibanja povečala, se je fluorescenčni signal povečal (slika 3D). Učinkovitost represije je bila najvišja, ko je bila energija zgibanja regije, ki vsebuje tetraloop, blizu ali pod 0 kcal/mol in se je linearno zmanjšala, ko je energija zgibanja presegla 0 kcal/mol. Ta ugotovitev kaže, da je učinkovitost tvorbe kompleksa med dCas9 in sgRNA določena s sekundarno strukturo regije tetraloop, ki pomaga razložiti modularnost našega sistema. Učinkovitost zatiranja dodatne 85 sgRNA z različnimi sekvencami 12-mer iz knjižnice je bila izmerjena za nadaljnjo potrditev te povezave. Pokazal je tudi korelacijo, opaženo pri različicah sg trcSL1 (slika 3D in dodatna tabela S7), kar kaže na to, da ima tetraloop povezovalec ključno vlogo pri oblikovanju kompleksa RNP in da lahko mutacije v tej regiji vplivajo na učinkovitost sistema CRISPR. Poleg tega ta odnos kaže možnost računalniško zasnovanega načrtovanja variant sgRNA z želeno učinkovitostjo represije.

Uporaba nastavljivega sistema CRISPRi za prerazporeditev toka v biosintetični poti violaceina v E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-krat) v primerjavi z drugimi geni pri izračunu iz standardnih krivulj. Nasprotno pa je izražanje drugih nereguliranih encimov v violaceinski poti (vioA, vioB in vioE) ostalo nespremenjeno. Ti rezultati kažejo, da lahko naš sistem specifično cilja in modulira izražanje posameznih genov, ne da bi vplival na druge gene na poti. Neposredna kvantifikacija PV in PDV ni bila mogoča zaradi pomanjkanja komercialno dostopnih standardov za analizo HPLC. Tako smo izmerili titre v poljubnih enotah z uporabo površine vrha HPLC. Titer produkta je dosegel najvišjo vrednost 8 ur po indukciji in se nato postopoma zmanjšal (dodatna slika S8), verjetno zaradi pretvorbe produkta v druge stranske produkte, kot so kromoviridani, z neznanim mehanizmom (42, 64). Opaženi manjši vrhovi na spektru HPLC so pokazali prisotnost dodatnih manjših stranskih produktov. Prejšnje raziskave so pokazale, da je logaritem titra vsakega produkta v poljubnih enotah mogoče predvideti z linearnimi kombinacijami promotorske moči vsakega gena, vključenega v biosintetično pot violaceina (42). Ta log-linearni regresijski model je bil veljaven tudi v našem sistemu in povečani vioD transkripti so bili povezani s povečano produkcijo PV (slika 4B). Znano je, da je inženiring promotorja ali 5 -UTR vsakega gena, vključenega v biosintetično pot violaceina, omogočil prerazporeditev toka in optimizacijo poti (65,66). Naš sistem bi lahko deloval kot alternativna metoda, ki ponazarja nadzor transkripcije brez manipulacije promotorjev, vključenih v pot, z uporabo sintetičnih sgRNA, ki so kratke in jih je mogoče sestaviti z metodami v enem koraku. Preverjanje prek nastavljivega sistema CRISPRi omogoča preusmeritev poti s predvidljivim tokom pred neposredno manipulacijo gostiteljskih sevov ali genskih kaset, kar lahko pospeši proces.

Uporaba nastavljivega sistema CRISPRi za uravnoteženje pretoka ogljika v E. coli, ki proizvaja likopen

