Navzkrižno reaktivni, naravni IgG, ki prepoznajo L. Major, spodbujajo internalizacijo parazitov v dendritičnih celicah in spodbujajo zaščitno imunost

Povzetek

Ključna sporočila

• Z uporabo različnih gensko spremenjenih miši smo ugotovili, da so lahko ta protitelesa IgG, ne samo IgM.

Ključne besede

Leishmania major · Dendritične celice · B celice · Naravni IgG

Uvod

Okužbe z Leishmania spp. predstavljajo veliko breme v endemičnih državah. Manifestacije bolezni segajo od samoomejene kožne lišmanioze do diseminirane, ponavljajoče se mukokutane in visceralne bolezni. Nezdravljena visceralna lišmanioza resno ogroža življenje gostitelja. Cepivo še ne obstaja. Zdravilna in doživljenjskaimunostproti temu pomembnemu intracelularnemu patogenu so odvisni od razvoja celic Th1/Tc1, ki proizvajajo IFN, medtem ko sta obstojnost parazita in napredovanje bolezni povezana s prevlado celic Th2, regulatornimi celicami T in/ali odzivi Th17. Sprostitev IFN vodi do proizvodnje NO, ki odstrani parazite.Zaščitna imunitetainducirajo okužene dendritične celice (DC). Po inokulaciji bakterije Leishmania major v kožo s strani peščene muhe, življenjske oblike parazita promastigota zaužijejo kožni rezidentni makrofagi (MΦ) in nevtrofilci. Znotraj MΦ se paraziti spremenijo v nebičane življenjske oblike amastigota in se razmnožujejo. Kasneje sproščene amastigote prevzamejo druge gostiteljske celice, kot je DC. Okuženi DC obdelujejo parazitske antigene in migrirajo v drenažne bezgavke in v glavne T-celice. Sprostitev IL-12, kot tudi drugih citokinov iz okuženega DC, usmerja Th1/Tc1 izobraževanje T celic, specifičnih za parazite.

Medtem ko MΦ uporablja receptor komplementa (CR)3 za privzem parazitov, je pri DC Fc RI/III odgovoren zaparazitponotranjenje. Zanimivo je, da zgodaj privzem parazita, povezanega s CR3-, povzroči utišanje okuženega MΦ, medtem ko pri uveljavljenih okužbah privzem amastigotov, posredovan s Fc R, s strani MΦ inducira protivnetno proizvodnjo IL-10, ki spodbuja razvoj Th2/Treg in obstojnost parazitov. Fc R-posredovan privzem parazita v DC nasprotno inducira celično aktivacijo, pripravo celic CD4 T in tudi navzkrižno predstavitev antigena. Zato je protitelesno posredovan parazitski privzem DC pomemben za razvoj zaščite pred parazitom. Proizvodnja anti-leishmania IgG je torej predpogoj za učinkovito (navzkrižno) pripravo celic Th1/Tc1, specifičnih za leishmania. V skladu s tem je bil v odsotnosti celic B razvoj bolezni hujši z večjimi volumni lezij, večjimi obremenitvami s paraziti, zapoznelo pripravo celic T in zmanjšano proizvodnjo IFNΓ. Prej smo pokazali, da je bil IgG, specifičen za Leishmania, prisoten v serumih v času kopičenja DC v lezijah.

Ostaja odprto vprašanje, kako se začetni odziv celic B na samega parazita razvije v odsotnosti priprave celic B z okuženim DC. Tako imenovana naravna protitelesa, ki prepoznajo Leishmania spp. lahko olajša zgodnjeponotranjenje parazitaavtor DC. Poleg tega, ker membrane parazitov vsebujejo fosfatidilserin, podoben apoptotičnim telescem,navzkrižno reaktivenprotitelesa lahko igrajo vlogo. V tej študiji smo ocenili, ali protitelesa proti fosfolipidom, ki nastanejo, npr. med prekomerno celično smrtjo, ali naravni IgG, ki prepoznajo leishmanijo, prisotno pri neimunih živalih, prispevajo k parazitskemu jemanju DC za spodbujanje priprave celic B in T celic. Ugotovili smo, da se protitelesa proti fosfolipidom iz mišjega ali človeškega seruma kot tudi "naravni IgG" v normalnem mišjem serumu (NMS) vežejo na parazite Leishmania, kar zadostuje za spodbujanjeparazitponotranjenjez DC in spodbuja boljše rezultate bolezni in vivo.

Material in metode

Živali

Šest do osem tednov stare miši C57BL/6 so bile kupljene pri Janvierju. Miši µMT s pomanjkanjem celic B je velikodušno zagotovil Hansjörg Schild, Inštitut za imunologijo, Univerzitetni medicinski center Mainz. Miši IgGi in IgMi (obe na ozadju C57BL/6) so bile opisane prej. Vse živali so bile nameščene v posebnih pogojih brez patogenov (SPF) v Translacijskem raziskovalnem centru za živali (TARC) Univerze Johannesa Gutenberga v Mainzu. Vsi poskusi so bili izvedeni z odobrenim dovoljenjem Odbora za nego in uporabo živali dežele Rheinland-Pfalz.

Glede na zeliščne študije je bilo dokazano, da je cistanche vrsta glive, ki se že stoletja uporablja v tradicionalni kitajski medicini. Narejen je iz posušenih stebel in stebel glive, ki raste v tropskih in subtropskih predelih Azije. Običajno se uporablja zaizboljšati imuniteto, lajšanje utrujenosti ter zdravljenje prehladov in drugih okužb.

Raziskava je pokazala, dacistanchelahko poveča nastajanje protiteles, ki lahko telesu pomagajo pri boju proti tujim vsiljivcem, kot so virusi in bakterije. Ugotovljeno je bilo, da povečuje število in aktivnost celic T, vrste belih krvnih celic, ki so odgovorne za pomoč telesu pri prepoznavanju in boju proti škodljivim vsiljivcem.

Poleg tega so študije pokazale, da lahko cistanche zmanjša resnost prehladov, gripe in drugih virusnih okužb. Ugotovljeno je bilo, da skrajšuje čas, potreben, da si telo opomore od virusnih ali bakterijskih okužb. cistanche lahko tudi skrajša trajanje vročine, ki jo povzročajo nekateri virusi, ter zmanjša tveganje za razvoj sekundarnih okužb.

