DNA cepljenje povzroči zaščitno imunost proti okužbi s SARS CoV-2 pri hrčkih

Slika 2. Odziv protiteles pri miših po imunizaciji s cepivoma SARS-CoV in SARS-CoV-2 S DNA.

(A) Miši BALB/c (n=4 na skupino) smo dvakrat intramuskularno imunizirali v 3-tedenskem intervalu s 100 ug navedenega plazmida, čemur je sledila elektroporacija. Vzorci seruma so bili zbrani v navedenih časovnih točkah po prvi imunizaciji. (BD, F, G) Protitelesa proti koničastemu proteinu polne dolžine SARS-CoV-2, regiji S2 in RBD so bila ocenjena z ELISA. (E, H) S cepivom povzročeno nevtralizirajoče protitelo proti SARS-CoV-2 je bilo ocenjeno z nevtralizacijskim testom. Titri protiteles so predstavljeni kot povprečje ± SEM, titri nevtralizacije pa so izraženi kot geometrična sredina s 95-odstotnim intervalom zaupanja. *str<0.05 by the Mann-Whitney test.

Da bi dodatno raziskali, ali lahko zamenjava vodilnega zaporedja poveča izločanje beljakovin, smo uporabili vodilno zaporedje iz aktivatorja tkivnega plazminogena za spajanje različnih variant SARS-CoV-2 S proteina. Vse različice vsebujejo regijo RBD proteina SARS-CoV-2 S. Po dveh odmerkih imunizacije z DNA so serume, zbrane v 4. tednu in 6. tednu, analizirali na titre protiteles IgG in nevtralizirajočih protiteles. Imunizacija s ptSARS2-S je v 4. tednu povzročila višje titre protiteles proti proteinu S polne dolžine kot imunizacija s ptRBD, ptRBDTM in ptSdTM (S1A sl). Titri protiteles proti RBD pri imunizaciji s ptRBD so bili v 4. tednu višji kot pri imunizaciji s ptSARS2-S (1496,2 v primerjavi s 530,9, p=0.057) (S1B sl). Vendar je imunizacija proti ptRBD in ptSARS2-S povzročila podobne ravni nevtralizirajočih protiteles v 4. tednu (S1C sl). Enake rezultate so opazili pri analizi serumov v 6. tednu; Imunizacija s ptRBD je povzročila višje ravni protiteles proti RBD v primerjavi s cepljenjem s ptSARS2-S (12589,3 proti 1000,0, p=0,028), vendar enake ravni nevtralizirajočih protiteles (9,3 v primerjavi z 9,6 (log2)) (slika 2F, 2G in 2H). Ker različice tPA, spojene z vodilnim zaporedjem, niso inducirale višjih titrov nevtralizirajočih protiteles kot imunizacija pSARS2-S, smo za nadaljnjo preiskavo uporabili pSARS2-S.

Konkurenčna vezava serumskih protiteles in ACE2 na SARS-CoV-2 RBD

Da bi preverili sposobnost serumskih protiteles, da motijo ​​interakcijo ACE2-RBD, smo izvedli konkurenčni serološki test SARS-CoV-2. V tem testu so bila serumska protitelesa dodana na plošče ELISA, predhodno prevlečene s SARS-CoV-2 RBD proteinom, čemur je sledil dodatek človeškega proteina ACE2. Kot referenca je bilo uporabljeno specifično nevtralizirajoče protitelo proti SARS-CoV-2 RBD. Kot je prikazano vSlika 3, so se serumska protitelesa miši, imuniziranih s pSARS2-S, vezala na RBD in blokirala vezavo ACE2, kar je bilo enakovredno približno 353 ug/ml referenčnega protitelesa, medtem ko je bil serum pSARS-S enak 56 ug/ml referenčnega protitelesa. Zato naši podatki kažejo, da bi lahko imunizacija pSARS2-S inducirala konkurenčna protitelesa, ki učinkovito blokirajo vezavo SARS-CoV-2 RBD na receptor ACE2. Ta rezultat je bil skladen s titrom ELISA proti SARS-CoV2 RBD (Slika 2D), in podprto s študijo o razliki zaporedij RBD med SARS-CoV in SARS-CoV-2 [24].