Učinkovita proizvodnja dragocenih spojin v presnovnem inženirstvu zahteva uravnoteženje pretoka ogljika. Pot metileritritol 4-fosfata (MEP) je presnovna pot, ki uporablja preproste prekurzorje, kot sta piruvat in gliceraldehid 3-fosfat (GAP), za proizvodnjo izoprenoidnih gradnikov, dimetilalil pirofosfata in izopentenil pirofosfata (67,68). . Te molekule sintetizirajo geranil pirofosfat, ki se pretvori v farnezil pirofosfat (FPP) (67,68). Likopen, zelo cenjen karotenoid z močnimi antioksidativnimi lastnostmi in raznoliko uporabo v različnih panogah (69), se sintetizira iz FPP preko serije encimskih reakcij iz crtE, crtB in crtI (slika 4C) (22,70). Prekurzor GAP ni bistven le za pot MEP, ampak tudi za pot glikolize (22). Pokazalo se je, da zmanjšana ekspresija gena gapA, ki kodira gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH) v poti glikolize, poveča proizvodnjo likopena s povečanjem skupine GAP (22). Zato smo ciljali na gapA s petimi različicami, vključno s tremi različicami sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 in sg trcSL1c6), ki so pokazale različno učinkovitost zatiranja, sg PC in sg WT. Vendar pa je gapA esencialni gen, ki ga ni mogoče popolnoma odpraviti (71, 72). Poskusi zatiranja gapA z običajnim CRISPRi z uporabo sg WT so bili neuspešni tudi z nizko puščanjem dcas9 pod promotorjem tet (73). Po drugi strani pa je bila večnivojska represija izražanja gena gapA z uporabo nastavljivega sistema CRISPRi dosežena brez okvare rasti in je povzročila 2.7-kratno povečanje s sg trcSL1c6 v proizvodnji likopena v primerjavi s sevom, ki v celoti izraža gen gapA po 15 urah gojenja (slika 4D in dopolnilna slika S9). Poročali so, da le 10 % naravnega izražanja gena gapA vodi do povečanega zbiranja GAP brez bistvene spremembe metabolitov na poti glikolize, kot sta 2-fosfoglicerat in 3-fosfoglicerat ( 22). Skupaj ti rezultati kažejo, da lahko nastavljiv CRISPRi natančno zavre izražanje genov na več ravneh brez kromosomskega inženiringa.

Slika 4. Uporaba nastavljivega sistema CRISPRi za biosintetično pot violaceina. (A) Biosintezna pot violaceina in konstrukcija plazmida. Pet genov (vioA, vioB, vioC, vioD in vioE), odgovornih za proizvodnjo violaceina, je bilo kloniranih v plazmid, ki izraža dCas9-. Proizvajajo se štirje glavni izdelki (violacein, proviolacein, deoksiviolacein in prodeoksiviolacein). sg WT za vioC in pet različic sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 in sg trcSL1c9) za vioD, ki kažejo različne učinkovitosti zatiranja, so klonirali v drugi plazmid. Trp: L-triptofan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoksiviolacein, DV: deoksiviolacein, PDVA: protodeoksiviolaceinska kislina, PVA: protoviolaceinska kislina. (B) Razmerje med transkripti vioD, fluorescenco mCherry in titrom PDV in PV. Os x označuje relativno vioD RNA, pridobljeno z RT-qPCR, os y na levi označuje relativno fluorescenco mCherry iz slike 3, os y na desni pa označuje razmerje površine HPLC. Vzorci z najvišjo vrednostjo vioD RNA so bili nastavljeni na 100 % za normalizacijo. (C) Biosintezna pot likopena in konstrukcija plazmida. Trije geni (crtE, crtB, crtI), odgovorni za proizvodnjo likopena, so bili klonirani v plazmid, ki izraža dCas9-. gapA je bil ciljno usmerjen z različicami sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) in sg PC je bil kloniran v drugi plazmid. Glc: glukoza, GAP: gliceraldehid 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfoglicerat, DMAPP: dimetilalil pirofosfat, IPP: izopentenil pirofosfat, FPP: farnezil pirofosfat. (D) Razmerje med transkripti gapA, fluorescenco mCherry in proizvodnjo likopena. Os x označuje relativno vrzel RNA, pridobljeno z RT-qPCR, y-os na levi označuje relativno mCherry fluorescenco s slike 3, y-os na desni pa označuje titer likopena. (B, D) Vse vrstice napak kažejo standardni odklon (n=3).

ZAKLJUČEK

Zasnovali smo nastavljiv sistem CRISPRi, ki bi lahko natančno nadzoroval izražanje genov na želeni ravni. Z mutacijo tetraloopa in njegovega bočnega območja lahko sintetične sgRNA, ki ciljajo na različne sekvence protospacerja, regulirajo gen na določeni ravni. Ta sistem smo uspešno uporabili za preusmeritev presnovnega toka, ki nas zanima, v biosintetski poti violaceina za proizvodnjo derivatov indola v predvidljivem razmerju. Poleg tega smo pokazali, da je uporaba nastavljivega CRISPRi vodila do 27-kratnega povečanja proizvodnje likopena, kar poudarja vsestranskost našega sistema za izboljšanje proizvodnje drugih dragocenih spojin. Ta sistem bi pospešil procese optimizacije toka pred trajno manipulacijo genetskih informacij gostitelja, kot je zamenjava promotorja ali 5-UTR sekvenc.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