Poleg tegacistancheznano je, da ima protivnetne lastnosti, ki lahko zmanjšajo vnetje, povezano z nekaterimi boleznimi. Študije so tudi pokazale, da lahko dendrobium pomaga izboljšati učinkovitost nekaterih antibiotikov.

Kliknite Organic Cistanche Sald Near Me

Za več informacij nas kontaktirajte na:david.deng@wecistanche.com

Na splošno raziskave kažejo, da je cistanche lahko koristno zdravljenje zaizboljšanjeimunostin boj proti raznim okužbam. Lahko pomaga izboljšati naravno obrambo telesa, zmanjša resnost in trajanje bolezni ter lahko celo zmanjša tveganje za razvoj sekundarnih okužb.

Paraziti in okužbe 

Amastigoti ali metaciklični promastigoti L. major klona VI (MHOM/IL/Friedlin) so bili pripravljeni, kot je opisano prej. Amastigote smo izolirali iz okuženih ušes BALB/c ali µMT miši s pomanjkanjem celic B, kot je opisano prej. Izolirane parazite smo opsonizirali s 5-odstotnim NMS, IMS ali anti-PL 10 minut pri 37 stopinjah in jih sprali pred okužbami in vitro ali in vivo.

Serumi, IgG obogatitev in test vezave na parazite

Normalni mišji serum (NMS) je bil ustvarjen iz naivnih miši C57BL/6, medtem ko je bil imunski serum (IS) vzet iz ozdravljenih miši, ki so bile okužene z 2 × 10E5 metacikličnimi promastigoti L. major za večje ali enako do 6 tednov. Serumi antifosfolipidnih protiteles (PL) so bili ustvarjeni s ponavljajočo se imunizacijo z apoptotičnimi timociti. Pred odvzemom seruma je bil uspeh imunizacije preverjen z ocenjevanjem specifične vezave IgG na apoptotične celice s pretočno citometrijo ali z -glikoprotein-specifično ELISA. Skupine miši C57BL/6 smo imunizirali z rekombinantnim 2-glikoproteinom (2G) v prisotnosti Freudovega adjuvansa (FA); serum, ki vsebuje anti- 2G, smo zbrali po 4 tednih. Anti-Leishmania IgG Večji ali enak 5–6-tedenskim z L. major okuženimi BALB/c mišmi, PL- ali b2G-specifični IgG, smo pripravili iz združenih serumov z uporabo kolon proteina G (Pierce Chemical Co.) po protokolu proizvajalca. Serume smo pred čiščenjem IgG shranili pri -20 stopinjah. Očiščen IgG smo pred uporabo shranili pri 4 stopinjah (0,8 mg/mL) v PBS.

Normalni človeški serum (NHS) je bil pridobljen od zdravih kontrolnih subjektov, serum, ki je vseboval protitelesa proti lišmaniji, pa je bil pridobljen od bolnikov s kožno lišmaniozo (LM) iz Maroka. Uporabljen je bil tudi serum bolnikov z antifosfolipidnim sindromom (PL).

Paraziti (promastigoti ali amastigoti) so bili obarvani na površinsko povezan Ig z uporabo sekundarnih protiteles, specifičnih za izotip, ki reagirajo z mišjim Ig: anti-IgM (Serotec), anti-IgG1 (A85-1) in anti-IgG2a/b ( R2-40, vsi iz BD Biosciences). Po obarvanju smo parazite sprali s PBS/2 odstotki BSA, fiksirali in analizirali s pretočno citometrijo.

In vitro stimulacija

DC, pridobljen iz kostnega mozga, je bil ustvarjen v mediju RPMI/5 % FCS, dopolnjenem z IL-4 (10 µg/mL) in GM-CSF (10 µg/mL) 6 dni, kot je opisano prej. Celice smo pobrali 6. dan kot nezrele DC. 2 × 105 DC so gojili z opsoniziranimi amastigoti iz okuženih miši BALB/c ali µMT ali gojili z opsoniziranimi metacikličnimi promastigoti (MOI 1:5) 18 ur. Nato smo celice pobrali in ustvarili citospine, kot je opisano prej. Celice, obarvane z DifQuickom, so analizirali na prisotnost znotrajceličnih in zunajceličnih parazitov. Prešteli smo vsaj 200 celic na vzorec.

In vivo okužbe

Volumen lezije so merili tedensko v treh dimenzijah in so navedeni kot elipsoidi [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. Paraziti, prisotni v lezijskem tkivu, so bili našteti z uporabo testa omejevalne razredčitve, kot je opisano prej.

Za merjenje proizvodnje antigen-specifičnih citokinov smo pridobili drenažne LN celice okuženih miši C57BL/6 in pripravili enocelične suspenzije. En milijon celic LN/200 µL celotnega RPMI 1640 (Biochrome) smo dodali v 96-plošče z vdolbinicami v prisotnosti 25 ug/mL SLA. Supernatante smo pobrali 48 ur po stimulaciji in testirali z uporabo testov ELISA, specifičnih za IFNΓ (R&D Systems), kot tudi za IL-4 in IL-10 (BD).

Mieloidni človeški DC, okužen z opsoniziranimi paraziti

Mieloidni človeški CD1c plus DC (hDC) smo izolirali iz periferne krvi v skladu z navodili proizvajalca z uporabo sistema za izolacijo magnetnih celic in kompleta za izolacijo človeškega DC BDCA-1 (Miltenyi, Nemčija). 1,5 × 107 celic smo nasadili v 2,5 ml RPMI 1640/2 odstotkov avtologne plazme. Za obogatitev čistosti smo celice sprali s toplim PBS in jih končno gojili z X-VIVO 15/plazmo (1 odstotek), dopolnjeno z rekombinantnim človeškim IL-4 (150 U/mL) in GM-CSF (400 U/mL) . Nezreli hDC smo pobrali 6. dan. 2 × 105 hDC smo gojili skupaj z opsoniziranimi amastigoti iz okuženih µMT miši ali gojili z opsoniziranimi metacikličnimi promastigoti (MOI 1:5) 18 ur. Nato smo celice pobrali in ustvarili citospine, kot je opisano prej. Celice, obarvane z DifQuickom, so analizirali na prisotnost znotrajceličnih in zunajceličnih parazitov. Prešteli smo vsaj 200 celic na vzorec.

Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo StatView in neparnim Studentovim t-testom.

Rezultati

Serum, ki vsebuje antifosfolipidna protitelesa, se veže na L. major

Ker lahko paraziti vstopijo v gostiteljske celice s postopkom, imenovanim "apoptotična mimikrija", in ker življenjske oblike L. major izražajo fosfolipide na svoji površini, smo ustvarili serum, ki vsebuje antifosfolipidna protitelesa (PL) z uporabo uveljavljenih protokolov. V ta namen so bile skupine miši C57BL/6 okužene z L. major, imunizirane z apoptotičnimi timociti v prisotnosti Freudovega adjuvansa (FA). Ker je 2-glikoprotein ( 2G) primarni antigen pri antifosfolipidnem sindromu (APS), smo tudi imunizirali miši z 2G v prisotnosti FA, da smo dobili serum, ki vsebuje protitelesa proti - 2G. Kot kontrole so uporabili normalni mišji serum (NMS) neokuženih miši C57BL/6 in imunski serum (IS) miši, okuženih z L. major.

Da bi preizkusili, ali ti različni mišji serumi iz naivnih ali imuniziranih miši vsebujejo protitelesa, ki se vežejo na L. major, smo najprej ocenili vezavo protiteles na antigen parazita z ELISA, pri čemer smo kot substrat uporabili lizat zamrzovanja in odmrzovanja promastigota L. major (topni antigen Leishmania, SLA). (Slika 1A, črni stolpci). Kot standard smo uporabili IgG, izoliran iz serumov miši, okuženih z L. major. Zanimivo je, da sta serum IS in PL vsebovala primerljive ravni vezave protiteles na lizat Leishmania, kar je bilo 3–4-krat večje v primerjavi z vezavo, opaženo z NMS ali serumi miši, imuniziranih samo z adjuvansom. Poleg tega je na SLA vezan tudi serum, ki vsebuje protitelesa 2G. Z uporabo testa ELISA, specifičnega za 2G (beli stolpci), smo ugotovili visoke ravni 2G-IgG v serumu, medtem ko so bile ravni 2G IgG v vseh drugih serumih pod mejo detekcije.

sl. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 tednov z 2× 105 L. major (imunski serum, IS). Druga skupina je bila večkrat imunizirana z apoptotičnimi timociti (anti-fosfolipidni Ab, a-PL) ali rekombinantnim 2-glikoproteinom (a- 2G) v prisotnosti nepopolnega Freudsovega (FA) adjuvansa, FA je bil uporabljen kot nadzor. Serum je bil testiran na reaktivnost z ELISA testom z uporabo lizata L. major kot substrata ali 2-glikoproteina. ELISA je bila razvita z uporabo anti-mišjih IgG. Podatki so izraženi kot povprečje (±SEM, n Večje ali enako 1). B Metaciklični promastigoti L. major so bili pridobljeni iz kultur stacionarne faze (n{{10}}). C Amastigoti so bili pripravljeni iz lezij miši µMT s pomanjkanjem celic B (n=3). B in C Parazitni pripravki so bili opsonizirani z različnimi serumi (5 odstotkov, 1 0 min, 37 stopinj). Vezavo protiteles je ocenil FACS s sekundarnimi protitelesi proti miši. Vezava Ig je bila izračunana glede na izhodiščne ravni neopsoniziranih parazitov (*p manj kot ali enako 0,05, **p manj kot ali enako 0,005 in ***p manj kot ali enako 0,002)

Nato smo inkubirali metaciklične promastigote L. major na infekcijski stopnji z različnimi koncentracijami IgG, obogatenih s serumi IS, PL ali 2G. Opazili smo od odmerka odvisno vezavo IgG, pridobljenega iz IS in 2G, z največjo koncentracijo pri 100 ng/mL (slika 1B). Vezave IgG, pridobljenega iz PL, na promastigote L. major niso odkrili.

Poleg tega smo 10 minut inkubirali L. major amastigote, izolirane iz lezij miši µMT s pomanjkanjem celic B, z različnimi serumi. Paraziti so bili nato izdatno oprani in nato površinsko vezano protitelo odkrito s pretočno citometrijo po označevanju s PE-konjugiranim anti-IgG1, antiIgG2a/b ali anti-IgM (slika 1C). Kot je bilo pričakovano, je IS vseboval IgM, IgG1 in IgG2a/b, specifične za Leishmania. Potrjujemo tudi predhodno delo, saj smo odkrili IgM, specifične za Leishmania, v skupini tako imenovanih "naravnih Ab". Zanimivo je, da smo v serumu PL našli tudi IgG in IgM tako močnonavzkrižno reagirals površino L. major amastigotov. Protitelesa IgG, ki vsebujejo - 2G, se niso vezala na Leishmanio, vendar je serum 2G vseboval IgMnavzkrižno reagiranjez amastigotnimi površinami.

Navzkrižno reaktivna protitelesa posredujejo pri internalizaciji parazita z DC

Nato smo nameravali oceniti, ali so različna protitelesa IgG, ki se lahko vežejo na površino L. major amastigotov, funkcionalno aktivna. Tako smo ustvarili DC z uporabo kultur celic kostnega mozga (BM), dopolnjenih z GMCSF in IL-4. BM-DC smo pobrali kot nezrele celice 6. dan in nasadili pri 2 × 105 celic/mL. Parazitske amastigote, pridobljene iz okuženih stopal divjega tipa BALB/c ali µMT miši s pomanjkanjem celic B, so opsonizirali z različnimi serumi (5 vol. odstotkov), temeljito oprali in nato dodali DC v razmerju parazit/celica 5:1. Po 18 urah smo celice pobrali, sprali in citospinirali.

Parazitponotranjenjeje bila določena na DifQuickstained diapozitivih pri 100 × (slika 2). Kot je opisano, je bil vnos parazitov, izoliranih iz miši µMT, znatno oslabljen. Predhodna inkubacija z NMS je nekoliko povečala privzem parazitov, medtem ko je inkubacija z IS povzročila "normalizacijo" stopenj okužbe z DC na ravni, opažene pri amastigotih, pridobljenih iz BALB/c. Opozoriti je treba, da je opsonizacija parazitov s PL tudi znatno in jasno izboljšala stopnje okužbe z DC za ~ 100 odstotkov. V skladu z nižjimi stopnjami opsonizacije IgG amastigotov s serumom, ki vsebuje b2G (primerjaj sliko 1C), je to tudi povečalo stopnje okužbe z DC, vendar v manjši meri.

