Dietni kakavovi flavanoli izboljšajo mitohondrijsko funkcijo v skeletnih mišicah in spremenijo metabolizem celotnega telesa pri zdravih miših
Mar 14, 2022
za več informacij kontaktirajte:tina.xiang@wecistanche.com
Povzetek: Mitohondrijska disfunkcija je pogosto opisana pri različnih boleznih in prispeva k njihovi patogenezi. Ocenili smo učinekkakavovi flavanolidodatki na delovanje mitohondrijev in celotno presnovo ter raziskali smo, ali je mitohondrijska deacetilaza sirtuin-3 (Sirt3) vključena ali ne. Raziskali smo učinke 15-dnevnega dodajanja CF pri divjih tipih in Sirt3-/miškah. Presnovo celotnega telesa so ocenili s posredno kalorimetrijo in opravili peroralni test tolerance za glukozo za ocenometabolizem glukoze. Mitohondrijsko dihalno funkcijo smo ocenili v permeabiliziranih vlaknih in kvantificirali vsebnost piridinskih nukleotidov (NAD plus in NADH). Pri divjem tipu je dodatek CF znatno spremenil metabolizem celotnega telesa s spodbujanjem uporabe ogljikovih hidratov in izboljšano toleranco za glukozo. Dodatek CF je povzročil znatno povečanje mitohondrijske mase, medtem ko je prišlo do pomembne kvalitativne prilagoditve za vzdrževanje proizvodnje H2O2 in celičnega oksidativnega stresa. Dodatek CF je povzročil znatno povečanje vsebnosti NAD plus in NADH. Vsi zgoraj omenjeni učinki so bili pri Sirt3-7miškah oslabljeni. Skupaj je dodatek CF okrepil metabolizem NAD, ki stimulira presnovo sirtuinov, in izboljšano delovanje mitohondrijev, kar je verjetno prispevalo k opaženi prilagoditvi metabolizma celotnega telesa z večjo sposobnostjo uporabe ogljikovih hidratov, vsaj delno prek Sirt3.
Ključne besede: kakavovi flavanoli; metabolizem NAD; mitohondrijska masa; metabolizem glukoze; skeletna mišica
1. Uvod
Mitohondriji so subcelični organeli, ki so vključeni v več celičnih funkcij, kot je prenos energije prek mitohondrijske oksidativne fosforilacije in v mitohondrijsko proizvodnjo vodikovega peroksida ali mitohondrijsko posredovano aktivacijo celične smrti [1-3]. Nastajajoči dokazi kažejo, da je mitohondrijska disfunkcija vpletena v številne patologije in ima osrednjo vlogo v njihovi patogenezi [4]. Naša skupina je poročala o mitohondrijski okvari pri bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 1 veliko pred kliničnimi zapleti [5]. Poleg tega pride do zmanjšanja mitohondrijske oksidativne sposobnosti s staranjem tudi pri zdravih ljudeh [6]. Zato so identifikacije strategij za ublažitev teh disfunkcij ali povečanje mitohondrijske mase priložnosti za preprečevanje ali vsaj zmanjšanje pojavnosti številnih motenj ali povečanje aerobne zmogljivosti zdravih oseb.
V tem kontekstu je zanimiva identifikacija varnih in naravnih spojin, ki izboljšujejo delovanje mitohondrijev in metabolizem celega telesa z ali brez omejenih stranskih učinkov. Med naravnimi spojinami,kakavovi flavanoli(CF) veljajo za obetavne molekule, saj se je izkazalo, da njihovo uživanje pozitivno vpliva na zdravje srca in ožilja, insulinsko rezistenco ali imunsko funkcijo [7]. Pokazalo se je, da CF izboljšuje presnovo glukoze in kratkotrajnemu dajanju CF sledi povečanje občutljivosti za inzulin, tudi pri bolnikih s hipertenzijo, ki ne prenašajo glukoze [8, 9].
Med flavanoli je (-)-epikatehin (EPI) najpogosteje najden monomer v CF, EPI pa velja za glavno biološko razpoložljivo in bioaktivno molekulo CF [10]. Dosledni dokazi kažejo, da dodatek EPI izboljša delovanje mitohondrijev in/ali vsebino v skeletnih mišicah [11]. Dodatek EPI stimulira več poti, ki konvergirajo na koaktivatorju receptorja gama 1-alfa (PGCl), ki ga aktivira peroksisomski proliferator, in glavnih jedrskih transkripcijskih kompleksih. EPI neposredno poveča nastajanje dušikovega oksida, kar stimulira mitohondrijsko biogenezo [11]. Hkrati se sirtuina 1 in 3 spodbuja tudi z dodatkom EPI [11]. Uporaba proantocianidinov, oligomernihflavonoidiki vsebujejo EPI, se je pokazalo, da zvišuje znotrajcelične ravni nikotinamid adenin dinukleotida (NAD plus ) s povečanjem več prekurzorjev za biosintezo NAD in uravnava ravni mRNA sirtuina-1 v jetrih podgan [12]. Družina sirtuinov (Sirt), od NAD odvisna deacetilaza, obsega sedem članov, ki se razlikujejo po podcelični porazdelitvi, specifičnosti substrata in celičnih funkcijah [13]. Sirt1, obsežno raziskan član te družine, stimulira mitohondrijsko biogenezo s pospeševanjem deacetilacije PGCl, s čimer poveča njegovo transkripcijsko aktivnost [14]. Sirte, ključni presnovni senzor, je bil stimuliran po dajanju EPI [12, 15-17]. Vendar pa vpliv EPI na druge sirtuine ni bil raziskan. Ocena učinka EPI bo še posebej zanimiva za sirtuine, ki se nahajajo v mitohondrijih (Sirt3, Sirt 4 in Sirt5), za katere je znano, da modulirajo aktivnost Krebsovega cikla in encimov dihalne verige [18]. Sirt3, ki je močno izražen v tkivih z visoko presnovo in vsebnostjo mitohondrijev, je še posebej zanimiv zaradi svoje kritične vloge pri ohranjanju normalne mitohondrijske funkcije z reverzibilno deacetilacijo proteina lizina [19-21]Poleg tega ima Sirt3 pomembno vlogo pri uravnavanje metabolizma celega telesa [20. Pokazalo se je, da je Sirt3 spremenjen v skeletnih mišicah modelov sladkorne bolezni tipa 1 in tipa 2 ter srčno-žilnih bolezni [22, 23]. Poleg tega je bilo predlagano, da bi lahko aktivacija Sirt3 predstavljala obetavno terapevtsko strategijo za izboljšanje mitohondrijske funkcije in metabolizma [23, 24]. Zato je zanimivo ugotoviti, ali je Sirt3 del koristnih učinkov dodajanja CF na metabolizem celotnega telesa in delovanje mitohondrijev.