REFERENCE

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P. in Siksnys, V. (2011) Sistem Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas zagotavlja imunost pri Escherichii coli. Nucleic Acids Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. in Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA ribonukleoproteinski kompleks posreduje specifično cepitev DNA za adaptivno imunost pri bakterijah. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA et al. . (2013) Multipleksni genomski inženiring z uporabo sistemov CRISPR/Cas. Znanost, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA in Zhang, F. (2013) Genomski inženiring z uporabo sistema CRISPR-Cas9. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA in Charpentier, E. (2012) Programabilna dvojna RNA-vodena endonukleaza DNA v prilagodljivi bakterijski imunosti. Znanost, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. in Jinek, M. (2014) Strukturne osnove PAM-odvisnega prepoznavanja ciljne DNA z endonukleazo Cas9. Narava, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP in Lim, WA (2013) Prenova CRISPR kot RNA-vodene platforme za zaporedje specifično kontrolo izražanja genov. Celica, 152, 1173–1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS in Qi, LS (2013) Interferenca CRISPR (CRISPRi) za zaporedje specifično kontrolo izražanja genov. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. in Ingolia, NT (2021) Knjižnica vodnikov za motnje CRISPR na ravni genoma omogoča celovito fenotipsko profiliranje kvasovk. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. in Woo, HM (2018) CRISPR interferenčni presnovni inženiring Corynebacterium glutamicum za proizvodnjo homo-butirata. Biotehnologija. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF in Lu, TK (2016) Presnovni inženiring Corynebacterium glutamicum z interferenco CRISPR (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375–385.

12. Zhang, GQ, Ren, XN, Liang, XH, Wang, YQ, Feng, DX, Zhang, YJ, Xian, M. in Zou, HB (2021) Izboljšanje mikrobne proizvodnje aminokislin: od običajnih pristopov do nedavnih trendov. Biotehnologija. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH in Lee, SG (2017) CRISPR interferenčno vodena multipleksna represija endogenih konkurenčnih genov poti za preusmerjanje presnovnega toka v Escherichia coli. Microb. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. in Machner, MP (2021) Multipleksno interferenčno orodje CRISPR za zasliševanje virulentnih genov pri Legionella pneumophila. Komun. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH in Chen, W. (2019) Riboregulirana gRNA s prstom za programabilno funkcijo CRISPR-Cas9. Nat. Chem. Biol., 15, 217–220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR in Salis, HM (2019) Istočasno zatiranje več bakterijskih genov z uporabo neponavljajočih se zelo dolgih nizov sgRNA. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. in Lee, TS (2019) Preusmerjanje presnovnega toka prek kombinatorne multipleksne CRISPRi posredovane represije za proizvodnjo izopentenola v Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 8, 391–402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. in Eikmanns, BJ (2019) Preprost interferenčni sistem CRISPR z dvojno inducibilnostjo za ciljanje več genov v Corynebacterium glutamicum. Plazmid, 103, 25–35.

19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. in Hudson, EP (2016) Multiple gen repression in cyanobacteria using CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. in Jung, GY (2016) Optimalno ponovno uravnoteženje poti proizvodnje 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola v Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ in Yan, Y. (2015) Regulacija presnove malonil-CoA preko sintetičnih protismiselnih RNA za izboljšano biosintezo naravnih izdelkov. Metab. Eng., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK in Jung, GY (2016) Natančno ponovno uravnoteženje prekurzorja za proizvodnjo izoprenoidov s finim nadzorom izražanja gapA v Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL in Jun,S. (2016) tCRISPRi: nastavljiv in reverzibilen, enostopenjski nadzor izražanja genov. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Ham, JY, Zalatan, JG in Carothers, JM (2018) Regulirano izražanje sgRNA uglasi CRISPRi v E. coli. Biotehnologija. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW in Sandoval, NR (2020) Biosenzorji na osnovi transkripcijskih faktorjev in inducibilni sistemi v nemodelnih bakterijah: trenutni napredek in prihodnje smeri. Curr. Opin. Biotechnol., 64, 39–46.

