Učinki flavonoidov na kožo glede na njihove strukturne značilnosti: pregled

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Ozadje: Med miokardnim infarktom (MI) se izgubi milijarde kardiomiocitov. Optimalna terapija mora učinkovito nadomestiti poškodovane kardiomiocite, po možnosti z matičnimi celicami, ki se lahko cepijo in diferencirajo v odrasle funkcionalne kardiomiocite. Kot take so primerne kandidatke matične celice srčnega atrijskega dodatka (CASC). Vendar pa lahko prisotnost povišanih ravni končnih produktov napredne glikacije (AGE) v srčnih regijah, kjer so CASC presajeni, vpliva na njihov regenerativni potencial. V tej študiji preučujemo, ali in kako AGE spremenijo lastnosti CASC in vitro. Metode in rezultati: CASC v kulturi so bili izpostavljeni različnim koncentracijam AGE (od 50 ug/mL do 400 ug/mL). Preživetje, proliferacija in migracijska sposobnost CASC so se znatno zmanjšali po 72 urah izpostavljenosti AGE. Apoptoza se je znatno povečala z naraščajočo koncentracijo AGE. Škodljive učinke teh AGEs je delno ublažila predhodna inkubacija z receptorjem za AGEs （RAGE） inhibitor （25 μM FPS-ZM1）, kar kaže na vpletenost RAGE v opažene negativne učinke. Zaključek: AGE imajo od časa in koncentracije odvisen negativen učinek na preživetje, proliferacijo, migracijo in apoptozo CASC in vitro, delno posredovano z aktivacijo RAGE. Ali so terapije proti AGE učinkovito zdravljenje v okviru zdravljenja z matičnimi celicami po MI, zahteva nadaljnjo preiskavo.

Ključne besede:stebelna celica; aldehid dehidrogenaza; CASC; glikirane beljakovine; končni izdelki za napredno glikacijo; širjenje; apoptoza; migracije; RAGE inhibicija

1. Uvod

Koronarna srčna bolezen (CHD) ostaja vodilni vzrok umrljivosti in obolevnosti po vsem svetu, pri čemer je miokardni infarkt (MI) najpogostejša oblika CHD [1]. MI je posledica popolne ali delne okluzije koronarne arterije. V ishemičnem območju so kisik in hranila omejeni, kar povzroči smrt miokardnih celic. Velikost infarkta je odvisna od številnih dejavnikov, kot so velikost ogroženega ishemičnega območja, lokacija in trajanje koronarne okluzije ter količina preostalega kolateralnega krvnega pretoka [1,2]. Ker imajo odrasli kardiomiociti minimalne regenerativne lastnosti, je intrinzično popravilo poškodovanega tkiva nedosegljivo. Iskanje terapevtskega pristopa, ki učinkovito nadomesti miokardno brazgotino s funkcionalnim kontraktilnim tkivom, je edina možnost za obnovitev izgubljenega srčnega tkiva.koliko cistanche vzetiVeliko raziskovalnega truda je bilo vloženega v razkritje terapevtskega potenciala in mehanizmov celične terapije s celicami kostnega mozga (BMC). Kostni mozeg vsebuje hematopoetske matične celice (HSC), endotelne matične celice (EPC) in mezenhimske matične celice (MSC) [3]. Klinična preskušanja z mononuklearnimi BMC in MSC niso prinesla znatnih izboljšav srčne funkcije po MI. Ker se mononuklearni BMC in MSC ne diferencirajo v kardiomiocite, se opažena omejena izboljšanja verjetno pripisujejo parakrinim mehanizmom [4,5]. Da bi znatno izboljšali delovanje srca po MI, se je fokus raziskav preusmeril na rezidenčne srčne matične celice (CSC), kot so c-kit plus, Sca-1 plus, Isl-1 plus celice in kardiosfere, ki so verjetno vnaprej programirani, da postanejo kardiomiociti. Kljub temu je njihov uspeh pri regeneraciji srca slab [6].