Slika 2Opsonizacija L. major z navzkrižno reaktivnimi protitelesi vodi do povečanega privzema parazita z DC. Nezreli C57BL/6 BMDC(2× 105) smo gojili skupaj z amastigoti iz BALB/c ali miši µMT s pomanjkanjem celic B (1:3). Pred soinkubacijo so amastigote opsonizirali z normalnim mišjim serumom (NMS), imunskim serumom (IS), serumom, ki je vseboval protitelesa proti fosfolipidom, pridobljenim s ponavljajočo se imunizacijo z apoptotičnimi timociti (aPL), ali serumom, ki je vseboval anti- 2 glikoprotein protitelesa (2G). Po 18 urah so bile stopnje okužbe določene na citospinih s svetlobno mikroskopijo (n=3, *p Manjše ali enako 0.05,**p Manjše ali enako 0,005, in ***p manj kot ali enako 0,002 v primerjavi z neosoniziranimi kontrolami)

Navzkrižno reaktivna protitelesa proti fosfolipidom izboljšajo rezultate bolezni pri kožni lišmaniozi

V naslednjih poskusih smo želeli oceniti, ali je opsonizacija parazita znavzkrižno reaktivenprotiteles spremeni izide bolezni in vivo. V ta namen so bili metaciklični promastigoti izolirani in obogateni iz kultur parazitov opsonizirani z različnimi serumi, kot je opisano zgoraj. Parazit, opsoniziran z NMS, je služil kot negativna kontrola. Po obsežnem pranju parazitov so bile skupine petih miši C57BL/6 intradermalno okužene s 103 L. major. Razvoj lezije so spremljali približno 4 mesece. V skladu s prejšnjimi ugotovitvami so paraziti, opsonizirani z IS, povzročili manjše lezije ušes v skladu s povečano pogostnostjo okuženega kožnega DC v zgodnjih časovnih točkah (slika 3). Presenetljivo je, da so paraziti, opsonizirani s PL ali 2G, podobno spodbujali podobno izboljšane rezultate bolezni, kar je bilo ugotovljeno s 50-odstotnim zmanjšanim obsegom lezije med 5. in 8. tednom po okužbi.

Navzkrižno reaktivna protitelesa proti fosfolipidom izboljšajo rezultate bolezni pri kožni lišmaniozi

V naslednjih poskusih smo želeli oceniti, ali je opsonizacija parazita znavzkrižno reaktivenprotiteles spremeni izide bolezni in vivo. V ta namen so bili metaciklični promastigoti izolirani in obogateni iz kultur parazitov opsonizirani z različnimi serumi, kot je opisano zgoraj. Parazit, opsoniziran z NMS, je služil kot negativna kontrola. Po obsežnem pranju parazitov so bile skupine petih miši C57BL/6 intradermalno okužene s 103 L. major. Razvoj lezije so spremljali približno 4 mesece. V skladu s prejšnjimi ugotovitvami so paraziti, opsonizirani z IS, povzročili manjše lezije ušes v skladu s povečano pogostnostjo okuženega kožnega DC v zgodnjih časovnih točkah (slika 3). Presenetljivo je, da so paraziti, opsonizirani s PL ali 2G, podobno spodbujali podobno izboljšane rezultate bolezni, kar je bilo ugotovljeno s 50-odstotnim zmanjšanim obsegom lezije med 5. in 8. tednom po okužbi.

Nato smo uporabili µMT amastigote, inkubirane s 100 µg IgG, obogatenega z NMS, IS ali PL (slika 4). Spet smo opazili, da sta oba IgG iz IS ali PL povzročila blažjo bolezen z manjšimi lezijami v primerjavi z neopsoniziranimi paraziti (slika 4A). V skladu s tem je obremenitev lezijskega tkiva s paraziti, kot je bilo ugotovljeno v 6. tednu po okužbi, pokazala (znatno) manjšo obremenitev s paraziti pri okužbah, ki so se sprožile v prisotnosti protiteles, ki vežejo parazite (slika 4B). Antigen-specifična ponovna stimulacija dreniranih celic bezgavk s SLA je pokazala nespremenjene ravni IFN, medtem ko so bile nižje ravni IL-4 in IL-10 ugotovljene pri tistih miših, okuženih z IgG-opsoniziranimi paraziti (slika 4C) . To je v skladu z zmanjšanimi velikostmi lezij, saj je predhodno delo pokazalo, da je izločanje parazitov pri miših odvisno od aktivacije okuženega MΦ z lezijskim IFN, ki ga uniči IL-4 in — kar je zelo pomembno — IL-10 . Kot taki so učinki IL-10 na okuženi MΦ vodili do obstojnosti parazita. Tako se zdi, da je razmerje med IFN na eni strani in citokini, povezanimi s Th2/Treg, kot sta IL-4 in IL-10, najbolj pomembno za izid bolezni.

Zanimivo pa je, da so v tej nastavitvi opazili tudi manjše količine lezij, ko so za opsonizacijo uporabili IgG iz NMS, kar kaže na prisotnostnavzkrižno reaktivennaravna protitelesa tudi v serumu naivnih miši.

Protitelesa, specifična za Leishmania, in navzkrižno reaktivna protitelesa lahko nadomestijo genetsko pomanjkanje IgG

Za boljšo analizo specifičnega prispevka podtipov imunoglobulina pri odzivu na Leishmanio smo uporabili miši IgMi in IgG1i, ki smo jih predhodno ustvarili. Miši IgMi so miši, pri katerih vse celice B izražajo IgM, vendar ne morejo zamenjati razreda niti izločati protiteles. Pri miših IgG1i se vse celice B razvijejo z uporabo IgG1 kot svojega celičnega receptorja B, vendar te celice tudi ne morejo zamenjati razreda, lahko pa izločajo protitelesa IgG1. Miši IgMi in IgG1i na genetskem ozadju C57BL/6 smo okužili s 103 L. major. Ugotovili smo, da je prisotnost IgG1 v serumih zadostovala, da so miši dosegle popoln odziv na parazita, podobno kot divje živali (slika 5A). V nasprotju s tem pa je odsotnost izločenih protiteles, kot so jih opazili pri miših IgMi, zadostovala za odložitev okrevanja miši (slika 5A).

