Kvercetin zmanjša oksidativne spremembe v možganih, ki jih povzročajo nanodelci železovega oksida pri podganah

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.comza več podrobnosti

Povzetek: Terapija z nanodelci železovega oksida (IONP) ima različne koristi za zdravje, vendar lahko visoki odmerki ali dolgotrajna terapija povzročijo oksidativne celične poškodbe, zlasti v možganih. Zato smo izvedli trenutno študijo, da bi raziskali zaščitno vlogokvercetindopolnilo proti oksidativnim spremembam, povzročenim v možganih podgan zaradi IONP. Štirideset odraslih samcev albino podgan je bilo razdeljenih v enakih pet skupin; kontrolna skupina je prejela normalno bazalno dieto, skupini IONP so intraperitonealno injicirali IONP 50 mg/kg telesne teže (TM), skupine, zdravljene s kvercetinom, pa so imele IONP plus Q25, IONP plus Q50 in IONP plus Q100, ki so bili peroralno nadomeščeni s kvercetinom z odmerki 25, 50 in 100 mg kvercetina/kg telesne mase dnevno, ki so jih dajali z enakim odmerkom IONP 30 dni. IONP so povzročili znatno povečanje malondialdehida (MDA) in znatno zmanjšali reducirani glutation (GSH) in oksidirani glutation (GSSG). Posledično so IONP znatno povzročili hude poškodbe možganskega tkiva zaradi odlaganja železa, kar je povzročilo oksidativne spremembe s pomembnim povečanjem možganske kreatin fosfokinaze (CPK) in acetilholinesteraze (AChE). Poleg tega so IONP povzročili znatno zmanjšanje epinefrina, serotonina in melatonina v možganih z znižanjem mRNA mRNA receptorja gama, aktiviranega s peroksisomskim proliferatorjem, 1-alfa (PGC-1a) in mitohondrijskega transkripcijskega faktorja A (mtTFA). izrazi. IONP so povzročili apoptozo v možganih, spremljano s povečanjem kaspaze 3 in zmanjšanjem ravni ekspresije B-celičnega limfoma 2 (Bcl2). Dodatek kvercetina je opazno premagal možganeoksidativne poškodbena način, ki je odvisen od odmerka. Zato je dodajanje kvercetina med IONP zelo priporočljivo, da pridobite koristi IONP z manj nevarnostmi za zdravje.

Ključne besede: nanodelci železovega oksida; oksidativni stres; kvercetin; antioksidant

1. Uvod

Nanodelci železovega oksida (IONP) se uporabljajo za ciljanje zdravil, dostavo genov, označevanje celic, kontrastno sredstvo pri slikanju z magnetno resonanco in zdravljenje s hipertermijo [1]. Uporablja se tudi kot aditiv za živila v pijačah, obogatenih z železom, in žitih za prehrano ljudi [2] poleg številnih industrijskih uporab pri čiščenju odpadne vode, zaznavanju plinov in polprevodniških sorbentih, mazivih, pigmentih in premazi [3]. Vendar pa raznolika uporaba IONP povzroči preobremenitev z železom in posledično sprožitev oksidativnega stresa v različnih organih [4]. Zaužitje, vdihavanje in dermalna penetracija so glavne poti za vstop IONP[5]. V krvnem obtoku se IONP vežejo na plazemske beljakovine in porazdelijo v različna telesa

organov, vključno z jetri, vranico, ledvicami, pljuči in srcem, ter prodrejo skozi krvno-možgansko pregrado (BBB) ​​in povzročijo oksidativne poškodbe [6,7]. Železo, sproščeno iz IONP, ki povzroča nastajanje reaktivnih kisikovih vrst (ROS), vodi do resnih oksidativnih sprememb v lipidih, beljakovinah in DNK [8,9].