Slika 3. Konkurenčna aktivnost imuniziranih mišjih serumov proti interakciji RBD/ACE2.

Miši BALB/c (n=4 na skupino) smo dvakrat intramuskularno imunizirali v 3-tedenskem intervalu s 100 ug vektorja, pSARS-S ali pSARS2-S, čemur je sledila elektroporacija. Vzorce seruma smo zbrali 8. teden po prvi imunizaciji. Serumska protitelesa, ki tekmujejo z ACE2 za vezavo RBD, so bila ocenjena s kompetitivnim serološkim testom SARS-CoV-2. Konkurenčna aktivnost mišjih serumov je izražena kot ekvivalentna raven protiteles proti RBD (SARS-CoV-2 spike protein) (referenčno protitelo). Titri protiteles so predstavljeni kot povprečje ± SEM. *str<0.05 by the Mann-Whitney test.

Dolgoročna humoralna imunost, povzročena s cepivom SARS-CoV-2 S DNA in ponujena navzkrižna zaščita proti SARS-CoV-2 z mutacijo D614G

Predvsem dolgoročno vzdrževanje titrov protiteles IgG proti S polne dolžine so opazili 20 tednov po prvi imunizaciji (Slika 4A). Geometrična sredina titrov (log2) za SARS-CoV-2 nevtralizirajoča protitelesa je dosegla 10,8 v 8. tednu po cepljenju s pSARS2-S, nekoliko pa se je zmanjšala na 9,1 v 12. tednu in na 8,8 v 20. tednu (Slika 4B). Ti rezultati kažejo, da imunizacija pSARS2-S povzroči dolgotrajen humoralni odziv proti SARS-CoV-2. Poleg tega je cepivo pSARS2-S DNA z genotipom D614 povzročilo odziv nevtralizirajočih protiteles proti virusu, ki vsebuje mutacijo D614G (Slika 4C), kar je podobno nevtralizacijskim titrom proti genotipu D614. Zato lahko pSARS2-S zagotovi navzkrižno zaščito pred najbolj razširjeno in prevladujočo različico D614G SARS-CoV-2.

Slika 4. Cepivo SARS-CoV-2 S DNA je povzročilo dolgoročno humoralno imunost in navzkrižno zaščito proti SARS-CoV-2 z mutacijo D614G.

BALB/c miši (n=4 na skupino) smo trikrat intramuskularno imunizirali v 3-tedenskem intervalu s 100 ug vektorja, pSARS-S ali pSARS2-S, čemur je sledila elektroporacija. Vzorci seruma so bili zbrani v navedenih časovnih točkah po prvi imunizaciji. (A) Protitelesa proti koničastemu proteinu polne dolžine SARS-CoV-2 so bila ocenjena z ELISA. (B, C) S cepivom povzročeno nevtralizirajočo aktivnost proti SARS-CoV-2 z genotipoma D614 ali G614 so ovrednotili z nevtralizacijskim testom. Titri protiteles so predstavljeni kot povprečje ± SEM, titri nevtralizacije pa so izraženi kot geometrična sredina s 95-odstotnim intervalom zaupanja. *str<0.05 by the Mann-Whitney test.