kliknite tukaj, če želite izvedeti več

V zadnjih letih je naša raziskovalna skupina odkrila novo vrsto srčnih matičnih celic, imenovanih "srčne atrijske matične celice" (CASC). V nasprotju z drugimi matičnimi celicami imajo CASC izredne lastnosti kardiomiogene diferenciacije, zaradi česar so obetavni kandidati za regeneracijo srca [4]. Izolacija te populacije matičnih celic iz atrijskih ušes temelji na visoki aktivnosti aldehid dehidrogenaze (ALDH). Visoka aktivnost ALDH je bila med drugim opisana tudi pri drugih tipih izvornih celic, kot so MSC, HSC ter nevralne in rakave matične celice[7-9]. Ker se je izkazalo, da ALDH deluje kardioprotektivno in spodbuja preživetje celic v stresnih razmerah, je lahko uporaba populacije matičnih celic ALDH in matičnih celic v ishemičnih stanjih v tem kontekstu koristna [4,10]. CASC je mogoče razširiti do klinično pomembnih številk, ne da bi pri tem izgubili temeljne značilnosti, kot so aktivnost ALDH, profil površinskega antigena in sposobnost kardiomiogene diferenciacije [11]. Ta podatek je ključnega pomena za prenos tega terapevtskega pristopa na kliniko. Poleg tega smo pokazali, da presaditev avtolognih CASC povzroči izboljšano delovanje levega prekata, kar je posledica ustreznega presadka matičnih celic in nadaljnje diferenciacije CASC [4, 12].

Pri bolnikih z MI so ravni končnih produktov napredovale glikacije (AGE) povečane. [13] AGE so beljakovine in/ali lipidi, ki so nepopravljivo poškodovani zaradi glikacije, procesa, pri katerem reducirajoči sladkorji reagirajo neencimsko z amino skupinami v lipidih ali beljakovinah. . Poleg glikacije vodi oksidativni stres tudi do nastajanja AGE z oksidacijo beljakovin in/ali lipidov [14]. AGE nastajajo endogeno in se naravno kopičijo v telesu s staranjem ali v patoloških situacijah, kot je MI, ko se ravni oksidativnega stresa povečajo [15-17].kaj je cistanchePoleg tega so prejšnje raziskave pokazale, da AGE vplivajo na različne vrste matičnih celic in vitro [18-20]. Zmogljivost proliferacije matičnih celic se zmanjša z AGE, stopnja apoptoze pa se poveča po aplikaciji AGE. Ti učinki se lahko izvajajo prek več mehanizmov, vključno z aktivacijo apoptotične poti, RAGE ali prekomerno tvorbo ROS [20]. Ali AGE vplivajo tudi na lastnosti CASC, ostaja neznano. Te ugotovitve postavljajo vprašanje, ali bi lahko AGE negativno vplivali na terapevtsko učinkovitost CASC, ki se uporabljajo za zdravljenje MI. Cilj te študije je torej preučiti in vitro učinke AGE in potencialno aktivacijo njegovega receptorja RAGE na proliferacijo, preživetje in migracijo CASCS.

2.Materiali in metode

2.1. Poskusi na živalih

Študije na živalih so bile izvedene v skladu z Direktivo EU 2010/63/EU za poskuse na živalih in jih je odobril lokalni etični odbor za poskuse na živalih (UHasselt, Belgija, Diepenbeek; ID 201919K). Vse živali so bile v okolju z nadzorovano temperaturo (21 stopinj, 60 odstotkov vlažnosti) z 12-urnim -12-urnim ciklom svetlo-tema. Hranili so jih s standardno dieto v peletih z vodo, ki je bila na voljo ad libitum. Skupno je bilo uporabljenih 62 samic podgan Sprague-Dawley (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Francija).