Kvercetin(3,3',4',5,7-pentahidroksiflavon) jeflavonoidprisoten v sadju (jabolka, jagodičevje, češnje in rdeče grozdje) in zelenjavi (čebula in brokoli) poleg številnih semen, ajde, oreščkov, rož, lubja, zelenega čaja in oljčnega olja [10]. Kvercetin ima številne dragocene učinke, ki vključujejo protivnetne, antioksidativne, antimutagene, antiishemične, protivirusne učinke in učinke proti staranju [11-17]. Kvercetin je lipofilen in lahko prodre skozi krvno-možgansko pregrado (BBB)[18]. Poleg tega ima kvercetin potencialno antioksidativno vlogo s povečanjem reduciranega glutationa (GSH) in uravnavanjem bakrovo-cinkove superoksid dismutaze (SOD1) [17]. Kvercetin lahko kelira železo, zavira Fentonovo reakcijo in zavira nastajanje ROS [19]. Posledično je kvercetin možno terapevtsko sredstvo za več nevrodegenerativnih bolezni in nevronskih poškodb [20]. Theantioksidantpotencial kvercetina nas je spodbudil k izvedbi te študije, da bi raziskali zaščitni potencial kvercetina pred oksidativnimi spremembami, ki jih povzročajo IONP na možganskih tkivih.

Kliknite, če želite izvedeti več o izdelkih

2. Rezultati

2.1. Velikost in stroški IONP

SEM slika IONP, kot je prikazano na sliki 1, je razkrila sferično obliko s povprečno velikostjo 16.34-22,88 nm, medtem ko je imela pozitivno vrednost zeta potenciala plus 22,8 mV (slika 2).

2.2. Možganski oksidativni stres in antioksidativno stanje

Ravni produkta lipidne peroksidacije malondialdehida (MDA) so bile znatno povečane v skupini IONP (p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Ravni GSH v homogenatu možganov so se znatno znižale pri IONP (str<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Raven oksidiranega glutationa (GSSG) je bila znatno povečana v IONP (str<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

Na podlagi podatkov GSH in GSSG so se vrednosti razmerja GSH/GSSG znatno zmanjšale pri IONP (p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3. Aktivnosti možganske kreatin fosfokinaze (CPK) in acetilholinesteraze (AChE)

Aktivnosti CPK so bile znatno povečane pri IONP (str<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

Na sliki 4B so bile aktivnosti AChE znatno povečane v IONP (str<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4.Možganski hormoni epinefrin, serotonin in melatonin

Ravni epinefrina v homogenatih možganov so se znatno zmanjšale pri IONP (str<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Kot je razvidno iz slike 4D, so bile ravni serotonina znatno znižane v IONP (str<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Ravni melatonina v homogenatih možganov so se znatno zmanjšale pri IONP (str<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Ekspresija mRNA PGC-1a in mtTFA v možganih

Koaktivator gama receptorja, aktiviranega s proliferatorjem peroksisoma 1-alfa(PGC-1a) mRNA, spremembe ekspresije gub so se znatno zmanjšale pri IONP (p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

V IONP (str<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6. Ocena obarvanja možganskih odsekov s hematoksilinom (H) in eozinom (E).

Histološke ocene možganskega tkiva so pokazale, da je kontrolna skupina pokazala normalno histološko strukturo plasti malih možganov (slika 6A). V skupini IONP so mali možgani pokazali močno izčrpanost plasti Purkinjejevih celic (slika 6B), medtem ko je ta izčrpanost Purkinjejevih celic plast zaradi IONPs je bila zmanjšana v skupinah IONPs plus Q25 (slika 6C), IONPs plus Q50 (slika 6D) in IONPs plus Q100 (slika 6E) na način, ki je odvisen od odmerka.

Podgane v kontrolni skupini so pokazale normalno histološko strukturo možganskih ovojnic in možganske skorje (Shema 1A), medtem ko so možganske ovojnice podgan, zdravljenih z IONP, pokazale zastoj submeningealnih krvnih žil (Shema 1B). V skupinah IONP so možgani možganov podgane so pokazale satelitozo, nevronofagijo (Shema 1C), gliozo (Shema 1D) in spongiozo (Shema 1E) poleg kongestije horoidnega pleksusa (Shema 1F).

Kot je razvidno iz sheme iF, so možgani podgan v skupini IONPs plus Q25 pokazali spongiozo (kratke puščice) in kongestijo submeningealnih krvnih žil. Poleg tega so možgani podgan v skupini IONPs plus Q50 pokazali blago spongiozo in zastoj krvnih žil (Shema 1H). Možgani podgan v skupini IONPs plus Q100 so pokazali razmeroma normalno histološko strukturo možganskih ovojnic in možganske skorje (Shema 1I).