Nato smo rekonstituirali miši IgMi ali kontrole divjega tipa z NMS ali IS in jih nato okužili z L. major promastigoti. Kot je bilo pričakovano, je pri obeh mišjih sevih rekonstitucija IS povzročila bistveno manjše lezije in vivo, kar potrjuje, da z IgG posredovan pospešen privzem parazitov z DC spodbuja izboljšano anti-Leishmaniaimunost(Slika 5B). Na koncu smo ocenili izid bolezni po uporabi opsoniziranih parazitov. Pred okužbo miši IgMi so bili paraziti opsonizirani z IgG, obogatenim s serumom NMS, IS ali PL (slika 5C). V skladu s poskusom, prikazanim na sliki 5B, so IS-opsonizirani paraziti olajšali izboljšano obrambo parazitov. Ponovno so lahko antifosfolipidna protitelesa nadomestila IgG, specifičen za Leishmania, iz IS, saj sta obe protitelesi IgG, vezani na L. major promastigote pred okužbo, spodbudili boljše rezultate bolezni pri miših IgMi. Opsonizirani paraziti z IS in PL so povzročili znatno manjše količine lezij in zgodnejše celjenje v primerjavi z neopsoniziranimi paraziti.

Pomembno je, da je dajanje NMS mišim IgMi "normaliziralo" njihov fenotip na izid bolezni, opažen pri miših C57BL/6 (slika 5B). Te ugotovitve so v skladu z našimi zgoraj prikazanimi podatki, ki kažejo, da NMS vsebuje tudi anavzkrižno reaktivenizotip protiteles IgG, ki se lahko veže na parazite s kasnejšimi funkcionalnimi posledicami in vitro in in vivo. Nadaljnja potrditev prihaja iz miši IgMi, okuženih s paraziti, prevlečenimi z NMS, ki so lahko tudi bolje nadzorovale okužbo (slika 5C).

sl. 4Paraziti, opsonizirani s protitelesi, inducirajo učinkovito imunost v µMT s pomanjkanjem celic B. Paraziti so bili opsonizirani z običajnim mišjim serumom (NMS), imunskim serumom (IS), serumom, ki je vseboval antifosfolipidna protitelesa (a-PL) ali — samo miši C57BL/6 — serumom, ki je vseboval protitelesa proti - 2 glikoproteinu (2G) v prisotnost Freudovega adjuvansa (FA). Skupine večjih ali enakih 5 µMT miši so bile okužene z 103 opsoniziranimi metacikličnimi promastigoti L. major. Razvoj lezije so ocenjevali tedensko. B V 6. tednu so bile obremenitve lezijskih parazitov pri okuženih miših µMT določene s testom omejitve redčenja. Prikazane so posamezne številke parazitov; palice izražajo sredstva. C Profile citokinov drenažnih celic µMT LN smo določili s ponovno stimulacijo s topnim antigenom Leishmania (SLA). Sproščanje IFNΓ, IL{{10}} in IL-10 v supernatante 48-h je bilo ocenjeno z ELISA (povprečje±SEM, n=15 miši/skupino iz neodvisnih 3 poskusi, *p manj kot ali enako 0.05, **p manj kot ali enako 0,005 in ***p manj kot ali enako 0,002 v primerjavi z mišmi, okuženimi z neopsoniziranimi paraziti)

Človeški serum vsebuje funkcionalno aktivna, navzkrižno reaktivna protitelesa proti parazitom

Da bi preizkusili ustreznost naših ugotovitev za ljudi, smo promastigote ali amastigote, izolirane iz miši µMT s pomanjkanjem celic B, opsonizirali z normalnim človeškim serumom (NHS), serumom bolnikov, okuženih z L. major (LM), ali serumom bolnikov z APS (APS). ). Površinsko vezan IgG na parazite smo določili s pretočno citometrijo. Zanimivo je, da se serum LM šibko veže na površine promastigotov, vendar močno na amastigote. Zanimivo je, da je APS serum vseboval podobne ravni IgGnavzkrižno reaktivens površinami parazitov (slika 6A).

IgG smo nato obogatili iz serumov LM z uporabo kolon proteina A (slika 6B). To in različne koncentracije intravenskih imunoglobulinov (IVIG), ki se uporabljajo za zdravljenje različnih (imunskih) motenj bolnikov, so nato pred pretočno citometrijo uporabili za opsonizacijo parazitov. Leishmania IgG je v veliki meri vezan na promastigote in amastigote L. major. Zanimivo je, da komercialno dostopen IVIG vsebuje IgG, kinavzkrižno reagiraltako s promastigotom kot tudi s pripravki za zajedavce amastigota.

Končno smo CD1c in primarni mieloidni človeški DC iz buffy coats inkubirali z µMT amastigoti L. major, inkubiranimi s serumom LM ali serumom bolnikov z APS ali IVIG (MOI 3; slika 7). S potrditvijo naših podatkov pri miših z uporabo človeških celic smo opazili, da prisotnost IgG (navzkrižno reaktivenali Leishmania specifična) na površinah Leishmania zadostuje za spodbujanje okrepljenegaparazitponotranjenjeavtor DC. Serum APS je povečal odstotek okuženih DC za skoraj 100 odstotkov, medtem ko sta serum LM in IVIG povečala privzem parazitov za 30 odstotkov v primerjavi z neopsoniziranimi paraziti. Zanimivo je, da je serum NMS vseboval tudi IgG, ki je reaktiven na paraziteparazitponotranjenje.