Indukcija Th1- ali Th2-pristranskih odzivov

Efektorske CD{0}} T celice lahko razdelimo na dve glavni funkcionalni podskupini, Th1 in Th2, na podlagi izločenih citokinov ob aktivaciji. Celice Th1 proizvajajo vnetne citokine (IFN-) in sodelujejo pri celično posredovanem imunskem odzivu proti intracelularnim bakterijam in virusom, medtem ko celice Th2 izločajo predvsem pomagajo celicam B proizvajati protitelesa, hkrati pa spodbujajo imunost, ki jo posredujejo eozinofilci (IL-5 in IL{ {9}}), kar povzroči humoralne ali alergične odzive [25, 26]. Poleg tega lahko mehanizmi, odvisni od celic Th2, prispevajo k povečani respiratorni bolezni, povezani s cepivom (VAERD), kot so pokazale študije kandidatov za cepivo proti SARS-CoV [27, 28], ki poudarjajo, da je uravnotežen odziv celic T ključnega pomena za varen razvoj cepiva proti COVID-19 [29]. Da bi rešili to težavo, smo miši BALB/c in C57BL/6 imunizirali z vektorjem, pSARS-S in pSARS2-S dvakrat v 3-tedenskem intervalu. Miši so žrtvovali 7 dni po drugi imunizaciji in splenocite 3 dni stimulirali s SARS-CoV-2 S proteinom (5 ug/mL). Pri miših BALB/c (Slika 5A–5D), je bilo izločanje citokinov tipa Th1 IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) in IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) visoko po stimulaciji s proteinom S v pSARS2-S skupini za imunizacijo, vendar so bile odkrite zelo nizke ravni citokinov tipa Th2 IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) in IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2). Podobne rezultate so opazili pri miših C57BL/6, pSARS2-S imunizacijska skupina je povzročila večjo količino IFN- (33918,8 pg/mL ± 11646,1) in IL-2 (800,3 pg/mL ± 109,5) kot tista IL-5 (4,6 pg/mL ± 2,9) in IL-13 (545,7 pg/mL ± 117,4) (Slika 5E–5H). Ti podatki kažejo, da bi pSARS2-S lahko povzročil Th1-pristranske imunske odzive.

Slika 5. Odziv celic T pri miših po imunizaciji s cepivoma pSARS-S in SARS2-S DNA.

Miši BALB/c (AD) in C57BL/6 (EH) (n=4 na skupino) smo dvakrat intramuskularno imunizirali v 3-tedenskem intervalu s 100 ug vektorja, pSARS-S ali pSARS{{ 8}}S, čemur sledi elektroporacija. Splenociti so bili zbrani 4. teden po prvi imunizaciji in ravni izločenega IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) in IL -13 (D, H) so ovrednotili po ponovni stimulaciji z rekombinantnim SARS-CoV-2 S proteinom. Titri protiteles so predstavljeni kot povprečje ± SEM. *str<0.05 by the Mann-Whitney test.

Profilaktična učinkovitost DNK cepiv proti SARS-CoV-2 izziv

Da bi raziskali zaščitno učinkovitost cepljenja pSARS2-S, so sirske hrčke dvakrat cepili s 100 ug DNA v 3-tedenskem intervalu in intranazalno okužili z virusom SARS-CoV-2 v 7. tednu (Slika 6A). Po imunizaciji smo 4. in 6. teden zbrali serume za analizo titra protiteles proti konicam (IgG) in titra nevtralizirajočih protiteles. Imunizacija s pSARS2-S je v 4. tednu (1584,9 v primerjavi s 50,1) in 6. tednu (1995,3 v primerjavi s 63,1) pri hrčkih izzvala višje ravni titrov protiteles proti Spike kot imunizacija s ptRBD (Slika 6B). V skladu s titri protiteles proti Spike so serumi hrčkov, imuniziranih s pSARS2-S, zvišali zelo visoke titre nevtralizirajočih protiteles (6,5 v 4. tednu in 6,4 v 6. tednu (log2)), vendar so serumi vektorskih oz. hrčki, imunizirani s ptRBD, niso (Slika 6C). Po izzivu s SARS-CoV-2 so telesno težo hrčka spremljali vsak dan. Prejšnje študije so pokazale, da je virusni titer v pljučih hrčka dosegel visoko raven 3 dni po izzivu [30]. Zato smo tretji dan žrtvovali polovico hrčkov iz vsake skupine in analizirali virusno obremenitev v pljučih. Telesna teža hrčkov, cepljenih z vektorji, se je postopoma zmanjševala in odstotek izgubljene telesne teže je bil 11,1 % 6 dni po izzivu. V nasprotju s tem je imunizacija pSARS2-S zaščitila hrčke pred izgubo telesne teže (Slika 6D). Poleg tega so titri infekcioznega virusa in število kopij virusne RNA v skupini pSARS2-S pokazali zmanjšanje za 2,29 in 1,37 log10 v primerjavi s kontrolno skupino vektorjev (Sliki 6E in 6F). Ti rezultati kažejo, da pSARS2-S imunizacija sirskim hrčkom zagotavlja zaščito pred okužbo s SARS-CoV-2.

Slika 6. Profilaktična učinkovitost cepiva SARS-CoV-2 S DNA pri hrčkih, okuženih s SARS-CoV-2-.

(A) Časovni potek cepljenja z DNK in izziva SARS-CoV-2. Sirski hrčki so bili dvakrat intramuskularno imunizirani v 3-tedenskem intervalu s 100 ug kontrole, pSARS-S ali pSARS2-S, čemur je sledila elektroporacija. Vzorce seruma smo zbrali z retroorbitalnim vzorčenjem krvi v 4. in 6. tednu po prvi imunizaciji. 4 tedne po drugi imunizaciji so sirske hrčke intranazalno okužili s 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Protitelesa proti koničastemu proteinu polne dolžine SARS-CoV-2 so bila ocenjena z ELISA. (C) S cepivom povzročeno nevtralizirajočo aktivnost proti SARS-CoV-2 so ovrednotili z nevtralizacijskim testom. (D) Sprememba telesne teže (%) hrčkov je bila zabeležena vsak dan po izzivu SARS-CoV-2. Titre virusa (E) in kopije virusne RNK (F) v pljučih hrčkov, okuženih s SARS-CoV-2-, 3 dni po izzivu so določili s testom TCID50 oziroma qRT-PCR. Titri protiteles so predstavljeni kot povprečje ± SEM, titri nevtralizacije pa so izraženi kot geometrična sredina s 95-odstotnim intervalom zaupanja. *str<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Diskusija

Začetih je bilo več kot 80 kliničnih preskušanj cepiva proti COVID-19, študije imunogenosti in virusnega izziva na živalih pa so ključni koraki v procesih razvoja cepiva. DNK cepiva za okužbo s SARS-CoV-2 so intenzivno razvijali za različne pristope dostave. Elektroporacija je obetaven pristop, ki lahko izboljša dostavo DNK in antigenost imunogenov in vivo. Poročali so o dveh študijah cepiva DNA, Yu et al. [13] in Smith et al. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 zmanjšanja virusnih obremenitev v bronhoalveolarnem izpiranju po izzivu v primerjavi s kontrolami. Smith et al. ugotovili, da lahko imunizacija miši in morskih prašičkov z INO-4800 (ki kodira protein S polne dolžine) z elektroporacijo izzove nevtralizirajoča protitelesa proti okužbi s SARS-CoV-2 in blokira vezavo proteina S na receptor ACE2, vendar je ne zagotavlja podatkov o izzivih živali. V tem poročilu smo ovrednotili različne različice kandidatov za cepivo DNA in ugotovili, da je protein S polne dolžine (pSARS2-S) najprimernejši za nadaljnje imunološke študije. Čeprav imata SARS-CoV in SARS-CoV-2 76 % homologijo svojih S proteinov [31, 32], imunizacija proti pSARS-S ne more inducirati protiteles proti RBD proteina SARS-CoV-2 S ali nevtralizirajočih titrov protiteles proti okužbi s SARS-CoV-2 (Slika 2). Dejansko imajo protitelesa proti RBD pomembno vlogo pri blokiranju virusne okužbe. Vendar pa je imunizacija samo z RBD (ptRBD) povzročila visoke titre nevtralizirajočih protiteles pri miših, ne pa tudi pri hrčkih (sl.2Hin6C). Špekulirali smo, da je ta rezultat morda posledica signalnega peptida (aktivator tkivnega plazminogena), ki ne olajša izločanja proteina RBD pri hrčkih. Podroben mehanizem zahteva nadaljnje študije v prihodnosti. Opazili smo tudi, da je imunizacija s ptRBDTM (ki kodira fragment iz RBD v transmembransko domeno S) povzročila nižje titre nevtralizirajočih protiteles kot imunizacija s ptRBD (sl.2HinS1C). Rezultati lahko odražajo nestabilno strukturo proteina RBD-TM. Za nadaljnjo raziskavo imunskih odzivov Th1/Th2 so splenocite imuniziranih miši stimulirali s proteinom SARS-CoV-2 S. Ugotovili smo, da je imunizacija pSARS2-S povzročila močne Th1-pristranske imunske odzive z višjimi stopnjami izločanja IFN- -po stimulaciji (Slika 5), vendar je imunizacija pSARS-S povzročila le nizke ravni izločanja IFN- -. Ti podatki so pokazali, da navzkrižna reaktivnost odzivov celic T med koničastim proteinom SARS-CoV in SARS-CoV-2 ni visoka (Slika 5). Poleg tega je analiza IFN-ELISPOT pokazala, da je bilo odkritih manj odzivov celic T proti regiji S1 pri miših C57BL/6 in BALB/c, imuniziranih s pSARS-S (S2 sl), kar podpira tudi Smithova študija [12]. Ti podatki so pokazali, da cepivo proti SARS morda ne bo zagotovilo popolnega zaščitnega učinka proti okužbi s SARS-CoV-2. Razvoj DNK cepiv je pomemben za hiter odziv na pandemsko okužbo s koronavirusom. Zato bi lahko uspeh cepiva DNK proti SARS-CoV-2 uporabili pri drugih pojavnih nalezljivih boleznih.

Različni konstrukti, uporabljeni v DNA cepivih SARS-SoV-2, so povzročili različne ravni titrov nevtralizirajočih protiteles. Vodilno zaporedje tPA je bilo uporabljeno za povečanje ekspresije in izločanja antigena v DNA cepivih [21, 33–35]. Vendar vodilna sekvenca tPA ni bistveno povečala titrov protiteles v tem poročilu. Za nadaljnje povečanje učinkovitosti cepiva bi lahko uporabili različne vodilne sekvence, ki bi nadomestile izvorno vodilno sekvenco koničastega proteina. Vodilno zaporedje IgE je bilo uporabljeno v cepivu INO-4800 DNA in cepivu proti MERS-CoV [5, 12]. Poleg tega lahko spremenjeno zaporedje proteinov konic poveča tudi imunogenost cepiva. Stabilizirani koničasti protein je bil zasnovan z mutacijo mesta furina in drugih regij, da se ustvari predfuzijska struktura (S-2P), ki lahko poveča izražanje koničastega proteina ~10-krat [36]. Idealno DNA cepivo bi moralo optimizirati konstrukt plazmidne DNA in sistem dostave, da se poveča raven izražanja beljakovin.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Živalski modeli so ključni za razvoj cepiva proti COVID{0}}. Za oceno učinkovitosti cepiv proti COVID-19 je bilo uporabljenih več živalskih modelov, vključno s primati [13, 37], humane transgene miši ACE2 [38] in sirijski hrčki [39]. ACE2 sirskega hrčka je zelo podoben človeškemu ACE2 in njegova vezavna afiniteta na protein S SARS-CoV-2 je bila predvidena višja kot pri mišjem ACE2 [40]. To je razlog, zakaj so bile kot izzivalni modeli SARS-CoV-2 uporabljene človeške transgene miši ACE2, ne pa miši divjega tipa. Študije prenosa SARS-CoV-2 so pokazale, da lahko virus učinkovito okuži naivne hrčke z neposrednim stikom ali prek aerosolov [41]. Intranazalna okužba s SARS-CoV-2 se lahko razmnoži in inducira patogenezo v pljučih sirskih hrčkov [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>5 % zmanjšanje od izhodišča), kar je bilo povezano z daljšim trajanjem bolezni [42]. Te ugotovitve kažejo, da je sirski hrček tudi primeren živalski model za oceno cepiv proti COVID{0}}. Na podlagi razpoložljivosti živalskih modelov smo izbrali hrčke kot izzivalni model SARS-CoV-2 za oceno učinkovitosti cepiva. Naši podatki so pokazali, da lahko imunizacija s pSARS2-S, ne pa tudi s ptRBD, inducira visoke titre protiteles proti Spike IgG in titre nevtralizirajočih protiteles (Sliki 6B in 6C). Skladno s tem so hrčki, imunizirani s pSARS2-S, ne pa tudi hrčki, imunizirani s ptRBD, ustvarili imunski odziv proti izzivu SARS-CoV-2. Opazili smo, da lahko imunizacija ptRBD povzroči visoke ravni titrov nevtralizirajočih protiteles pri miših, ne pa tudi pri hrčkih. Nasprotujoči si rezultati so morda zato, ker sam RBD ni stabilno izražen v hrčkih. Model hrčka je bil uporabljen tudi za oceno vektorskega cepiva proti COVID-19 adenovirusa serotipa 26 (Ad26). Enkratna imunizacija s cepivom na osnovi vektorja Ad26, ki izraža stabiliziran spike protein SARS-CoV-2, ki je izzvalo nevtralizirajoče odzive protiteles in zaščitilo pred okužbo s SARS-CoV-2, je povzročilo izgubo teže, delno umrljivost in replikacijo virusa v pljučih [39]. Ti rezultati so pokazali, da je model hrčka primeren za ocenjevanje učinkovitosti cepiv proti COVID-19.

Številna prizadevanja za razvoj cepiva proti SARS-CoV-2 temeljijo na raziskovalnih izkušnjah MERS-CoV in SARS-CoV. Po vsem svetu je bilo decembra 2020 za nujno uporabo odobrenih več cepiv proti COVID-19, vključno s cepivi proti COVID-19, ki temeljijo na RNA in vektorju adenovirusa. Razpravljali smo o prednostih in slabostih različnih platform cepiv [43]. Vektorska cepiva proti adenovirusom lahko izzovejo močnejše imunske odzive kot cepiva z DNA in mRNA, vendar je njihova učinkovitost cepiva lahko zmanjšana zaradi že obstoječe imunosti proti vektorjem Ad [44]. V primerjavi z DNA cepivom potrebuje mRNA cepivo ultra nizko temperaturo za shranjevanje in transport [45]. Zato bi lahko bilo cepivo DNK potencialna platforma za cepivo, zlasti med uporabo v nujnih primerih.

Naša študija kaže na možnost cepiva DNK za uporabo pri ljudeh. Nadaljnje študije bi lahko raziskale učinkovitost tega cepiva DNA, ki se daje z intradermalno (ID) injekcijo, ki je primernejša za klinično uporabo, ker je igla za intramuskularno injiciranje pri ljudeh globoka približno 18 mm in prizadene več tkiv kot intradermalno injiciranje z EP. Poleg tega je treba učinkovitost cepiva testirati na starih miših kot modelu za starejše ljudi, ker je ta populacija še posebej močno prizadeta, ko je okužena s SARS-CoV-2. Prejšnje študije so pokazale, da je odziv celic Th2 povezan z okrepljeno boleznijo dihal (VAERD) po cepljenju z inaktiviranimi virusnimi cepivi proti RSV [46], virus ošpic [47] in SARS-CoV [27, 48]. Nasprotno pa poročajo o manj resnih primerih SARS-CoV, ki so posledica indukcije odziva celic Th1 [49]. Zato močni Th1-pristranski imunski odzivi, ki jih povzroči cepivo DNK, kažejo, da stranski učinki verjetno ne bodo večja težava [50]. Poleg tega so se pojavili pomisleki glede cepiv, ki temeljijo na beljakovinah, zaradi uporabe aluminijeve soli ali adjuvansov tipa emulzije olje v vodi, ki povzročajo Th2-pristranske imunske odzive in povečujejo možne stranske učinke [51, 52]. Če povzamemo, cepivo COVID-19 DNK bo morda igralo pomembno vlogo pri obvladovanju pandemije COVID-19 v bližnji prihodnosti.

Reference

1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Gospodarske posledice izbruha COVID{0}}: Potreba po pripravljenosti na epidemijo. Front Public Health. 2020; 8: 241. pmid:325743072. Center za sistemsko znanost in inženiring (CSSE) [Internet]. Nadzorna plošča COVID-19. Univerza Johns Hopkins. [citirano 11. februar 2021]. Na voljo od:
2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, et al. Prispevki strukturnih proteinov koronavirusa hudega akutnega respiratornega sindroma k zaščitni imunosti. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid: 15210961
3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, et al. Cepivo DNK povzroči nevtralizacijo SARS koronavirusa in zaščitno imunost pri miših. Narava. 2004; 428 (6982): 561–4. pmid:15024391
4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Sintetično soglasno cepivo DNA proti spike proteinom inducira zaščitno imunost proti koronavirusu respiratornega sindroma Bližnjega vzhoda pri primatih razen človeka. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid: 26290414
5. 6. Krammer F. Cepiva proti SARS-CoV-2 v razvoju. Narava. 2020; 586 (7830): 516–27. pmid:32967006
6. 7. Khalaj-Hedayati A. Zaščitna imunost proti kandidatom za cepivo podenote SARS, ki temelji na beljakovini Spike: Lekcije za razvoj cepiva proti koronavirusu. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid:32695833
7. 8. Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z, et al. Humoralni in celični imunski odzivi, ki jih povzročajo cepiva 3a DNA proti hudemu akutnemu respiratornemu sindromu (SARS) ali SARS podobnemu koronavirusu pri miših. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16 (1): 73–7. pmid:18987164
8. 9. Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Izzivanje nevtralizirajočih protiteles s cepivi DNA, ki izražajo topne stabilizirane glikoproteinske trimere ovojnice virusa humane imunske pomanjkljivosti tipa 1, konjugirane na C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid:15078953
9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Optimizacija DNK cepiva proti SARS. DNA Cell Biol. 2007; 26 (10): 721–6. pmid:17665998
10. 11. Gary EN, Weiner DB. DNK cepiva: zdaj je najboljši čas. Curr Opin Immunol. 2020; 65: 21–7. pmid:32259744
11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J, et al. Imunogenost DNK kandidata za cepivo proti COVID-19. Nat Commun. 2020;11(1):2601. pmid:32433465
12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH, et al. Zaščita s cepivom DNA proti SARS-CoV-2 pri rezus makakih. Znanost. 2020; 369 (6505): 806–11. pmid:32434945
13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Metode dostave za povečanje celičnega vnosa in imunogenosti DNA cepiv. Cepivo. 2016; 34 (46): 5488–94. pmid: 27742218
14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M, et al. Hiter odziv na nastajajočo nalezljivo bolezen – izkušnje, pridobljene pri razvoju cepiva s sintetično DNK proti virusu Zika. Mikrobi okužijo. 2018; 20 (11–12): 676–84. pmid: 2955534516. Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C, et al. Prirojeni molekularni in celični podpis v koži pred dolgotrajnimi T-celičnimi odzivi po cepljenju z elektroporirano DNA. J Immunol. 2020; 204 (12): 3375–88. pmid:32385135
15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, et al. Nova prototipna naprava za dostavo DNK cepiva, izboljšanega z elektroporacijo, hkrati v kožo in mišice. Cepivo. 2011; 29 (39): 6771–80. pmid: 21199706
16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS, et al. Izboljšana imunogenost in zaščitna učinkovitost tetravalentnega cepiva proti dengi DNA z uporabo elektroporacije in intradermalne dostave. Cepivo. 2019; 37 (32): 4444–53. pmid:31279565
17. 19. Ramakrishnan MA. Določitev 50 % titra končne točke z uporabo preproste formule. Svet J Virol. 2016; 5 (2): 85–6. pmid: 27175354
18. 20. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al. Odkrivanje novega koronavirusa 2019 (2019-nCoV) z RT-PCR v realnem času. Euro Surveill. 2020. pmid: 31992387
19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q, et al. Signalno zaporedje tkivnega aktivatorja plazminogena (tPA) poveča imunogenost cepiva proti tuberkulozi na osnovi MVA. Immunol Lett. 2017; 190: 51–7. pmid: 28728855
20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y, et al. Fuzijski mehanizem 2019-nCoV in fuzijski inhibitorji, ki ciljajo na domeno HR1 v koničastem proteinu. Cell Mol Immunol. 2020; 17 (7): 765–7. pmid:32047258