2.7. Ocena obarvanja možganskih delov s prusko modro

Odseki možganov kontrolne skupine so pokazali negativno prusko modro obarvanje (slika 7A). V skupini IONP so bile na možganskih delih prepoznane prusko modre lise (slika 7B). Nasprotno pa je bila intenzivnost prusko modrih madežev obarvanja odsekov skupine IONPs oslabljena s kvercetinom v skupinah IONPs plus Q25 (slika 7C), IONPs plus Q50 (slika 7D) in IONPs plus Q100 (slika 7E) v odvisno od odmerka.

2.8. Raven proteinov kaspaze 3 in Bcl2 v možganskih delih

Kontrolna skupina je pokazala negativno izražanje ravni proteina kaspaze 3 (slika 8A), medtem ko so bile močno izražene v IONP (slika 8B).Obdelana s kvercetinomskupine (slika 8C-E) so pokazale nizko izraženost kaspaze 3 v primerjavi z IONP. Nasprotno, Bcl2 je bil znatno izražen v IONPs plus Q25 (slika 9C), IONPs plus Q50 (slika 9D) in IONPs plus Q100 (slika 9E) v primerjavi z IONPs (slika 9B) in kontrolno skupino (slika 9A).

3. Razprava

Izpostavljenost IONP je povzročila železo in njegovo odlaganje v mehkih tkivih, zlasti v možganih [21]. V tej študiji smo prepoznali odlaganje železa v možganih, kar je dokazano z barvanjem s prusko modro barvo in morfološkimi spremembami, ki jih spremljamo z oceno H in E barvanja. Dhakshinamoorthy et al. [22] so pokazali, da se je vsebnost železa znatno povečala v možganskem tkivu skupin, zdravljenih z IONP, v primerjavi s kontrolo. To je bilo ocenjeno s prusko modrim obarvanjem možganskih regij in dokazano z modrimi pikami v čelni skorji, hipokampusu in malih možganih. El-Sayed et al. [23] so tudi navedli znatno povišanje ravni železa v možganskem tkivu zaradi dajanja IONP pri podganah.

IONP bi lahko imeli več zmožnosti, da prodrejo v BBB in povzročijo poškodbe možganskih celic kot druge organske celice [24, 25]. Druga razlaga je lahko povečana raven železa

v možganih zaradi vezave železa na transferin sproži regulacijo receptorjev za železo v možganih in posledično prenaša železo preko BBB [26].

Prosti feioni reagirajo s H2O2, da ustvarijo ROS v Fentonovem reakcijskem procesu [27]. Povišan ROS je povečal prepustnost zunanje mitohondrijske membrane, peroksidacijo lipidov, poškodbo beljakovin in prekinitev verige DNA [28]. Theoksidativni stresROS je povzročilo zvišanje ravni produkta lipidne peroksidacije MDA v možganih, kot je navedeno v trenutni študiji pri podganah, zdravljenih z IONP. Podobno so Dhakshinamoorthy et al [22] poročali o znatnem povečanju ravni MDA v možganskih tkivih miši, zdravljenih z IONP. Reddy et al.[26] je tudi navedel, da so se ravni MDA znatno povečale v možganskem tkivu pri visokih odmerkih, vendar nepomembno povečanje pri nizkih odmerkih pri podganah, zdravljenih z IONP. Gaharwar in Paulraj [5] sta razkrila, da so bile ravni MDA znatno povišane pri podganah, zdravljenih z IONP. Podobno so IONP povzročili oksidativno poškodbo kardiomiocitov, spremljano z visoko proizvodnjo MDA in zmanjšano koncentracijo GSH [29].

Avtorji v več študijah so preučevali zaščitni učinek naravnih proizvodov ali njihovih izvlečkov proti stranskim učinkom, povezanim z IONP, vključno z izvlečki Echinacea purpurea [30] in Antlriscus sulvestris [31]. V trenutni študiji smo raziskali zaščitno vlogo kvercetina proti toksičnosti IONP v možganih podgan. Dodatek kvercetina pri podganah, zdravljenih z IONP, je zmanjšal ravni MDA v možganskem tkivu in naši rezultati so bili v skladu s tistimi, ki so jih dobili Dong et al. [32], ki je izjavil, da je kvercetin zmanjšal peroksidacijo lipidov z znižanjem ravni MDA v možganskem tkivu pri podganah. To je mogoče pojasniti s sposobnostjo kvercetina, da zmanjša ROS, torej zavira peroksidacijo lipidov in preprečuje nastanek MDA [33]. To so pripisali skupini katehol (obroč B) in skupini OH na položaju 3 obroča A in C, ki imata optimalno lovljenje prostih radikalov [17].