V tej študiji smo uporabili integrativni pristop, da bi pri miših raziskali učinek 15--dnevnega dodajanja CF. Domnevali smo, da bi dodatek CF: (i) spremenil metabolizem celega telesa inmetabolizem glukoze, (ii) povečanje mitohondrijske funkcije v oksidativnih in glikolitičnih mišicah v permeabiliziranih vlaknih in (ii) povečanje metabolizma NAD. Raziskali smo tudi domnevno vpletenost Sirt3 v mitohondrijsko biogenezo, ki jo povzroča CF, in presnovo celotnega telesa. Naše hipoteze so bile, da bi bili učinki CF na metabolizem celotnega telesa in mitohondrijsko maso pri miših Sirt3-7 oslabljeni.
2. Metode
2.1. Živali in prehrana
Za to študijo so bili 129S1/SvlmJ 10-tednov stari mišji samci kupljeni pri Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, ZDA). Da bi ugotovili, ali so sirtuini vključeni v prilagoditev mitohondrijske mase in funkcije, ki jo povzroča dajanje CF, smo uporabili tudi 10-teden stare Sirt3 celega telesa izločenih samcev miši na istem sevu kot divji tip [25]. Sirt3/miši so bile uporabljene za raziskovanje vpletenosti Sirt3 v mitohondrijsko biogenezo, ki jo povzroča CF, in prilagoditve metabolizma celotnega telesa. Miši so bile v prostoru pri regulirani temperaturi 23-25 stopinj in nadzorovani osvetlitvi (12-h ciklov svetlobe in teme). Živali so imele dostop do hrane za glodavce in vode iz pipe ad libitum.
Po vsaj enem tednu navajanja v živalskem objektu so poskusne živali prejele dodatek CF z oralno sondo naravnega izvlečka (302,1 mg/kg telesne teže dvakrat na dan 15 dni), resuspendiranega v karboksimetilcelulozi (Sigma-Aldrich, St. Louis). , Mo, ZDA). Sestava kakavovega prahu je opisana v tabeli 1 in je bila pridobljena od Naturex (Quart de Poblet, Španija). Sestava je bila določena z metodo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in 100 mg ekstrakta ustreza povprečno 475 mg suhih kakavovih semen. Kontrolne miši so prejele nosilec, sestavljen iz podobne vsebnosti teobromina in kofeina, raztopljenega v karboksimetilcelulozi z oralno gavažo. Dnevni odmerek je bil določen v skladu z industrijskimi smernicami, ki pretvarjajo odmerek za ljudi v ekvivalentne odmerke za živali na podlagi telesne površine, odmerek za človeka pa smo pomnožili z 12,3 [26]. Oralno gavažo je opravil izkušen tehnik.
2.2. Zbiranje tkiv 1
Štiriindvajset ur po zadnjem oralnem dajanju so bile živali, ki niso bile na tešče, anestezirane s ketaminom in ksilazinom (oziroma: 100 oziroma 10 mg/kg). Odvzem tkiv je bil opravljen takoj po doseženi anesteziji. Soleus in beli del gastrocnemiusa sta bila izrezana. Vzorci so bili bodisi takoj zamrznjeni v tekočem dušiku in shranjeni pri -80 stopinjah za poznejšo analizo ali uporabljeni za pripravo olupljenih mišičnih vlaken.
2.3. Ocene presnove in telesne dejavnosti
Posredna kalorimetrija in spontana telesna aktivnost sta bili izmerjeni z uporabo celovitega sistema za spremljanje laboratorijskih živali (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, ZDA). Miši so bile nameščene posamično v komorah pri 28 stopinjah, s svetlobo od 07h00 do 19h00 in ad libitum dostopom do hrane za glodavce in vode iz pipe. Miši so bile aklimatizirane na presnovne kletke tri dni pred prvim dnem zbiranja podatkov. Zbiranje podatkov je bilo izvedeno petnajsti dan dodajanja. Poraba kisika (VO2), proizvodnja ogljikovega dioksida (VCO2) in razmerje izmenjave dihal (RER) so bili izmerjeni s pretokom zraka 0.5 L/min in vzorčnim zrakom 0.4 L/ min. Odstotek relativne kumulativne frekvence (PCRF) RER je bil določen v obdobju 24-h, kot so predhodno opisali Riachi et al. (2004). Na kratko, PCRF je bil določen z dodatkom frekvence vsake podatkovne točke prejšnjemu zaporedju prirastkov (od 0,65 do 1,20 s prirastkom 0,01) [27]. Presnovna fleksibilnost je bila določena s Hillovim nagibom (vrednost H) in 50. percentilom (EC50) krivulje PRCF ter z merjenjem amplitude RER v 24 urah (Riachi et al. 2004). Splošno telesno aktivnost so spremljali s senzorskim sistemom z infrardečim žarkom, ki je zaznaval aktivnost osi x in z. Ocenjeno je bilo skupno število (vsakič, ko je zlomljen žarek) in ambulantno štetje (vsakič, ko je zlomljen nov žarek). Skupno število X (X-TOT) se registrira, ko se žival premakne vodoravno za več kot 0,5 in in je reprezentativen za majhne, ponavljajoče se dejavnosti, kot sta praskanje in nego. X-ambulantno štetje (X-AMB) meri dejansko gibanje tako, da zabeleži štetje šele, ko žival zlomi nov žarek. Z-totalno število (Z-TOT) se zabeleži, ko pride do 1,5 in navpičnega gibanja, tj. vzreje (Abreu-Vieira 2016). Za oceno ogljikovih hidratov in maščoboksidacijaiz VO2 in VCO2 smo uporabili tabelo neproteinskega respiratornega kvocienta Péronneta in Massicotta, ki je bila prej uporabljena pri miših [28,29].
2.4. Skupna telesna in maščobna masa
Skupno maščobno maso in skupno pusto maso smo določili pri neanesteziranih miših s kvantitativno resonančno interferenčno analizo z uporabo magnetnoresonančnega analizatorja celega telesa EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, ZDA). Skupna maščobna masa je predstavljala vsoto vseh maščob v telesu. Celotna pusta masa je vključevala predvsem mišice in notranje organe. Znano je, da skeletna mišična masa predstavlja največji delež skupne puste mase.
2.5. Peroralni test tolerance za glukozo (OGTT)
Glikemijo smo izmerili z uporabo kapljice krvi, zbrane iz repa z glukometrom (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT je bil izveden na miših, ki so bile tešče 5 do 6 ur. Merjenje je bilo opravljeno zadnji dan dodajanja CF. Po merjenju bazalne glikemije (čas O) so miši nato injicirali per os raztopino 20 odstotkov glukoze v sterilni vodi v odmerku 1,5 g glukoze na kg telesne teže-1. Glikemijo so izmerili 15, 30, 60, 90 in 120 minut po injiciranju raztopine glukoze. Inkrementalno površino krivulje glukoze smo nato izračunali kot merilo tolerance za glukozo.