26. Kundert, K., Lucas, JE, Watters, KE, Fellmann, C., Ng, AH, Heineike, BM, Fitzsimmons, CM, Oakes, BL, Qu, J., Prasad, N. et al. (2019) Kontroliranje CRISPR-Cas9 z ligandom aktiviranimi in ligandno deaktiviranimi sgRNA. Nat. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. in David, F. (2019) Z modelom podprto fino uravnavanje centralnega metabolizma ogljika v kvasovkah z regulacijo na podlagi dCas9-. ACS Synth. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. in Qi,Q. (2019) Fina nastavitev hemB z uporabo CRISPRi za povečanje proizvodnje 5-aminolevulinske kisline v Escherichia coli. Spredaj. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng, T., Hou, Y., Zhang, P., Zhang, Z., Xu, Y., Zhang, L., Niu, L., Yang, Y., Liang, D., Yi, F . et al. (2017) Profiliranje specifičnosti RNA z enim vodilom razkriva jedrno zaporedje, občutljivo na neujemanje. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. in Marraffini, LA (2013) RNA-vodeno urejanje bakterijskih genomov z uporabo sistemov CRISPR-Cas. Nat. Biotehnologija,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, H. in Gross, CA (2021) Računalniška shema za načrtovanje vodilnih RNA za mismatch-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor, H. in Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi razkriva sorazmerna razmerja med ekspresijo in ustreznostjo bistvenih genov pri Escherichia coli in Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR in Martin, SE (2019) Ciljanje na več genov in toleranca za neujemanje lahko zmedejo analizo genoma široki združeni zasloni CRISPR. Genome Biol., 20, 21.

34. Rožen, S. in Skaletsky, H. (2000) Primer3 na WWW za splošne uporabnike in programerje biologe. Metode Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Zhou, K., Zhou, L., Lim, Q., Zou, R., Stephanopoulos, G. in Too, HP (2011) Novi referenčni geni za kvantificiranje transkripcijskih odzivov bakterije Escherichia coli na čezmerno izražanje beljakovin s kvantitativno PCR. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ in Schmittgen, TD (2001) Analiza podatkov o relativni genski ekspresiji z uporabo kvantitativne PCR v realnem času in metode 2(-Delta Delta C(T)). Metode, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: orodje za nadzor kakovosti za visoko zmogljive zaporedne podatke. v0.11.9 izd.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. in Salzberg, SL (2009) Ultrahitra in pomnilniško učinkovita poravnava kratkih zaporedij DNK s človeškim genomom. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM et al. (2021) Dvanajst let SAMtools in BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell, C., Williams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ in Pachter, L. (2010) Sestavljanje transkriptov in kvantifikacija z RNA-Seq razkriva neoznačene transkripte in preklapljanje izoform med celično diferenciacijo. Nat. Biotechnol., 28, 511–515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL in Pachter, L. (2013) Diferencialna analiza genske regulacije pri ločljivosti transkriptov z RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31, 46–53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ in Dueber, JE (2013) Optimizacija na ravni izražanja večencimske poti v odsotnosti visoko zmogljivega testa. Nucleic Acids Res., 41, 10668–10678.

43. Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, EJ, Wu, X., Shalem, O. et al. (2013) Specifičnost ciljanja DNA nukleaz Cas9, ki jih vodi RNA. Nat. Biotechnol., 31, 827–832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. in Nureki, O. (2014) Kristalna struktura Cas9 v kompleksu z vodilno RNA in ciljno DNA. Celica, 156, 935–949.

45. Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO in Skok, JA (2016) CRISPR-dCas9 in sgRNA ogrodja omogočajo dvobarvno živo slikanje satelitskih zaporedij in večkrat obogateni posamezni lokusi. Nat. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, H. in Houben, A. (2020) Uporaba aptamerjev izboljša slikanje rastlinskih telomerov v živo na osnovi CRISPR. Spredaj. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA in Voigt, CA (2014) Genetska vezja CRISPR/Cas z več vhodi, ki povezujejo regulatorna omrežja gostiteljev. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC in Moon, TS (2016) Programabilni nadzor izražanja bakterijskih genov s 44, 2462–2473.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. in van Teeffelen, S. (2018) Uravnavanje zmožnosti dCas9, da blokira transkripcijo, omogoča robustno, neslišno uničenje bakterijskih genov. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y. in Wen,T. (2012) Razvoj in uporaba ekspresijskega sistema, inducibilnega z arabinozo, z olajšanjem privzema induktorja v Corynebacterium glutamicum. Appl. Okolje. Microbiol., 78, 5831–5838.

51. Thompson, MG, Sedaghatian, N., Barajas, JF, Wehrs, M., Bailey, CB, Kaplan, N., Hillson, NJ, Mukhopadhyay, A. in Keasling, JD (2018) Izolacija in karakterizacija novih mutacij v izvoru pSC101, ki povečajo število kopij. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. in Polen, T. (2020) Nastavljiv ekspresijski plazmid, inducibilen z L-arabinozo, za bakterijo ocetne kisline Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen, TT, Nguyen, NH, Kim, Y., Kim, JR in Park, S. (2021) In vivo karakterizacija inducibilnega promotorskega sistema 3-hidroksipropionske dehidrogenaze pri Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. in Ledesma-Amaro, R. (2020) Multipleksirane tehnologije CRISPR za urejanje genov in regulacijo transkripcije. Nat. Commun., 11, 1281.

55. Yan, Q. in Fong, SS (2017) Študija in vitro transkripcijskih vezavnih učinkov in hrupa z uporabo konstitutivnih promotorjev v kombinaciji z zaporedji elementov UP v Escherichia coli. J. Biol. Eng., 11, 33.

56. Seo, SW, Yang, JS, Kim, I., Yang, J., Min, BE, Kim, S. in Jung, GY (2013) Napovedna zasnova iniciacijske regije prevajanja mRNA za nadzor učinkovitosti prevajanja prokariontov. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag, D. in Das,R. (2019) Slepi testi napovedi afinitete vezave RNA na beljakovine. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA, 116, 8336–8341.

58. Zuker, M. (2003) Spletni strežnik Mfold za zvijanje nukleinske kisline in napovedovanje hibridizacije. Nucleic Acids Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong, B., Zhu, Y., Tian, ​​D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Wu, H. in Xie,X. (2021) Prerazporeditev toka centralnega metabolizma ogljika za učinkovito proizvodnjo l-triptofana v Escherichia coli. Biotehnologija. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. in Hu,H. (2019) (13)C metabolični inženiring Escherichie coli, voden z analizo presnovnega toka za izboljšano proizvodnjo acetola iz glicerola. Biotehnologija. Biogoriva, 12, 29.

61. Duran, N. in Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: pregled farmakoloških in industrijskih perspektiv. Crit. Rev. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ in Walsh, CT (2006) In vitro biosinteza violaceina iz L-triptofana z encimi VioA-E iz Chromobacterium violaceum. Biokemija, 45, 15444–15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY in Lee, JW (2021) Biosenzorsko podprta prilagodljiva laboratorijska evolucija za proizvodnjo violaceina. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. in Salas, JA (2006) Ponovna ocena biosintetske poti violaceina in njegovega odnosa do biosinteze indolokarbazola. Chem. Bio. Chem., 7, 1231–1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ in Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a kombinatorni pristop za transkripcijsko uravnoteženje presnovnih poti. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. in Wang, Y. (2021) Neposredno inženirstvo RBS biosintetičnega genskega grozda za učinkovito produktivnost violaceinov v E. coli. Microb. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Nemevalonatna pot biosinteze prekurzorja izoprenoida. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer, M. (1999) Odkritje od mevalonata neodvisne poti za biosintezo izoprenoida v bakterijah, algah in višjih rastlinah. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Caris-Veyrat, C., Lowe, G. in Bohm, V. (2016) Likopen in njegova antioksidativna vloga pri preprečevanju srčno-žilnih bolezni – kritični pregled. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD in Misawa, N. (1998) Proizvodnja karotenoidov likopena, beta-karotena in astaksantina v živilskem kvasu Candida utilis. Appl. Okolje. Microbiol., 64, 1226–1229.

71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA in Henderson, IR (2018) Bistveni genom bakterije Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL in Mori, H. (2006) Konstrukcija Escherichia coli K-12 in-frame, enogenski knockout mutanti: zbirka Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram, R. in Hillen, W. (2008) Uporaba represorja Tet pri regulaciji in izražanju prokariontskih genov. Microb. Biotechnol., 1, 2–16.