GSH je bistveni del celične antioksidativne obrambe, ki neposredno reagira z ROS in drugimi reaktivnimi vrstami [34]. V tej študiji so bile možganske ravni GSH pri podganah, zdravljenih z IONP, znatno znižane, vendar so bile ravni GSSG znatno povečane. Reddy et al [26] so navedli zmanjšanje ravni GSH v možganskem tkivu podgan, zdravljenih z IONP, in predlagali, da je to lahko posledica povečane uporabe GSH v konjugacijskih reakcijah kot del mehanizma razstrupljanja, zato se je zmanjšan GSH zmanjšal in oksidiral GSSG povečala. Sočasno dajanje kvercetina podganam, zdravljenim z IONP, je to obnovilo s povečanjem GSH in znižanjem ravni GSSG v možganskem tkivu. Ti rezultati so bili v skladu s Singh et al. [35], ki je poročal o zvišanju ravni GSH v možganskem tkivu, kar kaže na antioksidativni potencial kvercetina. Dong et al. [32] je tudi razkrilo, da je kvercetin spremenil izražanje gena faktorja 2 (Nrf2) povezanega z jedrskim faktorjem eritroid 2-. Nrf2 je posledično spodbudil proizvodnjo antioksidantnega encima v možganskih tkivih.

V tej študiji je bila CPK znatno povečana v možganskem tkivu podgan, zdravljenih z IONP. Pri varovanju celične energije in prenosu energije ima CPK/fosfokreatin pomembno vlogo, zlasti v celicah z visokimi in nihajočimi potrebami po energiji, kot so nevroni [36]. Zato so lahko aktivacija sistema CPK/fosfokreatin in spremembe izražanja CPK zgodnejši pokazatelj oksidativnega in bioenergetskega stresa v celici [37] kot nadomestilo za zmanjšanje proizvodnje energije zaradi oksidativnega stresa. Sočasno dajanje kvercetina podganam, zdravljenim z IONP, je zmanjšalo CPK v možganskem tkivu, Lemmens et al. [38] dokazali zmanjšanje aktivnosti CPK zaradi dodajanja kvercetina.

Aktivnost AChE v živčnem tkivu je odgovorna za hidrolizo acetilholina (Ach) v holin v sinapsah in nevromuskularnem stiku [39]. V tej študiji je bil AChE znatno povečan pri podganah, zdravljenih z IONP, in ta rezultat je bil v skladu z Dhakshinamoorthy et al. [22], ki je prepoznal znatno povečanje aktivnosti AChE v možganskem tkivu podgan, zdravljenih z IONP, pri katerih je kopičenje železa z IONP spremenilo holinergični sistem.

Nevrotransmiterji so endogene kemične snovi, ki nevronom omogočajo komunikacijo po telesu; možganom omogočajo izvajanje različnih funkcij v kemičnem sinaptičnem prenosu [40]. V trenutni študiji so se koncentracije epinefrina, serotonina in melatonina v možganskih tkivih znatno zmanjšale pri podganah, zdravljenih z IONP.

Yousef et al. [41] so poročali, da so se ravni serotonina in dopamina znatno znižale v možganskem tkivu pri podganah, zdravljenih z IONP. Nasprotno pa je kvercetin povečal koncentracije epinefrina, serotonina in melatonina v možganskih tkivih v primerjavi z IONP. Singh et al. [35l je izjavil, da je kvercetin povečal serotonin, norepinefrin in dopamin.