2.6 Analiza qRT-PCR
The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA je bila sintetizirana iz celotne RNA （2 μL） z uporabo supermešanice reverzne transkripcije iScript za RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, ZDA). Skupne produkte RT smo analizirali s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG v skladu s specifikacijami proizvajalca (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Kolesarjenje je bilo doseženo v ciklerju CFX96 (Biorad, Hercules, Kalifornija; pogoji: 95 stopinj C za 10 minut in 40 ciklov 95 stopinj za 30 s, 55 stopinj za 45 s in 72 stopinj za 45 s). Na koncu vsake serije je bila s talilno krivuljo potrjena odsotnost tvorbe primer-dimera in prisotnost edinstvenega pomnožka. Vrednosti mejnega cikla (Ct) so bile uporabljene po metodi 2-A△Ct za analizo podatkov qPCR z bodisi ß-aktinom ali HPRT1 kot gospodinjskim genom【30】. Kvantitativne vrednosti RT-PCR so bile povezane z vrednostmi kontrolne skupine, ki so bile nastavljene na 1.
2.7. Encimske aktivnosti
Merjenje specifične aktivnosti kompleksov transportne verige elektronov in citrat sintaze je bilo izvedeno spektrofotometrično, kot je opisano prej [31]. Zdrobljene zamrznjene bele želodčne mišice (~30 mg) smo homogenizirali z vibrirajočim homogenizatorjem mikrokroglic v 500 uL homogenizacijskega pufra (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA in 5 mg·mL-I BSA , pH 7,4), čemur je sledil dodatek 500 μL hipotoničnega medija （25 mM kalijevega fosfata in 5 mM MgCl, pH 7,2). Vzorci so bili nato izpostavljeni trem krogom ciklov zamrzovanja in odmrzovanja v tekočem dušiku. Vzorce centrifugiramo 10 minut pri 600 × g pri 4 stopinjah, supernatant pa hranimo na ledu do analize. Vsebnost beljakovin je bila določena v supernatantu v trojniku z uporabo Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, ZDA).
Aktivnost citrat sintaze (CS) smo določili spektrofotometrično pri 412 nm po redukciji 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzojske kisline) v prisotnosti 0.1 mM acetil -CoA in 12 mM oksaloocetne kisline v 200 mM pufru Tris (pH 7,4). Test NADH-decilubikinon oksidoreduktaze (kompleks I), občutljiv na rotenon, je bil izveden pri 340 nm z uporabo akceptorja 2,3-dimetoksi-5-metil-6-n-decil-14-benzokinona （ 80 μM） in NADH kot donor elektronov （200 μM） v 10 mM Tris pufru（pH 8,0）. Dodatek 4 μM rotenona je bil uporabljen za kvantificiranje aktivnosti, občutljive na rotenon. Aktivnost citokrom oksidaze （kompleksa IV） je bila izvedena pri 550 nm z uporabo 10 μM reduciranega citokroma c kot darovalca in 2,5 mM n-dodecil-ß-maltozida za permeabilizacijo obeh mitohondrijskih membran v 100 mM kalijevega fosfatnega pufra (pH 7,0).
Vse encimske analize so bile določene v treh izvodih, rezultati pa so bili povezani s tistimi iz kontrolne skupine, ki so bili nastavljeni na 100.
2.8. Mitohondrijska ocena
Mitohondrijsko dihanje in mitohondrijsko proizvodnjo H2O2 so proučevali in situ v vlaknih, prepustnih za saponin, z uporabo belih gastrocnemius in soleus mišic|1]. Na kratko, vlakna so bila ločena pod binokularnim mikroskopom v raztopini A pri 4 stopinjah (v mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 tavrini,0.5 DTT,5{ {50}} K-metan sulfonatov, 20 imidazolov, 5,7 Na2 ATP in 15 kreatin-fosfata, pH 7,1) in permeabilizirani v raztopini A s 50 ug·mL-I saponina 30 minut pri 4 stopinjah. Mitohondrijsko dihalno funkcijo smo določili v oksimetru, opremljenem z elektrodo tipa Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Komora je bila napolnjena z 1 mL raztopine B (v mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 tavrina, 0,5 DTT, 50 K-metan sulfonatov in 20 imidazolov, pH 7,1) in po snemanju izhodiščne vsebnosti kisika v komori, je bil en snop 1-2 mg suhe teže permeabiliziranih mioflaken vstavljen v komoro, ki je bila nato zaprta. Po osnovnih odčitkih so bili zaporedno dodani naslednji dodatki: palmitoil karnitin in malat (160 μM∶5 mM), glutamat (10 mM), sukcinat (25 mM), rotenon (0,5 μm), ločilnik CCCP (1 μM), antimicin -A （8 uM） in N, N', N'-tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorid in askorbat (0,9:9 mM). Dihanje je bilo izmerjeno pri 23 stopinjah ob neprekinjenem mešanju. Na koncu vsakega testa so bila vlakna previdno odstranjena iz ksilografske celice, popivnana in sušena vsaj 24 ur pri ~ 80 °C za določitev teže vlaken. Stopnje porabe O2 (JO2) so bile izražene v nmol O2 min-1.(mg suhe teže)-I. Vse meritve so bile izvedene vsaj v dvojniku.
Neto sproščanje H2O2 z dihanjem mitohondrijev je bilo izmerjeno v permeabiliziranih snopih vlaken s fluorescenčno sondo Amplex Red（20 μM∶emisija vzbujanja∶563-587 nm）, kot je opisano prej [32]. Po pripravi permeabiliziranih vlaken vzorci
namenjeni meritvam H2O2, smo trikrat splaknili v pufru Z(v mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O in 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7,3 pri 4 stopinjah). Snope vlaken ({{20}}.3-1.0 mg suhe teže) smo inkubirali pri 37 stopinjah v kremenčevi mikrokiveti z neprekinjenim magnetnim mešanjem v 600 uL pufra Z (pH 7,3 pri 37 °C) dopolnjen z 1,2 U·mL-I hrenove peroksidaze. Osnovni odčitki fluorescence so bili narejeni v odsotnosti eksogenih dihalnih substratov. Nato so bili zaporedno dodani naslednji dodatki: glutamat (5 mM), sukcinat (5 mM), rotenon (0,5 uM), ADP (10 mM) in antimicin-A （8 µM）. Na koncu vsakega testa so bila vlakna previdno vzamemo iz kivete, popivnamo in posušimo, da določimo maso vlaken. Stopnje proizvodnje H2O2 so bile izražene v AU·min-1.(mg suhe teže)-I in na kapaciteto oksfosa, ki je ustrezala maksimalnemu mitohondrijskemu dihanju v stanju fosforilacije. Vse meritve so bile izvedene vsaj v dvojniku.
Mitohondrijska sposobnost zadrževanja kalcija (CRC) je bila ocenjena v belih vlaknih gastrocnemius mišice, kot je opisano prej [33]. Na kratko, vlakna smo inkubirali v kvarčni mikrokiveti ob neprekinjenem mešanju v 600 μL CRC pufra （v mM∶250 saharoze, 10 MOPS, 0,005 EGTA in 10P;-Tris, pH7,3). Vlakna so bila nato izpostavljena enemu impulzu 20 nM Ca2 plus. Spremembe ekstramitohondrijske koncentracije kalcija so spremljali fluorometrično z uporabo kalcijevega zelenega 5N (1 mM: vzbujanje-emisija: 505-535 nm). Občutljivost prehoda prepustnosti por (PTP) je bila ocenjena z merjenjem časa, potrebnega za odprtje PTP, CRC pa je bil vzet kot skupna količina Ca', ki so jo nabrali mitohondriji pred njegovo sprostitvijo. Na koncu vsakega testa so bila vlakna previdno odstranjena iz kivete, popivnana in posušena, da se določi teža vlaken. Vrednosti CRC so bile izražene v nM Ca2 plus na mg suhe teže.
2.9. Western blot analiza
Beljakovine iz mišic gastrocnemius in soleus so bile razredčene v pufru Laemmli in ločene na Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 % montažnih poliakrilamidnih gelih (Biorad); na vsak gel je bil naložen notranji standard. Elektroforetično ločitev smo izvedli pri 200 V 35 minut v migracijskem pufru (25 mM TrisBase, 0.2 M glicin in 1 odstotek SDS (p/v)). Tehnologija brez madežev (SF) vsebuje lastniško trihalo spojino, ki reagira z beljakovinami, zaradi česar jih je mogoče zaznati z izpostavljenostjo UV. Slikanje SF je bilo izvedeno s programsko opremo ChemiDoc MP Imager in Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, Kalifornija, ZDA) z 5-minutnim časom aktivacije madežev, zato so bili vizualizirani skupni vzorci beljakovin. Proteine smo nato prenesli na 0,2 um nitrocelulozno ploščo z uporabo Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Kakovost prenosa je bila nadzorovana s slikovnimi membranami s tehnologijo SF. Po stopnji prenosa smo karbonilne proteine derivatizirali z dinitrofenilhidrazinom, razredčenim v 2N HCL, in na koncu temeljito sprali z metanolom. Membrane so bile blokirane s 5-odstotnim nemastnim suhim mlekom v tris-pufrani fiziološki raztopini, ki je vsebovala Tween-20 (TBST: 15 mM Tris/HCl, pH7,6, 140 mM NaCl in 0,05 odstotka Tween-20) za 1 h pri sobni temperaturi. Membrane smo nato inkubirali pri 4 stopinjah čez noč ali 2 uri pri sobni temperaturi z naslednjimi primarnimi protitelesi: proteinsko karbonilno primarno protitelo (Anti-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) in SOD2 (#Ab13533, Abcam). Po treh 10-minutnih izpiranjih v TBST so bile membrane testirane s sekundarnimi protitelesi za protein karbonil (HRP-konjugat; #STA-308, Cell Biolabs) in SOD2 (anti-kunčji IgG-HRP povezan; #7074, Cell Signalling) v raztopini za blokiranje 2 uri pri sobni temperaturi in na koncu temeljito sprali s TBST. Razredčitev primarnih in sekundarnih protiteles je bila optimizirana za vsako protitelo. Kemiluminescenčna detekcija je bila izvedena z ECL Clarity (Biorad), zajem slik pa s ChemiDocMP. Vse slike so bile analizirane s programsko opremo Image Lab 4.0.1. Normalizacija intenzivnosti proteinskega signala je bila izvedena po kvantifikaciji ustrezne skupne ravni beljakovin na slikah SF, kontroli vzorcev in notranjih standardih.
2.10. Merjenje NAD
Celotne ravni NAD in NADH so bile izmerjene v homogeniziranem belem gastrocnemiusu z uporabo komercialnega kompleta (#K337-100, Biovision, ZDA) in po navodilih proizvajalca. Na kratko, ekstrahiran je bil celoten bazen NAD (NADt= NADt in NADH). Za vsakega od ekstrahiranih vzorcev smo polovico vzorca segrevali na 60 stopinj 30 minut, da smo razgradili NADt, medtem ko je NADH ostal nedotaknjen. Oba vzorca NADt in NADH sta bila zmešana z NAD krožečim encimom in absorbanca je bila izmerjena pri 450 nm. NADt in NADH sta bila kvantificirana s primerjavo s standardno krivuljo NADH in normalizacijo na mg beljakovin. Na koncu je bilo izračunano razmerje NAD plus (NADt-NADH) proti NADH. Vsi testi so bili izvedeni v treh izvodih.
2.11. Statistika
Podatki so navedeni kot povprečje ± standardni odklon (SD). Normalnost podatkov je bila ocenjena z D'Agostino-Pearsonovim testom normalnosti. Analiza podatkov je bila izvedena z uporabo Studentovega t-testa in dvosmerne ANOVA (skupina in čas) za ponovljene meritve, ki jim je sledil Bonferronijev post hoc test z uporabo Prism8.4.1 (programska oprema GraphPad, San Diego, CA, ZDA). Uporabljena je bila dvostranska raven 5 odstotkov za napako tipa I.
3. Rezultati
3.1. Sestava telesa in metabolizem celotnega telesa
Petnajstdnevni dodatek CF pri miših divjega tipa (WT) ni spremenil telesne teže (p=0.091), puste mase (p=0.{{24} }73) in maso maščobe, ocenjeno z EchoMRI (p=0.89; Slika 1A). Stopnje porabe O2, izražene na pusto maso, so bile znatno višje v temnem ciklu (8±8 odstotkov, p=0.042), medtem ko so ostale podobne v svetlem ciklu (p =0 .392; Slika 1B.). V lokomotorni aktivnosti ni bilo sprememb (podatki niso prikazani). Miši CF so pokazale znatno povečanje porabe energije celega telesa za 15±15 odstotkov (p =0.042; slika 1C) in pri vnos hrane (0,08±0,01 v primerjavi z 0,11±0,01 g na pusto telesno težo, oziroma skupina CF in WT, p=0.013, slika 1D).
Dodatek CF je pomembno spremenil metabolizem celega telesa: glavni učinek višjega RER v skupini s CF je bil opažen v 24 urah (p=0.023, slika 2A), srednji RER v 12 urah pa je bil višji v skupini CF v svetlih in temnih ciklih (plus 5±3 odstotke, p=0.035 oziroma plus 9±4 odstotke, p=0.026). Poleg tega je dodatek CF spodbujal uporabo ogljikovih hidratov (CHO) (51 ± 13 odstotkov porabe energije je bilo odvisno od oksidacije CHO v skupini CF v primerjavi s 37 ± 12 odstotki v kontrolni skupini med ciklom svetlobe, p=0).108 in 71 ± 21 odstotkov v skupini CF v primerjavi s 47 ± 24 odstotki v kontrolni skupini med temnim ciklom, p =0.004; Slika 2B.). Ko pa je izraženo v kJ, ni bilo nobene razlike v oksidaciji CHO ali oksidaciji maščobnih kislin (oksidacija CHO: 3,7±1,4 kcal·d-1 v kontroli v primerjavi s 4,4±1,7 kcal. puste telesne mase-1). d-1 v CF,p=0.33 in oksidacija maščobnih kislin: 2,3±1,0 kcal·d-Iin nadzor v primerjavi z 2,6±0,87 kcal.puste telesne mase-1.d{{ 50}}v CF, p=0.608). Analiza PRCF RER je pokazala povečanje vrednosti EC50 v skupini CF (p=0,009; slika 2D), kar pomeni, da CF povzroča premik v smeri večje uporabe ogljikovih hidratov. Zmanjšanje naklona Hilla so opazili v skupini s CF (vrednosti H: 25,16 ± 4,44 v kontrolni skupini v primerjavi z 12,79 ± 3,96 v skupini s CF, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">
3.2. Mitohondrijska bioenergetika
Preizkusili smo učinek dodatka CF na energijo mitohondrijev v beli mišici gastrocnemius in soleus pri miših WT. Opazili so višjo mitohondrijsko dihanje z uporabo kompleksnih substratov IV v beli mišici gastrocnemius in soleus (p=0.004 oziroma p=0.028; sliki 3A, B). Spremembe razmerij dihanja CII/CI in CIV/CI niso opazili (p =0.899 in p =0.701 za beli gastrocnemius in p=0.693 in p{{ 11}}.912 za mišice soleus, podatki niso prikazani). Poleg tega so bile aktivnosti kompleksne I, IV in citrat sintaze znatno povečane v beli gastrocnemius mišici (oziroma: plus 31 ± 27 odstotkov, p=0.004; plus 28 ± 38 odstotkov, p=0 0,027; plus 35±38 odstotkov, p= 0,009; plus 14±13 odstotkov, p=0,040; slika 3C). Sposobnost mitohondrijev, da oksidirajo palmitoil-karnitin, se poveča v beli gastrocnemius (plus 24±12 odstotkov, p =0.096; slika 3D), medtem ko v podplatu niso opazili nobene razlike (p =0.363). Relativne stopnje dihanja, stimuliranega s palmitoil-karnitinom, so bile nespremenjene, če so bile izražene v funkciji dihanja kompleksa I (62 ± 11 v kontrolni skupini v primerjavi s 64 ± 20 v skupini CF v belem gastrocnemiusu in 70 ± 18 v primerjavi s 72 ± 16 v podplatu). Nato smo raziskali občutljivost na odpiranje PTP, ki ga povzroča Ca plus, v belem gastrocnemiusu. Kot je prikazano na sliki 3E, po dodatku CF nista bila spremenjena niti čas do odpiranja PTP niti zmogljivost Ca²retencije (p=0.608 oziroma p=0.943).
Ocena mRNA genov, vključenih v mitohondrijsko biogenezo, je pokazala 70-odstotno regulacijo mRNA NRF1, medtem ko za PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa in Cox2 niso poročali o nobeni razliki (tabela 3). Na nekaj vzorcih smo raziskali učinek dodatka CF na mitohondrijske superkomplekse (slika S1, dodatni materiali). Denzitometrična analiza kaže, da je dodatek CF povečal celotno vsebnost superkompleksov brez kvalitativne prilagoditve ali preureditve. Resnično se je dihalna gostota izboljšala za 58 odstotkov z uporabo sonde kompleks I in kompleks Ⅱ in za 93 odstotkov z uporabo sonde kompleks I. Podobno je bila vsebnost kompleksa I in kompleksa III, vgrajena v superkomplekse, višja v skupini CF.
Dodatek CF zmanjša emisijo mitohondrijskih ROS. Medtem ko je emisija H2O2 ostala nespremenjena v belem gastrocnemiusu in soleusu, izražena na suho težo (slika 4A oziroma B), sta se stopnji zmanjšali, če sta izraženi na vsebnost mitohondrijev (slika 4C). Glavni pozitivni učinek dodatka CF so opazili pri različnih stanjih v belem gastrocnemiusu (str<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">
3.3. Označevalci oksidativnega stresa v skeletnih mišicah
Dodatek CF ni vplival na raven oksidativnega stresa celičnih beljakovin pri miših WT, saj je bila celična vsebnost SOD2 podobna v poskusni in kontrolni skupini pri belem gastrocnemiusu in soleusu (slika 4E). Poleg tega niso opazili nobene razlike v karbonilaciji beljakovin v belem gastrocnemiusu in soleusu (slika 4F). Poleg tega po dodatku CF niso opazili nobene razlike v izražanju mRNA katalaze in MnSod (tabela 3).
3.4. Presnova NAD
Skupna količina piridinskih nukleotidov se je po dodatku CF povečala za 36±33 odstotkov (p=0.012). Natančneje, vsebnosti NAD in NADH sta se povečali v belem gastrocnemiusu (oziroma za 69±60 odstotkov, p{{6). }}.026 in 29± 42 odstotkov, p=0.017; slika 5A, B) in razmerje NAD plus /NADH je bilo v skupini s CF nagnjeno k povečanju (p =0.084). pomemben učinek so opazili pri mRNA Sirt3 (p=0.096), mRNA NMNAT (p=0.094) in mRNA Sirt1 (p =0.869; tabela 3 ).
3.5. Odziv celega telesa in celičnega metabolizma po dodajanju CF pri Sirt3-/miškah
Preučili smo učinek dodajanja CF pri miših Sirt{{0}}. Telesna sestava kot teža, pusta masa in maščobna masa se med CF in kontrolnimi skupinami niso razlikovale (p= 0.52, p=0.66, p=0.45; Slika 6A). Podobno dodajanje CF ni vplivalo na dnevno porabo energije ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal. vitko telo masa-1.dan-1 pri kontrolah v primerjavi s 0.39 ± 0.01 Kcal·pusta telesna masa-1.dan-1 v CF, p=0.502; slika 6B). RER je bil podoben med obema skupinama v svetlobnih in temnih ciklih (p=0.301; slika 6C), dodatek CF pa ni vplival na oksidacijo substrata (44 ± 17 odstotkov porabe energije je bilo odvisno od oksidacije CHO v kontrolna skupina v primerjavi s 50 ± 11 odstotki v skupini s CF med svetlo fazo, p=0.209 in 65 ± 19 odstotkov v kontrolni skupini v primerjavi s 77 ± 21 odstotki v skupini s CF med temno fazo, p=0.395; slika 6D). Presnovna fleksibilnost, ocenjena z amplitudo RER v 24 urah, je ostala podobna med obema skupinama (0,19 ± 0,05 v kontroli v primerjavi z 0,20 ± 0,03 v CF, p=0.604), medtem ko se je naklon PRCF zmanjšal v skupini s CF (H vrednosti: 17,77±4,38 v kontroli v primerjavi z 12,79±3,93 v CF, p=0.039).
Nato smo primerjali učinek dodatka CF na aktivnosti mitohondrijskih encimov. Dodatek CF ni uspel povečati encimske aktivnosti kompleksa I, I, IV in CS pri Sirt3-/miši, kot so opazili prej pri WT (oziroma: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 in p=0.791, slika 6E). Večjo encimsko aktivnost kompleksa in IV so opazili pri miših WT v primerjavi z mišmi Sirt3-7po dodatku CF ( oziroma: p=0.027 in P=0.045)
4. Razprava
V tej študiji nudimo integrativno analizo učinka zaužitja CF. Opazili smo, da je kronično zaužitje CF izboljšalo mitohondrijsko dihanje in zmanjšalo proizvodnjo H2O2, ocenjeno v njihovem okolju miofibra, medtem ko je bila dovzetnost za odpiranje PTP nespremenjena. Zaužitje CF je izboljšalo metabolizem NAD, kar podpira vpletenost sirtuinskih poti v opažene mitohondrijske prilagoditve. Opazili smo tudi spremembe metabolizma celega telesa v smeri večje zmožnosti uporabe ogljikovih hidratov kot glavnega substrata, kar nakazuje, da so mitohondrijske prilagoditve verjetno prispevale k opazovani prilagoditvi metabolizma celega telesa.
4.1.Presnova
Prehransko dajanje kakavovih flavanolov je bilo opredeljeno kot učinkovita strategija za lajšanje intolerance za glukozo, kar omogoča izboljšanje presnovnih bolezni [34]. Naši rezultati so v skladu s prejšnjimi študijami, ki so poročale o povečani toleranci za glukozo po vnosu flavanolov [35,36]. Predlagani mehanizmi za ta učinek vključujejo povečanje translokacije GLUT4 proti celični membrani, povečanje fosforilacije AMPK in povečano regulacijo genske ekspresije UCP-2 v skeletnih mišicah [8,37] . Poleg tega je bilo zaužitje CF povezano z izboljšanjem občutljivosti na insulin pri ljudeh [8]. Po 15 dneh uživanja temne čokolade so pri zdravih osebah opazili zmanjšanje ocene homeostaznega modela indeksa inzulinske rezistence hkrati s povečanjem kvantitativnega indeksa za preverjanje občutljivosti na inzulin in indeksa občutljivosti na inzulin [8]. Opazili smo tudi sočasno povečanje tolerance za glukozo in presnovne prožnosti pri miših WT, kar se nanaša na sposobnost organizma, da prilagodi oksidacijo goriva razpoložljivosti goriva [38]. Zanimivo je, da medtem ko je bila oslabljena mitohondrijska oksidativna sposobnost in s tem povezana oksidacija substrata povezana z inzulinsko rezistenco 39, je trening vzdržljivostne vadbe povečal vsebnost mitohondrijev, občutljivost za inzulin in presnovno prožnost [38]. Zato so trenutni rezultati specifični za dodatke CF in nanje ne vpliva spontana aktivnost.
Pozitiven učinek CF na presnovno prožnost in povečanje aktivnosti mitohondrijskih kompleksov sta bila pri miših Sirt3-7 oslabljena, kar kaže, da se pozitivni učinki CF pojavljajo vsaj delno prek Sirt3. Ti rezultati podpirajo prejšnje ugotovitve in ključno vlogo Sirt3 pri regulaciji presnovne prožnosti [24]. Naši rezultati kažejo, da lahko povečanje mitohondrijske funkcije poveča presnovno prožnost. Vendar pa so bili poleg mitohondrijske funkcije tudi bazalni respiratorni kvocient, stopnja odstranjevanja glukoze, zmogljivost shranjevanja lipidov v maščobnem tkivu in koncentracija prostih maščobnih kislin v plazmi opredeljeni kot odločilni dejavniki presnovne prožnosti in jih je treba upoštevati [40]. Prihodnje študije bi morale globlje oceniti celične determinante presnovne prožnosti, da bi poglobili naše razumevanje temeljnih vzrokov za povečanje presnovne prožnosti po dodatku CF.
Ocena presnove celotnega telesa je pokazala povečanje relativne oksidacije CHO po dodatku CF. Ta rezultat je v nasprotju s prejšnjo študijo, ki je poročala o povečanju lipolize po akutnem zaužitju flavanolov ali dvotedenskem dodatku flavan{2}}olov pri miših [36]. Poleg razlik v sestavi ekstrakta so lahko te protislovne ugotovitve posledica pleiotropnih učinkov NO. Dobro je sprejeto, da zaužitje CF spodbuja proizvodnjo ali biološko uporabnost metabolizma NO [7]. Po eni strani NO stimulira transport in privzem glukoze v skeletnih mišicah. Stimulacija proizvodnje NO v miotubusih, pridobljenih iz celične linije, z insulinom ali vodikovim peroksidom je povzročila povečanje translokacije GLUT4, ki je bila zmanjšana z inhibicijo nNOS [41]. Poleg tega lahko NO poveča transport glukoze po od inzulina neodvisni poti, kar vodi do povečanja ravni cikličnega GMP in AMPK [42], ki spodbuja oksidacijo glukoze v skeletnih mišicah podgan neodvisno od razpoložljivosti in oksidacije maščobnih kislin [43]. Po drugi strani NO spodbuja oksidacijo maščobnih kislin z zmanjšanjem ravni malonil-CoA z inhibicijo acetil-CoA karboksilaze in aktivacijo malonil-CoA dekarboksilaze v skeletnih mišicah [44]. Medtem ko smo opazili premik proti nižjemu relativnemu deležu za uporabo maščobne kisline kot substrata s CF, ni bilo razlike glede absolutnih vrednosti, izraženih v kJ. To nakazuje, da je povečanje porabe energije, opaženo pri dodatku CF, odvisno od povečanja oksidacije glukoze. Zato ti rezultati podpirajo idejo, da uživanje CF poveča občutljivost za inzulin in spodbuja oksidacijo glukoze brez sočasnega učinka na sposobnost oksidacije maščobnih kislin. Ti rezultati sprožajo vprašanje o pomembnosti uporabe kakavovih flavanolov v kontekstu diete z visoko vsebnostjo maščob. Prihodnje študije bi morale oceniti možne škodljive učinke povezave med dodatkom CF in dieto z visoko vsebnostjo maščob.
4.2. Delovanje mitohondrijev
Dokazano je, da uživanje kakavovih flavanolov v prehrani izboljša delovanje mitohondrijev, vključno z (i) mitohondrijsko respiracijo in encimskimi aktivnostmi transportne verige elektronov; (i) mitohondrijsko sproščanje H2O2, ki odraža proizvodnjo mitohondrijskih reaktivnih kisikovih vrst (ROS); in (i) sposobnost zadrževanja kalcija v mitohondrijih, ki odraža dovzetnost za odpiranje prehodnih por mitohondrijske prepustnosti (mPTP) (za pregled glej [11]. Naši rezultati so v skladu s prejšnjimi študijami; kljub temu je bila naša študija prva, ki je ocenila učinek Dodatek CF na mitohondrijsko funkcijo, ocenjen in situ v permeabiliziranih vlaknih in v različnih tipih mišic. Za razliko od prejšnjih študij na izoliranih mitohondrijih, ocena mitohondrijske funkcije v permeabiliziranih vlaknih ohranja mitohondrijsko morfologijo, funkcionalne interakcije z drugimi znotrajceličnimi komponentami [1] in se izogiba mitohondrijski strukturi motnje med postopkom izolacije mitohondrijev [32].Zato je pomembno preučiti delovanje mitohondrijev v tkivnih pripravkih, kjer je mitohondrijska struktura ohranjena in je zastopan ves mitohondrijski bazen, da bi bolje ocenili odziv na zdravljenje.
Prejšnje študije, izvedene v celični kulturi ali in vivo pri miših, so pokazale, da dodatek EPI, ki velja za glavno bioaktivno molekulo pri CF, poveča maksimalno dihanje, stimulirano z ADP (npr. dihanje v stanju 3), ko se mitohondriji napajajo s kombinacijo energije substrati, ki hranijo različna mesta vzdolž dihalne verige [45-49]. V skladu s temi rezultati smo opazili glavni učinek dodatka CF na mitohondrijsko dihanje v oksidativnih in glikolitičnih mišicah. Da bi ugotovili, ali je to povečanje povezano s povečanjem mitohondrijske mase ali preoblikovanjem mitohondrijskih dihalnih kompleksov, smo ocenili mitohondrijske superkomplekse iz mišice kvadricepsa. Te supramolekularne strukture naj bi zmanjšale proizvodnjo ROS, stabilizirale ali pomagale pri sestavljanju posameznih kompleksov, uravnavale aktivnost dihalne verige in preprečile agregacijo beljakovin v z beljakovinami bogati notranji mitohondrijski membrani [50-52]. Kljub omejenemu številu ukrepov vizualna analiza rezultatov (dodatni materiali) kaže, da dodatek CF povzroči povečanje mitohondrijske mase, kar se odraža v povečanju vseh superkompleksnih vrst, namesto specifičnih kompleksnih reorganizacij dihalnih verig. Skupaj ti rezultati kažejo, da CF spodbuja povečanje mitohondrijske mase brez kvalitativne prilagoditve kompleksnih ureditev dihalne verige.
Med mitohondrijskim dihanjem nastajajo spremenljive količine superoksida, ki se lahko presnavljajo v druge vrste ROS [53]. Čeprav je prekomerna proizvodnja ROS iz mitohondrijev vključena v širok spekter patologij, imajo lahko nizke fiziološke koncentracije ROS koristne učinke, kot je zaščita pred povzročitelji okužb in sodelovanje pri celični signalizaciji [2, 54]. Prejšnje študije, izvedene in vivo na glodavcih in ljudeh ter na modelih celične kulture, so poročale o koristnih učinkih dodatka CF na proizvodnjo ROS in različne antioksidativne sisteme [11]. Na primer, 15-dnevna peroralna gavaža z EPI poveča aktivnost SOD2 in katalaze v mišicah kvadricepsa [17]. Medtem ko proizvodnja mitohondrijskih ROS ni bila široko ocenjena, smo opazili, da so bile ravni proizvodnje ROS podobne, ko so bile vrednosti izražene na težo mišice, medtem ko je bila proizvodnja znižana, če je bila izražena na maso mitohondrijev, kar kaže na to, da pride do kvalitativnih prilagoditev za vzdrževanje fizioloških koncentracij ROS. Poleg tega nismo opazili nobenega učinka CF na SOD2 ali ROS-inducirane škode, ocenjene s karbonilacijo beljakovin. Medtem ko CF poveča skupke antioksidantnih beljakovin, vključno z ravnmi SOD2 in katalaze, o katerih so poročali [16,17,55], ta prilagoditev ni bila vedno povezana z zmanjšanjem poškodb, ki jih povzroča ROS [56-59]. Ti podatki podpirajo teorijo, da so za normalno celično homeostazo potrebne nizke ravni proizvodnje ROS [2]. Skupaj ti rezultati kažejo, da sočasno s povečanjem mitohondrijske mase CF spodbuja kvalitativne prilagoditve mitohondrijev za povečanje njegove antioksidativne sposobnosti in vzdrževanje nizkih ravni proizvodnje ROS.
4.3.Mitohondrijska biogeneza
Mitohondrijska masa je rezultat medsebojnega delovanja mitohondrijske biogeneze in mitofagije. Naša študija se je osredotočila na mitohondrijsko biogenezo, ki jo aktivira uživanje polifenolov [60]. Mitohondrijska biogeneza je celični proces, ki izboljšuje mitohondrijsko maso. Ta zapleten in visoko reguliran proces vključuje več transkripcijskih faktorjev, jedrskih hormonskih receptorjev in transkripcijskih koaktivatorjev, ki delujejo skupaj za usklajevanje sprememb v izražanju genov, kodiranih z jedrsko in mitohondrijsko DNA [61]. Prejšnje študije so poskušale ugotoviti, katere poti so lahko osnova mitohondrijske biogeneze, povzročene z dodajanjem CF. Stimulacija signalizacije, odvisne od NO, se je izkazala kot osrednja pot, vključena v mitohondrijsko biogenezo. Dodatek CF poveča nastajanje NO z zaviranjem encima arginaze, ki razgrajuje arginin, kar poveča razpoložljivost L-arginina za biosintezo NO [62,63]. Poleg tega je bil z uporabo zaviralca eNOS delno oslabljen stimulativni učinek epikatehina na mitohondrijsko biogenezo [17]. Ti rezultati kažejo na vpletenost drugih signalnih poti za stimulacijo mitohondrijske biogeneze.
Pred kratkim so Aragones et al. (2016) so poročali, da prehranski proantocianidini, člani družine polifenolov, povečajo jetrni NAD plus metabolizem tako, da izboljšajo biosintezno pot NAD plus in aktivnost Sirte na način, ki je odvisen od odmerka pri podganah [12]. Poleg tega jetra izvažajo prekurzorje NADt v druge organe, kot so skeletne mišice, ki imajo manjšo sposobnost sintetiziranja NAD, kar poveča možnost razširitve učinkov, opaženih v jetrih, na celoten organizem [64]. Medtem ko so nekatere študije poročale o učinku dodatka CF na vsebnost beljakovin Sirt1, aktivnost ali mRNA [12,15-17,65,66], je vključenost presnove NAD v mitohondrijsko biogenezo po dodatku CF z uporabo izgube ali pridobitve funkcija ni bila nikoli testirana. Medtem ko bi bilo mišično specifično izločanje bolj zaželeno kot miši Sirt3 KO za celotno telo, uporabljene v naši študiji, naši rezultati kažejo, da CF izboljša metabolizem NAD, Sirt3 pa je vključen v to izboljšanje aktivnosti transportne verige mitohondrijskih elektronov, ki ga povzroči dodatek. Pozitivnih učinkov, opaženih na aktivnost mitohondrijskih kompleksov po dodatku CF, niso opazili pri miših Sirt3-7, večjo aktivnost aktivnosti kompleksa I in IV pa so opazili po dodatku CF le pri WT. Ta opažanja razširjajo prejšnja dela, ki kažejo, da ima Sirt3 ključno vlogo pri delovanju mitohondrijev ]67. Skupaj te ugotovitve kažejo, da so sirtuini prek modulacije presnove NAD vključeni v izboljšanje mitohondrijske mase, opaženo po dodatku CF. 4.4.Meje
Kakavova zrna so sestavljena iz mešanice monomernih, oligomernih in polimernih flavanolov. Med flavanoli se zdi, da je EPI najpogostejši polifenolni monomer, ki ga najdemo v kakavovih izdelkih, saj predstavlja do 35 odstotkov vsebnosti polifenolov [68]. EPI je bil uveljavljen kot glavna bioaktivna molekula, na kateri temeljijo koristi, povezane z dodatkom kakava in čokolade [47,69]. Vendar pa so presnovki EPI (EPIm) lahko vključeni v biološke učinke, ki jih povzroči EPI, opažene v študijah in vivo. EPIm lahko doseže višje koncentracije v plazmi kot EPI[70]. Poleg tega so opazili velike razlike v EPIm med vrstami. Dejansko 80 odstotkov EPIm, prisotnega pri ljudeh, ni bilo odkritih pri podganah, medtem ko je bilo ugotovljeno, da je podobnost med mišmi in ljudmi nekoliko ugodnejša, saj sta bila odkrita dva glavna človeška metabolita [70]. Uporabili smo obogateni ekstrakt CF, ki je vseboval do petkrat več EPI kot nefermentirana kakavova zrna[71]. Poleg tega se je vsebnost EPI zmanjšala za 10-20 odstotkov s fermentacijo in zmanjšala v odvisnosti od temperature med praženjem [71,72]. Skupaj ti podatki kažejo, da je treba pozornost nameniti le vsebnosti EPI pri ocenjevanju koristi dodatka EPI za zdravje ljudi, sedanje rezultate pa je treba obravnavati previdno, preden ekstrapoliramo opazovane osnovne mehanizme pri ljudeh.
5. Sklepi
Dnevna dopolnitev CF 15 dni vodi do izboljšanja mitohondrijske funkcije v oksidativnih in glikolitičnih mišicah. Sedanji rezultati kažejo, da povečano mitohondrijsko dihanje povzroči povečanje mitohondrijske mase, medtem ko se celična raven proizvodnje ROS ohranja, kar kaže na kvalitativne prilagoditve v mitohondrijih. Sočasno s prej opisanim celičnim učinkom na presnovo NO [73], CF modulira presnovo NAD, ki stimulira aktivnost sirtuinov. Sirt3 ima osrednjo vlogo pri mitohondrijskih prilagoditvah in presnovni prožnosti po dodatku CF. Ker so sirtuini nedavne tarče v patogenezi različnih bolezni, kot sta sladkorna bolezen ali astma [74,75l, bodo nadaljnje študije raziskale morebitni interes uporabe CF kot naravnega aktivatorja sirtuinov.
Reference
1. Kuznetsov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analiza mitohondrijske funkcije in situ v permeabiliziranih mišičnih vlaknih, tkivih in celicah. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]
2. Sena, LA; Chandel, NS Fiziološke vloge mitohondrijskih reaktivnih kisikovih vrst. Mol. Celica 2012, 48, 158–167. [CrossRef]
3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Interplay Between Intracellular Ca2 plus oscilations and Ca2 plus-stimulated Mitochondrial Metabolism. Sci. Rep. 2016, 6, srep19316. [CrossRef]
4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitohondrijske bolezni: prispevek odzivov na stres organelov k patologiji. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]
5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Oskrba in uporaba kisika v mišicah pri sladkorni bolezni tipa 1, od zunanjega zraka do mitohondrijske dihalne verige: Ali obstaja omejevalni korak? Diabetes Care 2020, 43, 209–218. [CrossRef]
6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Od mitohondrijev do sarkopenije: Vloga vnetja in implikacije osi RAGE-liganda. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]
7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakav in čokolada v zdravju in boleznih ljudi. Antioksid. Redox signal. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Kratkotrajnemu jemanju temne čokolade pri zdravih osebah sledi občutno povečanje občutljivosti na insulin in znižanje krvnega tlaka. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]
9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Krvni tlak je zmanjšan in občutljivost za inzulin se poveča pri osebah s hipertenzijo, ki ne prenašajo glukoze, po 15 dneh uživanja temne čokolade z visoko vsebnostjo polifenolov. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]
10. Ottaviani, JI; Mama, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Stereokemična konfiguracija flavanolov vpliva na raven in metabolizem flavanolov pri ljudeh in njihovo biološko aktivnost in vivo. Prosti Radič. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]