2.2. Izolacija in širjenje CASC podgan

CASC so bili pobrani iz desnega atrijskega dodatka, kot je opisano prej [4] Na kratko, podganam so injicirali heparin (1000 enot/kg, intraperitonealno (ip) in jih evtanazirali s prevelikim odmerkom natrijev pentobarbital (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgija, 200 mg/kg, ip). Srca so bila pobrana, perfundirana z normalno raztopino Tyrode (137 mMNaCl, 5,4 mMKCl, 0,5 mMMgClz, 1 mMCaClz, 11,8 mMNa-HEPES, 10 mMglu-case, 20 mM tavrin ,pH 7,4), in zbrani so bili desni atrijski dodatki. Ekstrahirano tkivo desnega atrijskega očesa je bilo zmleto na kose ~1 mm³, sprano s fosfatnim pufrom fiziološke raztopine (PBS) in encimsko disociirano 30 minut v Hankovi uravnoteženi raztopini soli. ki vsebuje 0,6 WU/mL kolagenaze NB 4 (Serva, Heidelberg, Nemčija) in 20 mM Carly.bioflavonoidiCelice ALDHt smo obarvali v skladu s kompletom Aldefluor (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgija). Celice ALDHt so bile definirane kot CASC in razvrščene po toku (BD FACS Aria) v mediju X-VIVO 15 (Lonza, Basel, Švica), dopolnjenem z 20 odstotki fetalnega telečjega seruma (FCS) in 2 odstotka penicilina/streptomicina (P/S). . Izolirane CASC so bile zasejane v 6-plošče z vdolbinicami z gostoto 60,000 celic na vdolbinico in inkubirane pri 37 stopinjah v vlažnem inkubatorju s 5-odstotno atmosfero CO2. Gojišče smo menjali vsake 2 do 3 dni. Ko so CASC dosegli 80-odstotno sotočje, so jih pobrali s tripsinom. Za vse poskuse so bili uporabljeni prehodi 1 CASC.

Cistanche lahko upočasni staranje

2.3. Priprava AGEs

AGE so bili pripravljeni, kot je opisano prej [21]. Na kratko, goveji serumski albumin (BSA; 7 mg/mL) smo inkubirali z dimeri glikolaldehida (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgija) v sterilnem PBS (pH 7,4) 5 dni pri 37 stopinjah. To raztopino smo dializirali proti PBS, dvakrat po 2 uri in čez noč pri 4 stopinjah, da smo odstranili nezreagirani glikolaldehid (mejna vrednost 3,4 kDa. AGE smo filtrirali (0,2 um filter, Sarstedt, Antwerpen, Belgija). BSA inkubirali v PBS (7 mg/mL). ) je bil uporabljen kot kontrolna raztopina.

2.4. Test širjenja in preživetja

Izvedeni so bili testi proliferacije in preživetja s testom propidijevega jodida (PI), kot so prej opisali Gervois et al. in Lo Monaco et al [22,23]. Na kratko, CASC so bile zasejane v 96-ploščo z vdolbinicami v gojišču X-VIVO z 10 odstotki FCS in 2 odstotkima P/S. Za teste proliferacije smo zasejali 5000 celic na jamico. Za teste preživetja je bilo zasejanih 100 celic na jamico. Po 24 urah smo mediju dodali pet različnih pogojev: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL in 400 ug/mL AGEs. Za merjenje proliferacije smo mediju X-VIVO dodali BSA ali AGE z 2 odstotkoma FCS in 2 odstotkoma P/S.kupi cistancheZa merjenje preživetja smo gojišču X-VIVO dodali BSA ali AGE z 0 odstotki FCS in 2 odstotka P/S. Po treh različnih časovnih točkah (24, 48 in 72 h) je bil medij nadomeščen z liznim pufrom A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Nemčija), čemur je sledila enaka količina stabilizacijskega pufra B (ChemoMetec), dopolnjenega s PI (10 ug/ mL, Sigma). Po 15-minutnem inkubacijskem obdobju v temi smo izmerili fluorescenco z bralnikom plošč Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Nemčija) pri vzbujanju 540 nm, valovni dolžini emisije 612 nm in povečanju 2000. Poskusi so bili izvedeni v trojniku. Podatki so bili normalizirani na podatke, pridobljene s 400 ug/mL BSA.

2.5. Preizkus migracije

CASC so bile posejane v {{0}}ploščo z vdolbinicami z gostoto 5000 celic na vdolbinico v gojišču X-VIVO z 10 odstotki FCS in 2 odstotkima P/S. Mediju smo dodali pet pogojev: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL in 400 ug/mL AGEs. Po inkubacijskem obdobju 72 ur smo kondicionirane CASC pobrali z uporabo tripsina in uporabili za preskus migracije čez vdolbino. V ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgija) s porozno membrano z velikostjo por 8 um je bilo 100.000 celic na stanje posejanih v medij X-VIVO z 0 odstotki FCS in 2 odstotki P/S. ThinCerts smo namestili na 24-plošče z vdolbinicami, ki so vsebovale medij X-VIVO z 2 odstotki FCS in 2 odstotki P/S. Po 24 urah migracije smo ThinCerts fiksirali s 4 odstotki paraformaldehida (PFA) za 15 minut in inkubirali z 0,1 % kristalno vijolične za 30 minut. Celice, ki niso migrirale, so bile odstranjene na zgornji strani ThinCerts, nakar je bila količina transmigriranih CASC kvantificirana s programsko opremo AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Zaventem, Belgija). Podatki so bili normalizirani na podatke, pridobljene s 400 ug/mL BSA.