Mitohondrijska biogeneza prevzame glavno vlogo pri vzdrževanju mitohondrijske homeostaze za izpolnjevanje celičnih fizioloških potreb živčnih celic [42]. PGC-1a je kotranskripcijski regulacijski faktor, ki inducira mitohondrijsko biogenezo in spodbuja izražanje mtTFA [43]. V tej študiji so se ravni izražanja PGC-1a in mtTFA znatno zmanjšale v možganskem tkivu pri podganah, zdravljenih z IONP. Naši rezultati so bili v skladu s tistimi, ki so jih pridobili Yousef et al. [44]. Ponazorili so, da je mitohondrijska biogeneza, ki jo predstavljata PGC-la in mtTFA, znatno zmanjšala njuno izražanje v možganskem tkivu pri podganah, izpostavljenih IONP, kar kaže na zmanjšano mitohondrijsko biogenezo ter replikacijo in transkripcijo mtDNA, ki bi lahko povzročila mitohondrijsko disfunkcijo. Sočasna uporaba kvercetina pri podganah, zdravljenih z IONP, je obnovila to zmanjšanje s povečanjem ekspresije PGC-1a in mtTFA v možganskem tkivu, naši rezultati pa so bili v skladu s Sharma in sod. [45]. ki so poročali, da je kvercetin povečal izražanje PGC-1a, NRF-1, NRF-2 in mtTFA. Predlagali so, da zaradi zmanjšanja ROS zaradi PGC{{17, ki ga povzroča kvercetin }}zvišanje, je to vodilo do aktivacije NRF-1 in NRF-2 stimulirane ekspresije mtTFA.

Kvercetin je oslabil apoptotični učinek IONP s pomembnim zmanjšanjem kaspaze 3 in povečanjem ravni izražanja Bcl2 v možganskih imunohistokemičnih odsekih. Ta ugotovitev podpiraantioksidantpotencial kvercetina. Podobno je zdravljenje s kvercetinom oslabilo povečanje kaspaze 3 pri ishemični možganski poškodbi pri podganah [46, 47] in Bcl2 pri miših, zdravljenih z lipopolisaharidi [48].

4. Materiali in metode

4.1. Reagenti in kemikalije

Prašek nanodelcev železovega (ⅡI) oksida je bil pridobljen pri Sigma-Aldrich (Louis, Mo, ZDA), ki je bil pred uporabo raztopljen v deionizirani vodi. Kvercetin v praškasti obliki so prav tako pridobili pri Sigma-Aldrich, ki smo ga pred uporabo raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO) in destilirani vodi v razmerju 1:20. DMSO, večji ali enak 99,6 odstotka, je bil kupljen pri Sigma-Aldrich. Druge kemikalije in deionizirano vodo so kupili pri Centru za podiplomski študij in raziskave na univerzi v Aleksandriji.

4.2. Etična izjava

Študija je bila odobrena kot odziv na smernice "NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" Odbora za etiko Fakultete za veterinarsko medicino Univerze v Aleksandriji v Egiptu.

4.3. Karakterizacija IONP

Morfologijo in velikost delcev IONP smo pregledali z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM). Naboj delca je bil določen tudi z zeta potencialom z ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK).

4.4.Živali, nastanitev in načrtovanje poskusov

Štirideset zdravih odraslih samcev albino podgan s težo 150 ± 20 telesne teže (BW) je bilo kupljenih od enote za vzrejo živali Medicinskega raziskovalnega inštituta univerze v Aleksandriji v Egiptu. Živali so bile v kovinskih kletkah v nadzorovanih okoljskih pogojih z optimalno temperaturo (23±2), vlažnostjo (55±5) in ciklom temno/svetlo (12 h) ter prostim dostopom do osnovne krmne prehrane (tabela 1) in pitno vodo. Vse živali so bile dva tedna pred poskusom nameščene zaradi aklimatizacije. Podgane so bile naključno razporejene v pet skupin (vsaka osem podgan); kontrolna skupina je prejemala običajno bazalno dieto in vodo ad libitum, skupini IONPs so trikrat na teden intraperitonealno injicirali IONPs 50 mg/kg telesne mase [49], skupini IONPs plus Q25 mg so dajali enak odmerek

IONPs in sondirano s 25 mg kvercetina/kg telesne mase dnevno, skupini IONPs plus Q50 so dajali enak odmerek IONPs in sondirali 50 mg kvercetina/kg telesne mase dnevno, skupini IONPs plus Q100 pa so dajali enak odmerek IONPs in sondirali s 100 mg kvercetina/kg telesne mase dnevno [17]. Vsa zdravljenja so trajala 30 dni.

4.5. Vzorčenje

Na koncu poskusa so podgane postili 12 ur in jih anestezirali z intraperitonealno injekcijo ketamina/ksilazina (100 mg/kg/10 mg/kg), nato pa jih evtanazirali in možgane takoj secirali, speremo z ohlajeno fiziološko raztopino 0,9 odstotka in razdelimo na tri dele; prvi je bil uporabljen za biokemijske analize. Drugi del smo hranili pri -80 stopinji za ekstrakcijo mRNA in oceno RT-PCR, medtem ko smo zadnji del splaknili s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS, pH 7,4) in 48 ur fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu, raztopljenem v PBS. fiksacija vzorca.

4.6. Biokemijske analize

Dele možganov vsake podgane smo homogenizirali v hladni fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS) in centrifugirali 10 minut pri 4 stopinjah pri 1435 × g. Malondialdehid (MDA), GSH, oksidirani glutation (GSSG) in kreatin fosfokinazo (CPK) so določili s komercialnimi kompleti Biodiagnostic Co. (Giza, Egipt). Aktivnosti encima acetilholinesteraze (AChE) v homogenatih možganov so bile določene s kompletom za kolorimetrične teste (BioVision Co., Milpitas, CA, ZDA). Ravni epinefrina, serotonina in melatonina v homogenatih možganov so bile določene tudi z uporabo kompletov ELISA (BioVision Co., Milpitas, CA, ZDA).

4.7. Ekstrakcija mRNA in RT-PCR

Celotno RNK smo ekstrahirali iz vzorcev s pomočjo proizvajalčevih kompletov za ekstrakcijo totalne RNK easy-RED (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Južna Koreja). cDNA prve verige je bila dosežena z uporabo paketa cDNA HiSen Script (iNtRON Biotechnology, Inc.). Specifični primerji so bili uporabljeni za pomnoževanje izbranih genov z gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH) kot stabilnim gospodinjskim genom (tabela 2). Ekspresija mRNA je bila dosežena z uporabo gena Strata MX3005P PCR v realnem času (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA) in glavno mešanico TOP real TM PreMIX SYBR Green qPCR (kat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Južna Koreja) po navodilih proizvajalca. Relativne koncentracije genske ekspresije so bile ovrednotene z metodo 2-AAct, kot jo je opisal Pfaffl [50].

4.8. Histopatološki pregled

Z uporabo tradicionalne tehnike vgradnje parafina so bili fiksirani vzorci dehidrirani z naraščajočimi stopnjami etanola, očiščeni v treh ksilenskih premikih in zaključeni z vdelavo v parafin pri 65 stopinjah C. Odseki debeline 4 um so bili obarvani s hematoksilinom in eozinom (H in E) [51].

Odseke možganov smo hidrirali skozi vrsto padajočih koncentracij alkohola in jih za 30 minut dali v 20-odstotno raztopino kalijevega ferocianida z 20-odstotno raztopino HCl. Predmetna stekelca smo sprali, dehidrirali, očistili s ksilenom in pod mikroskopom opazovali modro obarvanje ali vsebnost železa [52].

4.9.Imunohistokemijska preiskava

Standardna imunohistokemijska tehnika hrenove peroksidaze (HRP) je bila uporabljena za pozitivno nabite preparate parafinskih tkivnih odsekov. V skladu s smernicami proizvajalca sta bili uporabljeni zajčja anti-podganja kaspaza 3 (Lab Vision, Fremont, CA, ZDA) in Bcl2 (DAKO, Glostrup, Danska). Pet um debelih odsekov velikih možganov, malih možganov, hrbtenjače in ishiadičnega živca smo razvoskali, rehidrirali in predhodno obdelali s 3 odstotki vodikovega peroksida (H2O2), da bi blokirali aktivnost endogene peroksidaze. Pridobivanje antigena je bilo doseženo tako, da stekelca za 1 0 minuto postavite v mikrovalovno pečico v 10 mM pufru natrijevega citrata (pH 6,0). Predmetna stekelca smo inkubirali s primarnim protitelesom in nato splaknili s slanico tris-pufra in sekundarnim protitelesom. Predmetna stekelca smo inkubirali s kromogensko raztopino substrata 3,3/-diaminobenzidina (DAB) in nato kontrastno obarvali z Mayerjevim hematoksilinom. Slike 10 različnih polj so bile posnete pri povečavi × 400.