sl. 5 Miši C57BL/6, IgMi in IgGi, rekonstituirane z različnimi serumi ali okužene z različno očiščenim IgG opsoniziranim L. major, kažejo izboljšane rezultate bolezni. Skupina večjih ali enakih 5 miši C57BL/6, C57BL/6 IgMi ali IgGi je bila okužena s fiziološkim nizkim odmerkom inokuluma L. major (103 metaciklični promastigoti). B En teden pred okužbo so miši C57BL/6 in B6 IgMi rekonstituirali ip dvakrat z 100 µL normalnega mišjega seruma (NMS) ali imunskega seruma (IS). C Pred okužbo miši IgMi so bili paraziti opsonizirani z IgG, obogatenim iz serumov z vezavo na kolone proteina A [normalni mišji serum (NMS), imunski serum (IS) ali serum, ki vsebuje protitelesa proti fosfolipidom (a-PL)]. Razvoj lezije A–C so ocenjevali tedensko (povprečje ± SEM, n=10 miši/skupino iz 2 neodvisnih poskusov, *p manj kot ali enako 0,05, **p manj kot ali enako 0,005 in *** p Manjše ali enako 0,002 v primerjavi s C57BL/6 [A], C57BL/6 ali IgMi [B] ali nič [C])

sl. 6Antifosfolipidna protitelesa v človeških serumih navzkrižno reagirajo s površinskimi molekulami L. major. Metaciklični promastigoti iz kultur stacionarne faze ali lezijski amastigoti L. major, izolirani iz miši µMT, so bili opsonizirani z različnimi vrstami človeških serumov (5 odstotkov) ali prečiščenimi IgG. Normalni človeški serumi (NHS) so bili pridobljeni od zdravih kontrolnih oseb. Uporabljeni so bili tudi serumi bolnikov z dokazano kožno lišmaniozo (LM, pridobljeno v Maroku, n=4) in bolnikov z antifosfolipidnim sindromom (PL, n=3). B IgG je bil obogaten iz serumov LM z uporabo stolpcev proteina A (n=3). Uporabljene so bile različne koncentracije intravenskih imunoglobulinov (IVIG, n=2) (µg/mL). Parazite A in B smo s pretočno citometrijo analizirali glede površinske vezave celotnega humanega Ig. Vezava Ig je bila izračunana glede na izhodiščne ravni neopsoniziranih parazitov (povprečje±SEM, *p Manjše ali enako 0.05, **p Manjše ali enako {{10 }}.005 in ***p Manjše ali enako 0,002)

Diskusija

Zdravljenje kožne lišmanioze zahteva učinkovito pripravo T-celic in sproščanje IFN, ki sta odvisna od okuženega DC za predstavitev antigenov naivnim T-celicam. Za razliko od CR3-odvisne fagocitoze z MΦ smo to pokazaliparazitponotranjenjez DC se pojavi prek Fc RI in Fc RIII, ki lahko nadomeščata drug drugega. Kot take so pri miših s pomanjkanjem Fc-, Fc RI/Fc RIII in miših µMT s pomanjkanjem celic B (vse na ozadju C57BL/6) zaradi oslabljenega DC- odvisno pripravo celic T. Naša trenutna študija potrjuje to predhodno opažanje, vendar poleg tega naši podatki z uporabo miši IgMi in IgGi tudi kažejo, da so resnično izločena protitelesa in ne zgolj prisotnost celic B ključnega pomena za vzpostavitev učinkovitega odziva na parazita. Kot take, podobno kot pri miših s pomanjkanjem celic B, so miši IgMi s celicami B, ki niso sposobne proizvajati IgG, pokazale večje velikosti lezij v primerjavi z mišmi IgGi ali mišmi divjega tipa.

Ker so bili opsonizirani amastigoti z NMS in IS prevzeti v podobnem obsegu in promastigoti, opsonizirani z NMS, niso bili fagocitirani z DC (z učinkovito vezavo IgM na njihovo površino), smo predhodno ugotovili, da IgM ni potreben za privzem parazita. V tej študiji smo te ugotovitve lahko potrdili z uporabo normalnih mišjih serumov pri miših, ki nimajo B celic v celoti ali pa le izločajo protitelesa. Nadalje smo lahko pokazali, da so serumi, ki vsebujejo IgG1-, lahko povečali vstop amastigotov v človeški in mišji DC.

Ostalo je nerešeno, kako se razvije začetni odziv celic B v odsotnosti okuženega DC. Ena od možnosti je bila, da v skupini "naravnih" IgG,navzkrižno reaktivenprotitelesa lahko prepoznajo parazite in služijo kot nadomestek za protitelesa, specifična za Leishmania, ki se razvijejo pozneje (naraščajo med 4. in 6. tednom po okužbi). Poleg protiteles, specifičnih za antigen, celice B-1 proizvajajo tako imenovana naravna protitelesa tako pri miših kot pri ljudeh po rojstvu. Nekateri imajo sposobnost prepoznavanja lastnih antigenov; dolgo časa je veljalo, da nimajo specifičnosti za tuje antigene. Kasneje so podatki zagotovili dokaze, da naravni IgM prepoznavajo različne mikrobne antigene in prispevajo k odstranitvi patogenov. Nedavno pa je več študij razkrilo, da ima naravni IgG vlogo priprirojeno imunostprav tako. Pokazalo se je, da medsebojno deluje z lektini, povezanimi s patogeni (npr. MBL), in tvori imunske komplekse za čiščenje patogenov. Pričakuje se tudi, da bo naravni IgG, vezan na patogen, medsebojno deloval z drugimi PRR, kot je C1q, da aktivira klasično pot komplementa. Pokazalo se je, da naravni IgG specifično sodeluje z lektini, povezanimi s patogeni, da izzove učinkovito protimikrobno delovanje proti oportunistični okužbi s Pseudomonas aeruginosa in Staphylococcus aureus.