2.6. Test apoptoze

CASC so bile zasejane v 96-ploščo z vdolbinicami z gostoto 10,00 celic na vdolbinico v gojišču X-VIVO z 2 odstotkoma FCS in 2 odstotkoma P/S. Za preučevanje apoptoze je bil opravljen test kaspaze z reagentom IncuCyte8 Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagent (razredčen 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Mediju smo dodali pet pogojev: 400 ug/mL BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL in 400 ug/mL AGEs. CASC, gojene v gojišču X-VIVO brez FCS in 2 odstotka P/ S so bili uporabljeni kot pozitivna kontrola. Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih. Slike so bile posnete po 24, 48 in 72 urah inkubacije z uporabo sistema za analizo celic IncuCyte@S3Live-Cell (Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Analiza območja, ki ga zasedajo apoptotične celice, je bila izvedena z uporabo IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgija). Podatki so bili normalizirani na pozitivno kontrolo (plus, medij X-VIVO brez FCS).

2.7 In vitro zaviranje RAGE

RAGE je bil zavrt, da bi ocenili prispevek aktivacije RAGE pri širjenju, preživetju in migraciji CASC. Na kratko, CASC so bile predhodno inkubirane pri 37 stopinjah v inkubatorju s 5 odstotki CO2 z antagonistom RAGE FPS-ZM1 (10 in 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgija). Po 2 urah predinkubacije smo dodali 400 ug/mL AGE.cistanche AvstralijaPo 24 48 in 72 urah sta bila proliferacija in preživetje ocenjena, kot je opisano zgoraj. Po 72 urah inkubacije so bili predhodno kondicionirani CASC pobrani in uporabljeni za preskus migracije čez vdolbino, kot je opisano zgoraj.

2.8. Statistika

Statistične analize so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism 9.0.0.cistanchNormalno porazdelitev podatkov smo ocenili s Shapiro-Wilkovim testom. Običajno porazdeljeni podatki so bili podvrženi enosmernemu testu ANOVA s ponovljenimi meritvami, ki mu je sledil Holm-Sidakov test večkratne primerjave. Kadar podatki niso bili normalno porazdeljeni, je bil uporabljen neparametrični Friedmanov test, ki mu je sledil Dunnov test večkratne primerjave. Vsi podatki so izraženi kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM). Vrednost p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultati

3.1. Izpostavljenost AGE negativno vpliva na širjenje in preživetje CASC

Kot je prikazano na sliki 1, so AGE sčasoma znatno in postopoma zmanjšali proliferacijo CASC. Negativen vpliv AGE na proliferacijo CASC je bil odvisen tudi od koncentracije. Po 72 urah so koncentracije 100 ug/mL, 200 ug/mL in 400 ug/mL AGE znatno zmanjšale proliferacijo CASC v primerjavi s BSA (slika 1C; 80 odstotkov ±7n100 ug/mL, 74 odstotkov ±3 v 200 ug/mL, in 65 odstotkov ±4 v 400 ug/mL AGEs). Sama uporaba BSA ni vplivala na proliferativno sposobnost CASC (slika S1 v dodatnem materialu). Kot je prikazano na sliki 2, so naraščajoče koncentracije AGE negativno vplivale na preživetje CASC v času. Pomembne učinke AGEs so opazili po 48 (slika 2B) in 72 urah (slika 2C; 85 odstotkov ±3 pri 100 ug/mL, 73 odstotkov ±3 pri 200 ug/ml in 64 odstotkov ±4 pri 400 ug/mL AGEs) Sama uporaba BSA ni vplivala na sposobnost preživetja CASC (slika S1).