4.10. Statistična analiza

Za analizo podatkov je bila uporabljena enosmerna ANOVA s Tukeyevimi post hoc testi več razponov z uporabo GraphPad Prism v.5 https://www.graphpad.com/, dostop 10. marca 2021 (GraphPad, San Diego, CA, ZDA) . Vse izjave o pomenu so bile odvisne od str<0.05. 5.="">

Nanodelci železovega oksida (IONP), intraperitonealno vbrizgani v odmerku 50 mg/kg BW, so povzročili oksidativne spremembe v možganih, medtem ko je kvercetin v odmerkih 25, 50 in 100 mg/kg BW ublažil oksidativne poškodbe možganov, ki jih povzročajo IONP. Zato je kvercetin obetaven prehranski dodatek skupaj z IONP terapijo.

Reference

1. Mazdeh, M.; Rahiminejad, ME; Nili-Ahmadabadi, A.; Ranjbar, A. Nevrološke motnje in oksidativni toksični stres: vloga kovinskih nanodelcev. Jundishapur J. Nat. Pharm. Prod. 2016, 11, e27628. [CrossRef]

2. Fidler, MC; Walczyk, T.; Davidsson, L.; Zeder, C.; Sakaguchi, N.; Juneja, LR; Hurrell, RF Mikroniziran, disperzibilen železov pirofosfat z visoko relativno biološko uporabnostjo pri človeku. Br. J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [CrossRef]

3. Ramimoghadam, D.; Bagheri, S.; Hamid, SBA Napredek pri elektrokemijski sintezi magnetnih nanodelcev železovega oksida. J. Magn. Magn. Mater. 2014, 368, 207–229. [CrossRef]

4. Gaharwar, ZDA; Kumar, S.; Rajamani, P. Hematopoetski in imunološki odziv, ki ga povzročajo nanodelci železovega oksida pri podganah. RSC Adv. 2020, 10, 35753–35764. [CrossRef]

5. Gaharwar, ZDA; Paulraj, R. Oksidativna poškodba nanodelcev železovega oksida v perifernih krvnih celicah podgan. J. Biomed. Sci. inž. 2015, 8, 274–286. [CrossRef]

6. Feng, Q.; Liu, Y.; Huang, J.; Chen, K.; Huang, J.; Xiao, K. Vnos, porazdelitev, očistek in toksičnost nanodelcev železovega oksida z različnimi velikostmi in prevlekami. Sci. Rep. 2018, 8, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

7. Gaharwar, ZDA; Meena, R.; Rajamani, P. Biodistribucija, očistek in morfološke spremembe intravensko danih nanodelcev železovega oksida pri samcih podgan Wistar. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 9677–9692. [CrossRef] [PubMed]

8. Palmieri, B.; Sblendorio, V. Oksidativni stresni testi: Pregled zanesljivosti in uporabe, II. del. EUR. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2007, 11, 383–399.

9. Naqvi, S.; Samim, M.; Abdin, M.Z.; Ahmed, F.J.; Maitra, A.N.; Prashant, C.K.; Dinda, A.K. Concentration-dependent toxicity of iron oxide nanoparticles mediated by increased oxidative stress. Int. J. Nanomed. 2010, 5, 983–989. [CrossRef]

10. David, AVA; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Pregledi biološkega pomena kvercetina: bioaktivni flavonoid. Pharmacogn. Rev. 2016, 10, 84–89.

11. Wu, W.; Li, R.; Li, X.; On, J.; Jiang, S.; Liu, S.; Yang, J. Kvercetin kot protivirusno sredstvo zavira vstop virusa influence A (IAV). Virusi 2015, 8, 6. [CrossRef]

12. Akdemir, FNE; Gülçin, ˙I.; Karagöz, B.; Soslu, R. Kvercetin ščiti skeletne mišice podgan pred ishemijsko-reperfuzijsko poškodbo. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2016, 31, 162–166. [CrossRef] [PubMed]