Med apoptotično celično smrtjo opazimo izpostavljenost fosfatidilserinu (PS) na apoptotičnih telescih. Gostiteljovo prepoznavanje PS na površini umirajočih ali odmrlih celic prek protiteles je pomemben korak pri njihovem odstranjevanju. V procesu, imenovanem "apoptotična mimikrija", je znano, da paraziti Leishmania izpostavijo tudi PS na svoji površini, ki služi kot signal "pojej me" za fagocitne celice, podobno kot opazimo apoptotične celice. Poleg tega nekateri promastigoti v nalezljivi fazi umrejo (brez vpletenosti kaspaz) in sami izpostavijo PS. Obligate intracelularne življenjske oblike amastigota pa vse izpostavijo PS na svoji površini, kar jim omogoča učinkovit vstop v gostiteljske celice. Zdaj smo ocenili, ali so umetno inducirana PL protitelesa sposobna prepoznati parazite Leishmania in ali so ti funkcionalno aktivni, da olajšajo vstop parazita v ustrezne gostiteljske celice. Opazili smo, da mišja in človeška antifosfolipidna protitelesa vežejo življenjske oblike leishmanije. Z različnimi pristopi smo identificiralinavzkrižno reaktivenprotitelesa v serumu PL, ki se zdi, da se prednostno vežejo na površinske fosfolipide L. major. Zanimivo je, da čeprav promastigotni paraziti izražajo tudi te fosfolipide, kot je bilo dokazano z uporabo topnega parazitskega antigena iz te življenjske oblike parazita v ELISA, se zdi, da so površinski fosfolipidi bolj izpostavljeni na amastigotih. Poleg tega smo pokazali, da je bila ta opsonizacija IgG zadostna za spodbujanje privzema parazita z DC. Pomembno je, da so in vivo PL-opsonizirani paraziti povzročili izboljšan izid bolezni z manjšimi volumni lezij in zgodnejšo razrešitvijo lezij. Tako je v skladu s predhodnimi opažanji naše skupine zaradi povečane okužbe z DC v prisotnosti(navzkrižno reaktiven)IgG na parazitih je bila inducirana prednostna indukcija celic Th1/Tc1, povezana z zmanjšanim številom celic Th2 in Treg in s tem boljšim izidom bolezni.

Slika 7Primarni mieloidni DC iz človeške krvi prednostno internalizira parazitenavzkrižno reaktivenantifosfolipidni IgG vezan na njihovo površino. CD1a plus mieloidni človeški DC smo izolirali iz buffy plaščev z uporabo kroglic MACS in nasadili pri 2 × 105 celic/ml. Amastigote, izolirane iz miši µMT, smo pred soinkubacijo z DC (1:3) inkubirali s 5 odstotki seruma ali 10 µg/mL IVIG. Po 18 urah so bile stopnje okužbe določene na citospinih s svetlobno mikroskopijo (n=3, *p manj kot ali enako 0,05 in ***p manj kot ali enako 0,002 v primerjavi z neosoniziranimi kontrolami)

Zanimivo je, da smo ugotovili, da so paraziti, opsonizirani z NMS, spodbujali boljše rezultate bolezni v primerjavi z neopsoniziranimi paraziti, kar kaže na prisotnost naravnega IgG v NMS, ki lahko prepozna Leishmanio. To je bilo najbolje vidno pri IgMi (brez celic B, ki so sposobne proizvajati kakršne koli IgG), nadomeščenih z NMS. Tu so bile očitno večje velikosti lezij pri miših IgMi zmanjšane na tiste pri miših divjega tipa C57BL/6 (slika 5). Vendar pa prisotnost naravnega, Leishmanianavzkrižno reaktivenIgG so opazili tudi pri miših divjega tipa, okuženih z NMS-opsoniziranimi paraziti, v primerjavi z neopsoniziranimi paraziti. Specifičnost teh naravnih IgG v mišjem in človeškem serumu do danes ni jasna. Mamljivo je špekulirati, da so to tudi protitelesa, ki prepoznajo PS na površinah parazitov, saj se prednostno vežejo na amastigote z znano večjo izpostavljenostjo PS tudi v primerjavi s promastigoti.

Ugotovili smo, da je serum zdravih človeških kontrolnih preiskovancev (iz regije, kjer je lešmanioza prijavljena le kot potovalna bolezen in brez zgodovine prejšnje okužbe) vseboval tudi IgG, ki se lahko veže na L. major amastigote in spodbuja povečan privzem parazita z DC. Pomembno je omeniti, da je IVIG, uporabljen za našo študijo, pripravljen v Nemčiji (neendemično za lišmaniozo). Zanimivo je, da je obogaten človeški IgG iz IVIG iz Leishmania-negativnih posameznikov tako vseboval IgG, ki je bil sposoben vezati promastigote in (verjetno zaradi večje izpostavljenosti PS) L. major amastigote. V skladu s tem je serum bolnikov z APS z visokimi ravnmi antifosfolipidnih protiteles vseboval IgG, ki se je prednostno vezal na amastigote, manj pa na promastigote. Tako IgG iz serumov APS kot tudi IgG iz IVIG so spodbujali povečan privzem parazitov s primarnim človeškim DC do stopnje, ki je primerljiva (ali celo boljša v primeru serumov APS, ki vsebujejo PL) z IgG, pridobljenim iz imunskega seruma, pri bolnikih z lišmaniozo.

Če povzamemo, naši podatki kažejo, da običajni mišji in človeški serumi, tudi vzeti od posameznikov, ki nikoli niso bili izpostavljeni lišmaniji, vsebujejo protitelesa IgG, ki se lahko vežejo na tega parazita, olajšajo njegovo zajetje z DC in povečajo zaščitni imunski odziv parazita. gostitelj. Čeprav prepoznani antigeni Leishmania niso popolnoma jasni, je lahko del reaktivnosti usmerjen proti fosfolipidom, ki jih je več na amastigotu v primerjavi s površinami promastigota. Naše ugotovitve lahko utrejo pot oblikovanju boljše terapije za tega parazita in lahko celo služijo kot prvi previdnostni ukrep za posameznike, ki potujejo na območja, okužena z lišmanijo.

Zahvala

Avtorji se iskreno zahvaljujejo Marku C. Udeyu in Philippu von Landenbergu za koristne razprave in za posredovanje vzorcev bolnikov.

Avtorski prispevek 

FD, SLK in ST so izvedli poskuse, opisane v tem rokopisu. ST, AW in EvS so zagotovili sredstva za projekt in nadzorovali delo. AW in EvS sta napisala rokopis.

financiranje

Financiranje odprtega dostopa omogoča in organizira Projekt DEAL. Študija je bila podprta s sredstvi DFG (SFB 490 za EvS in AW ter SFB 1292 za EvS, AW in ST) in Centra za molekularno medicino (CMMC) Köln za EvS.

Dostopnost podatkov in materialov 

Se ne uporablja.

Izjave

Etična odobritev in soglasje za sodelovanje

Vsi poskusi z mišmi so bili izvedeni v skladu z navodili dežele Porenje Pfalz.

Soglasje za objavo

Vsi avtorji soglašajo z objavo.

Konkurenčni interesi

Avtorji izjavljajo, da ni konkurenčnih interesov.

Odprt dostop Ta članek je licenciran pod licenco Creative Commons Attribution 4.0 International License, ki dovoljuje uporabo, skupno rabo, prilagajanje, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju ali formatu, če navedete ustrezno priznanje izvirnemu avtorju (s) in vir, navedite povezavo do licence Creative Commons in navedite, ali so bile narejene spremembe. Slike ali drugo gradivo tretjih oseb v tem članku so vključeni v licenco Creative Commons za članek, razen če je v kreditni liniji za gradivo navedeno drugače. Če gradivo ni vključeno v licenco Creative Commons za članek in vaša predvidena uporaba ni dovoljena z zakonskimi predpisi ali presega dovoljeno uporabo, boste morali pridobiti dovoljenje neposredno od imetnika avtorskih pravic.

Reference

1.Burza S, Croft SL, Boelaert M (2018) Leishmaniasis Lancet 392:951–970.

2. von Stebut E, Tenzer S (2018) Kožna lišmanioza: različne funkcije dendritičnih celic in makrofagov v interakciji imunskega sistema gostitelja z Leishmania major. Int J Med Microbiol 308: 206–214.

3. Sacks D, Noben-Trauth N (2002) Imunologija občutljivosti in odpornosti na Leishmania major pri miših. Nat Rev Immunol 2:845–858.

4. de Freitas ESR, von Stebut E (2021) Razkrivanje vloge imunskih kontrolnih točk pri lejšmaniozi. Front Immunol 12:620144.

5. Schonlau F, Scharfetter-Kochanek K, Grabbe S, Pietz B, Sorg C, Sunderkotter C (2000) Pri eksperimentalni lejšmaniozi pomanjkanje CD18 povzroči širjenje parazitov, povezano s spremenjenimi funkcijami makrofagov in nepopolnim odzivom celic Th1. Eur J Immunol 30: 2729–2740.

6. Woelbing F, Kostka SL, Moelle K, Belkaid Y, Sunderkoetter C, Verbeek S, Waisman A, Nigg AP, Knop J, Udey MC, et al (2006) Vnos Leishmania major v dendritične celice posredujejo receptorji Fcgamma in olajša pridobivanje zaščitne imunosti. J Exp Med 203: 177–188

7. Nagele EP, Han M, Acharya NK, DeMarshall C, Kosciuk MC, Nagele RG (2013) Naravna avtoprotitelesa IgG so številna in vseprisotna v človeških serumih, na njihovo število pa vplivata starost, spol in bolezen. PLoS ONE 8:e60726.

8. Lutz HU, Binder CJ, Kaveri S (2009) Naravna avtoprotitelesa v homeostazi in bolezni. Trendi Immunol 30: 43–51.

9. Wanderley JL, Barcinski MA (2010) Apoptoza in apoptotična mimikrija: povezava Leishmania. Cell Mol Life Sci 67:1653–1659.

10. Waisman A, Croxford AL, Demircik F (2008) Nova orodja za preučevanje vloge celic B pri okužbah s citomegalovirusom. Med Microbiol Immunol 197: 145–149

11. Von Stebut E, Ehrchen JM, Belkaid Y, Kostka SL, Molle K, Knop J, Sunderkotter C, Udey MC (2003) Interlevkin 1alfa spodbuja diferenciacijo Th1 in zavira napredovanje bolezni pri miših BALB/c, občutljivih za Leishmania major. J Exp Med 198: 191–199

12. Levine JS, Subang R, Nasr SH, Fournier S, Lajoie G, Wither J, Rauch J (2006) Imunizacija z apoptotičnim proteinom, ki veže celice, povzema nefritis in sekvenčni pojav avtoprotiteles sistemskega eritematoznega lupusa. J Immunol 177: 6504–6516.

13. Wanderley JLM, DaMatta RA, Barcinski MA (2020) Apoptotična mimikrija kot strategija za vzpostavitev parazitskih okužb: fosfatidilserin, pridobljen iz parazitov in gostiteljev, kot ključna molekula. Cell Commun Signal 18:10.

14.McDonnell T, Wincup C, Buchholz I, Pericleous C, Giles I, Ripoll V, Cohen H, Delcea M, Rahman A (2020) Vloga beta-2-glikoproteina I pri povezovanju strukture zdravja in bolezni s funkcijo : več kot le APS. Blood Rev 39:100610.

15. Dominguez M, Torano A (1999) Opsonofagocitoza, posredovana z imunsko adherenco: mehanizem okužbe z leishmanijo. J Exp Med 189: 25–35.

16. Belkaid Y, Hofmann KF, Mendez S, Kamhawi S, Udey MC, Wynn TA, Sacks DL (2001) Vloga interlevkina (IL)-10 pri obstojnosti Leishmania major v koži po celjenju in terapevtski potencial protiteles proti receptorju IL-10 za sterilno zdravljenje. J Exp Med 194: 1497–1506.

17. Waisman A, Kraus M, Seagal J, Ghosh S, Melamed D, Song J, Sasaki Y, Classen S, Lutz C, Brombacher F et al (2007) CD22 zavira signalizacijo celičnih receptorjev IgG1 B in spodbuja razvoj celic B, katerih preživetje je manj odvisno od Ig{alpha}/{beta}. J Exp Med 204: 747–758

18. Panda S, Ding JL (2015) Naravna protitelesa premostijo prirojeno in adaptivno imunost. J Immunol 194: 13–20.

19. Puga I, Cerutti A (2013) Zaščita z naravnimi IgG: sladko partnerstvo s topnimi lektini je dobro! EMBO J 32: 2897–2899.

20. Duncan AR, Winter G (1988) Vezavno mesto za C1q na IgG. Narava 332: 738–740.

21. Panda S, Zhang J, Tan NS, Ho B, Ding JL (2013) Naravna protitelesa IgG zagotavljajo prirojeno zaščito pred opsoniziranimi bakterijami debelega črevesa. EMBO J 32: 2905–2919.

22. El-Hani C, Borges V, Wanderley JL, Barcinski M (2012) Apoptoza in apoptotična mimikrija pri Leishmaniji: evolucijska perspektiva. Front Cell Infect Microbiol 2:96.

Za več informacij nas kontaktirajte na:david.deng@wecistanche.com tel:0013632399501