3.2. Povečane koncentracije AGE povečajo apoptozo CASC

Da bi pojasnili učinek različnih koncentracij AGEs (50, 100, 20 in 400 ug/mL) na apoptozo CASC, je bil izveden test kaspaze. Odstotek celic, ki izražajo kaspazo 3/7, je bil izmerjen v različnih časovnih točkah: 24 (slika 3A), 48 (slika 3B) in 72 (slika 3C) h. Stopnja apoptoze se je sčasoma postopoma povečevala s povečanimi koncentracijami AGE (slika 3C, 72h; 77 odstotkov ±17 pri 400 ug/mL AGE v primerjavi z 18 odstotki ±3 pri BSA).

3.3. Izpostavljenost AGEs zmanjša migracijsko zmogljivost CASC

Zmogljivost migracije CASC je bila ovrednotena s testom migracije čez vdolbino po 72 urah inkubacije z različnimi koncentracijami AGE. Na sliki 4-E so predstavljeni reprezentativni primeri migracije CASC po inkubaciji s BSA in različnimi koncentracijami AGE (50, 100, 200 in 400 ug/mL). Kvantifikacija migracije je prikazana na sliki 4F. V primerjavi s telesno površino so opazili znatno zmanjšanje migracije, ko so CASC inkubirali s 400 ug/mL AGEs (slika 4E, F; 75 odstotkov ±5 v 400 ug/mL AGEs).

3.4. Škodljivi učinki AGE v CASC so posledica aktivacije RAGE

Da bi ocenili prispevek aktivacije RAGE pri opaženih škodljivih učinkih AGE, so ocenili proliferacijo, preživetje in migracijo CASC po inkubaciji z antagonistom RAGE FPS-ZM1. Pred izpostavitvijo 400 ug/mL AGE so CASC predhodno inkubirali 2 uri z 10 ali 25 uM FPS-ZM1. Uporaba samega FPS-ZMl (10 in 25 uM) ni vplivala na proliferativno sposobnost niti na preživetje CASC (slika S2). Proliferacijo CASC (slika 5A-C) so ocenili po 24 (A), 48 (B) in 72 (C) h. Kot je prikazano na sliki 1, je negativni vpliv AGE na proliferacijo CASC znatno zmanjšan po predinkubaciji s 25 uM FPS-ZM1 (slika 5A-C). Dejansko se je po 24 in 48 urah proliferacija CASC bistveno izboljšala z izpostavljenostjo 400 ug/mL AGEs (24h, slika 5A; 104 odstotkov 士8 v 25 μM FPS-ZM1 v primerjavi z 79 odstotki ±5 pri 400 ug/mL AGEs; 48h, slika 5B; 95 odstotkov ±5 v 25 μM FPS-ZM1 v primerjavi s 70 odstotki ±4 v 400 ug/mL AGEs）. Po 72 urah je bil opažen enak trend. Proliferacija se je ponavadi izboljšala, ko je bil RAGE zavrt (slika; 80 odstotkov ±8 v 25 μMFPS-ZM1 v primerjavi s 67 odstotki ±5 v 400 ug/mL AGEs, p=0.06). Preživetje (slika 6A-C) je bilo ocenjeno po 24 (A), 48 (B) in 72 (C) h. Negativni vpliv AGE na preživetje CASC (slika 2) se znatno izboljša po predinkubaciji s 25 uM FPS-ZM1 (slika 6A-C). Po 24 urah se preživetje bistveno izboljša (slika 6A; 104 odstotkov ±7 v 25 μM FPS- ZM1 v primerjavi z 91 odstotki ±4 pri 400 ug/mL AGEs）. Ta trend je bil opažen tudi po 48 urah (slika 6B; 91 odstotkov ±5 pri 25 μM FPS-ZM1 v primerjavi z 81 odstotki ±5 pri 400 ug/ml AGEs, p =0.07). Reprezentativni primeri migracije CASC po 72 urah inkubacije s 400 ug/mL AGE in FPS-ZMl so predstavljeni na sliki in kvantificirani na sliki. Predinkubacija CASC s 25 uM FPS-ZMI bi lahko preprečila zmanjšano sposobnost migracije CASC, opaženo pri izpostavljenosti AGE ( Slika 7B; 98 odstotkov ±6 v 25 uM FPS-ZM1 v primerjavi s 7 odstotki ±8 v 400 ug/mL AGEs, p=0.07).

4. Razprava

Naša študija je prva, ki je pokazala, da AGE vplivajo na lastnosti CASC, in sicer na preživetje, proliferacijo, migracijo in apoptozo in vitro. Naši podatki kažejo, da so ti učinki delno posredovani z aktivacijo RAGE na način, ki je odvisen od odmerka.

4.1. Vloga AGE pri MI

Ravni krvnih obtočil AGEs so pri bolnikih z akutnim miokardnim infarktom bistveno povišane [24, 25] Vendar ostaja nejasno, kako so vključeni v patofiziologijo miokardnega infarkta. Reaktivne kisikove spojine (ROS) so glavni dejavniki, ki sodelujejo pri sintezi AGE. Oksidativni stres lahko povzroči nastanek reaktivnih karbonilnih spojin in glikoksidacijo Amadori produktov v Maillardovi reakciji. Kot taki se AGE nepovratno tvorijo in kopičijo v srcu po MI in domnevajo, da potencialno še poslabšajo neugoden srčni fenotip [26, 27]. Poleg tega nevtrofilci in aktivirani makrofagi, vključeni v vnetni proces pri MI, pomembno prispevajo k sintezi AGE [28, 29]. Te imunske celice izločajo AGE in so opisane kot ključni induktorji nastajanja AGE pri MI. 4.2. Fiziološki pomen koncentracij AGEs

V naši študiji smo testirali širok razpon koncentracij AGEs (50 do 400 ug/mL). Koncentracija AGEs, uporabljena v drugih študijah in vitro, ki preučujejo učinek AGEs na izvorne celice, sega od 15 do 500 ug/mL 【20】. Obstaja velika variabilnost uporabljenih koncentracij, vendar višje ravni AGE na splošno odražajo fiziološke ravni v plazmi, ki jih najdemo pri bolnikih z več boleznimi. Dokazano je, da se koncentracija AGEs-albumina pri bolnikih s sladkorno boleznijo giblje od 50 do 400 ug/mL [30]. Pri bolnikih s srčno-žilnimi boleznimi lahko ravni AGE narastejo do koncentracije do 200 ug/mL [31,32]. Pri bolnikih z zgodnjo fazo Alzheimerjeve bolezni poročajo tudi o nižjih koncentracijah AGE v nanometrskem območju [33]. Vendar pa zaradi različnih analitičnih metod, ki se uporabljajo za merjenje AGE, in heterogenosti različnih vrst AGE ostaja ocena zanesljivih koncentracij AGE in vivo tehnično zahtevna in verjetno podcenjena [34].

4.3. AGE imajo negativen vpliv na lastnosti CASC

Tudi če presaditev CASC kaže obetaven potencial za regeneracijo srca po MI, preživetje in regenerativna sposobnost celic ostajata problem. Znano je, da so ishemična območja sovražno okolje s povečanimi ravnmi oksidativnega stresa, vnetja in fibroze v kombinaciji s povečanimi ravnmi AGE v tkivih. Ni znano, ali bi AGE vplivali na regenerativno sposobnost CASC, vendar bi lahko bilo pomembno znanje v kontekstu regeneracije srca in obetavnih regenerativnih zmogljivosti CASC [12]. V naši študiji smo pokazali, da AGE poslabšajo preživetje, proliferacijo in migracijo CASC in vitro, na način, ki je odvisen od koncentracije in časa. Poleg tega izpostavljenost AGE vodi do postopnega povečanja apoptoze CASC. Naši podatki so v skladu s študijami, ki preučujejo učinek AGE na več vrst drugih matičnih celic, pri katerih je proliferativna sposobnost spremenjena in apoptoza povečana [20]. Dejansko so Zhu et al. dokazali znatno zmanjšanje proliferacije EPC po izpostavljenosti različnim koncentracijam AGE [16]. Enak učinek so ovrednotili Sun et al. tudi pri EPC, kjer je povečanje stopnje apoptoze posredovalo aktivacijo poti p38 MAPK [35]. NSC, izpostavljeni AGE, so povzročili od odmerka odvisno zmanjšanje proliferacije matičnih celic, posredovano preko poti PPARy [36]. V matičnih celicah, pridobljenih iz maščobnega tkiva (ADSC), povečanje aktivacije kaspaze 3 povzroči povečano stopnjo apoptoze [37]. Yang et al. poročali o manjši proliferacijski in migracijski zmogljivosti v MSC, na način, ki je odvisen od koncentracije AGE. Ta učinek je bil posredovan s prekomerno proizvodnjo ROS[18]. Ali so škodljivi učinki na CASC, zelo različno populacijo matičnih celic srčnega izvora, posredovani tudi s prekomerno proizvodnjo ROS, je treba še ugotoviti.

Dokazano je, da so osnovni mehanizmi, v katerih AGE izvajajo svoje negativne učinke na delovanje organov, odvisni in/ali neodvisni od aktivacije receptorja RAGE [15]. Študije na številnih tipih matičnih celic kažejo, da AGE posredujejo svoje učinke predvsem z aktivacijo RAGE ali drugih apoptotičnih poti [20]. Aktivacija RAGE z AGE povzroči aktivacijo MAPK, kar vodi do fosforilacije JNK in p38] Ti fosforilirani proteini povečajo transkripcijo različnih pro-apoptotičnih transkripcijskih faktorjev v jedru, kar povzroči povečanje apoptoze. Poleg tega se lahko aktivirajo poti kaspaze, kar povzroči apoptozo, ki jo povzroči AGEs [39]. Nadaljnje študije so še vedno potrebne za razkritje molekularnih mehanizmov, s katerimi se v CASC inducirajo nadaljnji učinki AGE. Vendar smo pokazali, da so bili po blokiranju RAGE s FPS-ZM1 opazovani učinki AGE na CASC oslabljeni. Zato naši podatki močno kažejo, da AGE posredujejo svoje učinke na CASC verjetno z vezavo in aktivacijo RAGE. Ali gre za Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, prekomerno proizvodnjo ROS ali druge signalne poti, je treba še dodatno ugotoviti. Naši podatki so tudi v skladu z delom, ki so ga opisali Zhang et al., kjer je FPS-ZMl prav tako obrnil negativne učinke AGE v ADSC z blokiranjem RAGE, kar dodatno potrjuje pomembno vlogo aktivacije RAGE kot posrednika škodljivih učinkov, ki jih povzroča STAROSTI [40].

4.4. Prihodnje perspektive za anti-AGEs terapije za srčno-žilne bolezni in trenutne omejitve

Potrditev in vivo o uporabi terapij proti AGEs in njihovi potencialni dodani vrednosti presaditvi matičnih celic po MI je treba potrditi na živalskem modelu, preden se to lahko prenese na kliniko. V več študijah in vitro je bilo dokazano, da lahko zaviralec PPARy rosiglitazon [41, 42], zaviralci MAPK [18, 35, 43] ali antioksidanti [4] oslabijo učinke, ki jih posredujejo AGEs, na izvorne celice. Vendar njihov vpliv in vivo kot terapevtski poseg v kombinaciji s presaditvijo matičnih celic še nikoli ni bil obravnavan. Obstaja več strategij za znižanje ravni AGE v telesu. Piridoksamin (PM) je zaviralec nastajanja AGEs z zmanjšanjem pretvorbe Amadori v AGEs in odstranjevanjem karbonilnih spojin. Učinkovitost in varnost zdravljenja s PM je bila dokazana v kliničnih preskušanjih s sladkornimi bolniki [45]. Vendar je bilo klinično preskušanje zdravila NephroGenex leta 2014, v katerem so testirali piridorin[(tj. PM) kot antidiabetično terapijo, ustavljeno zaradi finančnih težav [46]. Nobena druga klinična preskušanja trenutno ne raziskujejo PM kot terapije. Vendar bi lahko zaviranje nastajanja AGE s PM predstavljalo strategijo za izboljšanje potenciala matičnih celic za namene regeneracije srca. Poleg tega bi lahko druge zaviralce tvorbe AGE, kot je aminogvanidin, v prihodnosti uporabili za znižanje ravni AGE po MI. Klinično preskušanje ACTION II je pokazalo učinkovitost aminogvanidina pri bolnikih s sladkorno boleznijo. Medtem ko aminogvanidin ni uspel bistveno zmanjšati primarne končne točke podvojitve časa za doseganje najvišje ravni kreatinina v serumu pri teh bolnikih, so bili prikazani drugi klinično pomembni učinki na zaplete sladkorne bolezni, kot je zmanjšanje proteinurije in koncentracij lipidov v obtoku. Vendar pa je bilo to preskušanje prekinjeno zaradi reverzibilnih neželenih učinkov, kot je indukcija avtoprotiteles, gripi podobnih simptomov in anemije, prevod v kliniko pa ostaja omejen [47, 48]. Poleg tega bi lahko uporaba antioksidantov, kot sta N-acetil-L-cistein (NAC) ali glutation, kot dodatek k naši prehrani zagotovila nekatere ugodne rezultate pri zdravljenju z matičnimi celicami, saj povečajo genomsko stabilnost, izboljšajo adhezijo in spodbujajo proliferacijo matičnih celic. 49]. Vendar pa se celično specifična dejanja med vrstami matičnih celic razlikujejo in potrebna so klinična preskušanja glede na odmerek in odziv, da se oceni njihova terapevtska učinkovitost pri uporabi v kombinaciji s presaditvijo matičnih celic. Druga možnost je razgradnja AGE s terapijo z ALT-71. ALT-711 je sposoben cepiti vezi ogljik-ogljik med karbonili, s čimer prekine navzkrižne povezave v molekulah AGE. Vendar več kliničnih preskušanj ni moglo potrditi koristnih učinkov ALT-711, opaženih v študijah na živalih. Poleg tega lahko zaviralci RAGE (kot je FPS-ZM1) ali zaviralci spodnjih molekul na poti RAGE motijo ​​celično signalno os AGEs/RAGE in tako blokirajo učinke, ki jih posredujejo AGE, v izvornih celicah. Učinkovitost različnih vrst majhnih molekul in inhibitorjev za blokiranje AGE v matičnih celicah je bila dokazana v številnih poskusih in vitro [18,35,44], vendar še nikoli prej ni bila preizkušena na živalskih modelih. Zato lahko samo domnevamo, da so ti inhibitorji učinkoviti pri blokiranju AGE v situaciji in vivo, vendar so potrebni poskusi dokaznega koncepta. Nazadnje, druga možnost za blokiranje AGEs v kombinaciji s terapijo z matičnimi celicami je gensko spreminjanje samih matičnih celic. Znano je, da čezmerna ekspresija sRAGE poveča odstranjevanje AGE (in drugih ligandov RAGE, kot je amiloid-), da izboljša učinkovitost celične terapije. To se je pokazalo pri MSC, ki izločajo sRAGE, kot terapiji za Alzheimerjevo bolezen [50,51], artritis [52] in Parkinsonovo bolezen [53]. MSC, ki izločajo sRAGE, so preživeli dlje, imeli so povečano migracijsko sposobnost, bili so bolje zaščiteni pred apoptozo in imeli protivnetne lastnosti. Tudi znižanje regulacije RAGE, s čimer se matične celice desenzibilizirajo za AGE, bi lahko bila možnost za izboljšanje funkcionalnosti celic. Ali bi te strategije lahko bile uporabne tudi pri MI in popravilu srca, je treba še raziskati. Če povzamem, vse te strategije so usmerjene v boj proti AGEs za izboljšanje delovanja in zadrževanja matičnih celic. Vendar te terapevtske možnosti ostajajo hipotetične in jih je treba raziskati in vivo v kombinaciji s terapijo CASC, preden jih je mogoče prenesti v klinično okolje. 5. Sklepi

Ugotovili smo, da imajo AGE od časa in koncentracije odvisen postopen učinek na lastnosti CASC s povečanjem apoptoze in zmanjšanjem preživetja, proliferacije in migracije in vitro. Delovne mehanizme za temi učinki je treba še dodatno raziskati, čeprav smo pokazali, da aktivacija RAGE pomembno prispeva k tem negativnim učinkom, povezanim z AGE. Ali bi ciljanje na AGE in vivo lahko izboljšalo terapevtsko zmogljivost CASC po MI, je treba še dodatno raziskati.

Ta članek je izvleček iz J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm