Estrogena aktivnost glikozidov iz Cistanche Deserticola kot adjuvansa za estrogenske receptorje in vitro

UVOD

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" v kitajščini), tradicionalno kitajsko zeliščno zdravilo, ki je bilo prvič zabeleženo vShenNongBenCaoJing, se že tisočletja uporablja za zdravljenje odpovedi ledvic, impotence, senilnega zaprtja in pomanjkanja krvi.[1] Razširjen je predvsem v puščavskih regijah severozahodne Kitajske, kot sta Gansu in Xinjiang.[2]Sodobne farmakološke raziskave so pokazale, da lahko C. deserticola izboljša široke medicinske funkcije, kot so uravnavanje hormonov, imunomodulatorno, antioksidativno, nevroprotektivno, protivnetno inestrogensko delovanje.[3,4] Glikozidi Cistanches(GC) so veljali za eno glavnih učinkovin z različnimi biološkimi učinki.

Estrogenski receptorji‑ (ERs‑ ) in ER so podvrste ER, ki lahko uravnavajo fiziološke funkcije.[7] Ti proteini bi lahko regulirali transkripcijo ciljnih genov z vezavo na povezana DNA regulatorna zaporedja v celičnem jedru. Oba podtipa sta izrazito izražena v kardiovaskularnem in centralnem živčnem sistemu [8,9] ER obstaja predvsem v mlečni žlezi, maternici, jajčnikih, kosteh, moških reproduktivnih organih in prostati. ER je prisoten predvsem v prostati, jajčnikih in mehurju.[10,11] Poleg tega obstaja nekaj skupnih fizioloških vlog obeh podtipov, na primer pri razvoju in delovanju jajčnikov ter zaščiti srčno-žilnega sistema.[ 12,13] Prejšnje raziskave v naši skupini so z metodo metabolomične analize razkrile estrogenom podoben mehanizem GC.[14] V kontinuirani študiji smo analizirali mehanizem estrogene aktivnosti GC na celičnih linijah MCF-7, povezanih z ER.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJEESTROGENA DEJAVNOSTPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIALI IN METODE

instrumenti

Inkubator ECO‑170P‑230 je bil od New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., čitalnik mikroplošč Bio‑Rad 680 in aparat za elektroforezo je bil od Bio‑Rad Laboratories, Inc., mikroskop CX21 je bil od Olympus Co., Ltd., Sistem za gelsko slikanje GIS‑2019 je bil od Tanon Science and Technology Co., Ltd., plošča z ravnim dnom je bila od Corning Inc., pretočna citometrija EPICS-XL od Beckman-Coulter Inc., StepOnePlus Real-Time polimerazna verižna reakcija ( PCR) je bil od Thermo Fisher Scientific.

Kemikalije in reagenti

GC smo pripravili v našem laboratoriju kot metodo, o kateri smo predhodno poročali [14], čistost GC pa smo z ultravijolično spektrofotometrijo določili na 52 % (akteozid je bil uporabljen kot marker za določanje GC). Estradiol (E2) je bil kupljen pri Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Šanghaj, Kitajska). Fetalni goveji serum (FBS) in RPMI‑1640 sta bila podjetja Gibco Co., Ltd., plošča s 96 vdolbinicami z ravnim dnom je bila podjetja Corning Inc., dimetil sulfoksid (DMSO) in 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil ]-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) smo kupili pri Sigma-Aldrich Corporation. Reagent TRIzol, komplet za reverzno transkripcijo (RT) in komplet TB Green™ RT‑PCR so bili kupljeni pri TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Kitajska. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb in ‑aktinska protitelesa so bila kupljena pri Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Vse druge običajne kemikalije so bile kupljene pri standardnih komercialnih dobaviteljih.

Priprava vzorca

Priprava osnovne raztopine glikozidov Cistanches

GC ekstrakt smo raztopili v DMSO, da smo naredili osnovno raztopino s koncentracijo 0.1051 g/ml in shranili pri 4 stopinjah. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega je bil uporabljen za redčenje osnovne raztopine na različne koncentracije pred uporabo.

Priprava osnovne raztopine estradiola

Ekstrakt E2 smo raztopili v DMSO, da smo naredili osnovno raztopino s koncentracijo 0.27 mg/ml in shranili pri 4 stopinjah. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega je bil uporabljen za redčenje osnovne raztopine na različne koncentracije pred uporabo.

Priprava fetalnega govejega seruma, obdelanega z ogljem in dekstranom

Sto mililitrov FBS smo zmešali z 250 mg aktivnega oglja v prahu in 25 mg dekstrana. Po 45-minutni inkubaciji pri 55 stopinjah smo mešanico 15 minut centrifugirali pri 4 stopinjah, 1000 rpm. Supernatant smo filtrirali z uporabo membrane Millipore Express PES, da smo dobili FBS, obdelan z dekstranom (CDT), in shranili pri –20 stopinjah.

Kultura celic

Celične linije človeškega raka dojke MCF-7 so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC). Poleg tega so celice gojili z medijem RPMI‑1640, ki je vseboval 10 % FBS in 1 % penicilin-streptomicin pri 37 stopinjah pod vlažno atmosfero s 5 % CO2. Celice so gojili v mediju RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega, ki je vseboval 5 % CDT-FBS 4 dni pred testom MTT, da se je lahko estrogen v celicah očistil.

Analiza celične proliferacije estradiola na celičnih linijah MCF-7

Proliferacijo celic smo izmerili s testom MTT za celice MCF-7.[15,16] E2 smo raztopili v gojišču RPMI-1640, ki je vsebovalo 0.1 % DMSO pri končni koncentraciji {{27 }}.1, 1, 10, 100 in 1000 nM. Celične linije MCF-7 so gojili v mediju RPMI-1640 brez fenolnega rdečega 4 dni. Po trikratnem izpiranju s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) smo dodali 100 µL medija RPMI-1640 brez FBS v plošče s 96 vdolbinicami pri 1,5 × 104 na vdolbinico in inkubirali pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice 72 ur obdelali z različnimi koncentracijami raztopine E2. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL). Celice smo inkubirali 4 ure. Nazadnje smo dodali 150 µL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm z čitalcem mikroplošč in izračunali stopnjo proliferacije (PR).

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza celične proliferacije glikozidov Cistanches na celičnih linijah MCF-7

Proliferacijo celic smo izmerili s testom MTT za celice MCF-7. GC so bili raztopljeni v gojišču RPMI‑1640, ki je vsebovalo 0.1 % DMSO pri končnih koncentracijah 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 in 175 µg /ml. Celične linije MCF-7 so 4 dni gojili v mediju RPMI-1640 brez fenol rdečega, ki je vseboval 5 % CDT-FBS. Po trikratnem izpiranju s PBS smo 100 µL medija RPMI-1640 brez FBS dodali v plošče s 96 vdolbinicami pri 1,5 × 104 na vdolbinico in inkubirali pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami raztopine GCs 24, 48 oziroma 72 ur. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL). Celice smo inkubirali 4 ure. Nazadnje smo dodali 150 µL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Absorpcijo smo izmerili pri 570 nm z čitalcem mikroplošč in izračunali PR. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega in medij, ki je vseboval E2 (2,725 × 10-3 µg/ml), sta bili negativna oziroma pozitivna skupina.

Analiza celične proliferacije glikozidov Cistanches s fulvestrantom na celičnih linijah MCF-7

Proliferacijo celic smo izmerili s testom MTT za celice MCF-7. GC smo raztopili v gojišču RPMI‑1640, ki je vsebovalo 0.1 % DMSO pri končnih koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/ml. Celične linije MCF-7 so 4 dni gojili v mediju RPMI-1640 brez fenol rdečega, ki je vseboval 5 % CDT-FBS. Po trikratnem izpiranju s PBS smo 100 µL medija RPMI-1640 brez FBS dodali v plošče s 96 vdolbinicami pri 1,5 × 104 na vdolbinico in inkubirali pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami raztopine GCs in inkubirali s fulvestrantom (6, 06 × 10-5 µg / ml) 48 ur. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL raztopine MTT (0,5 mg/mL). Celice smo inkubirali 4 ure. Nazadnje smo dodali 150 µL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Absorpcijo smo izmerili pri 570 nm z čitalcem mikroplošč in izračunali PR. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega in medij, ki je vseboval E2 (2,725 × 10-3 µg/ml), sta bili negativna oziroma pozitivna skupina.

Test celičnega cikla

GC smo raztopili v gojišču RPMI‑1640, ki je vsebovalo 0.1 % DMSO pri končnih koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/ml. MCF-7-celične linije so 4 dni gojili v mediju RPMI-1640 brez fenolnega rdečega, ki je vseboval 5 % CDT-FBS. Po trikratnem izpiranju s PBS je bil dodan 1 ml medija RPMI-1640 brez FBS v plošče s 6 vdolbinicami pri 2,5 × 105 na vdolbinico in inkubiran pri 37 stopinjah 24 ur. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami raztopine GCs in inkubirali s fulvestrantom (6, 06 × 10-5 µg / ml) 48 ur. Nato smo celice zbrali in trikrat sprali s PBS, centrifugirali pri 4 stopinjah, 1000 rpm 10 minut in fiksirali s 70% etanolom pri -20 stopinjah čez noč. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo celice obarvali z raztopino PI (50 mg/mL), ki je vsebovala 1 mg/mL RNaze A in 0,1 % Triton X-100 30 minut v temi pri 4 stopinjah. Celični cikel smo odkrili s pretočno citometrijo in indeks proliferacije (PI) izračunali na naslednji način. RPMI‑1640 brez fenolnega rdečega in medij, ki je vseboval E2 (2,725 × 10-3 µg/ml), sta bili negativna oziroma pozitivna skupina.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100 %

Izolacija RNA in kvantitativna analiza verižne reakcije s polimerazo v realnem času

Za merjenje ravni mRNA je bil uporabljen RT-kvantitativni test PCR (qPCR). Celotno celično RNA smo ekstrahirali z reagentom TRIzol. Za qPCR je bila RNA obratno prepisana v cDNA iz 4 µg celotne RNA z uporabo kompleta RT. Analize RT-PCR so bile izvedene z uporabo kompleta TB Green™ RT-PCR. Vsi protokoli so bili izvedeni po navodilih proizvajalca. Par primerjev, uporabljen za pomnoževanje ER, je bil 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (naprej) in 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (nazaj); par primerjev, uporabljen za pomnoževanje ER, je bil 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (naprej) in 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (nazaj). Pogoji PCR za ER in ER so bili 94 stopinj za 3 minute, čemur je sledilo 37 oziroma 40 ciklov, in sicer 94 stopinj za 30 s, 58 stopinj za 2 minuti in 72 stopinj za 2 minuti. Par primerjev, uporabljen za pomnoževanje GAPDH, je bil 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (naprej) in 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (nazaj). Pogoji PCR za GAPDH so bili 94 stopinj 3 minute, čemur je sledilo 30 ciklov 94 stopinj 30 s, 58 stopinj 2 minuti in 72 stopinj 2 minuti. Vsakič, ko je bil poskus RT‑qPCR ponovljen več kot dvakrat. Za to je bil GAPDH uporabljen kot notranji nadzor. Izračunana je bila relativna genska ekspresija ER /ER transfektantov okoli kontrolnih celic: 2-(∆∆Ct).

Western blotting

Ekspresija ER in ER proteinov je bila odkrita z Western blot analizo kot prijavljena metoda z manjšimi modifikacijami. Na kratko, celice MCF-7 smo gojili v ploščah s 6 vdolbinicami pri 2,5 × 105 celic na vdolbinico in obdelali z GC pri končni koncentraciji 1,75, 17,5 oziroma 175 µg/ml 48 ur. Po inkubaciji so bili ekstrakti celih celic pripravljeni z uporabo pufra RIPA, ki je vseboval 1 mM PMSF. Beljakovine v ekstraktih celih celic so bile ločene z elektroforezo v 12-odstotnem natrijevem dodecil sulfatu-poliakrilamidnem gelu in nato prenesene na poliviniliden difluoridne membrane. Membrana je bila blokirana s 5 % (m/v) posnetim mlekom, raztopljenim v pufru TBST, in inkubirana s primarnimi in sekundarnimi protitelesi po vrsti. Opazili so vezana protitelesa.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJEESTROGENA DEJAVNOSTPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Statistična analiza

Rezultati so bili izraženi kot srednje vrednosti in standardni odkloni, statistična značilnost pa je bila izvedena z uporabo Studentovega t-testa s programsko opremo SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. Amerika). p<0.05 was considered statistically significant. 

REZULTATI

Po 24 urah zdravljenja z E2 se je proliferacija celic MCF-7 povečala [slika 1a]. 10 nM raztopine E2 bi lahko očitno spodbudilo rast celic (123,89 %). S povečanjem koncentracije E2 pa je sposobnost celične proliferacije oslabela. Zato je bila 10 nM optimalna koncentracija E2 v tem poskusu. Skupina GC pri koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/mg je lahko povečala proliferacijo celičnih linij MCF-7 na način, ki je odvisen od časa in odmerka, in je pokazala pomembno razliko z negativno skupino [slika 1b]. V primerjavi z negativno skupino je skupina E2 pokazala očitno proliferacijo (120,06 %). Skupina kombiniranih zdravil (CMG) (fulvestrant z E2 ali GC) v mediju CDT-FBS je bila inkubirana s celicami MCF-4. Po 72 urah

inkubacije lahko CMG povzroči naklon PR v primerjavi s posamezno skupino zdravil (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

ZAKLJUČEK

V tej raziskavi je bil učinek GC na proliferacijo in celični cikel MCF-7 testiran z metodo MTT oziroma s pretočno citometrijo.GC bi lahko povečali proliferacijo celic MCF-7pri koncentracijah 1,75, 17,5 in 175 µg/ml po 72-urni inkubaciji. Vendar se povečanje običajno upočasni, če se CC in fulvestrant uporabljajo skupaj. GC lahko povečajo vrednost PI celic MCF-7, zmanjšajo celice faze G1 in povečajo celice faz S in G2.

Fulvestrant je antagonist, specifičen za ER, ki blokira jedrno lokalizacijo ER tako, da zmanjša dimerizacijo receptorjev in od energije odvisen jedrski transport.[17] V tej raziskavi je sklep potrdil, da lahko fulvestrant oslabi proliferacijo GC na celicah MCF‑7 in lahko vpliva na transformacijo celičnega cikla. Zato je ta študija pokazala estrogensko aktivnost GC, prav tako pa je ER

cilj GC-jev. V poskusu RT-PCR in Western blot ekspresije mRNA in beljakovin ER in ER v celicah MCF-7 so se povečale s povečanjem koncentracije GC. torejGC lahko igrajo vlogo pri estrogenski aktivnostiglede na upregulirano mRNA in proteine ​​ER in ER .

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJEESTROGENA DEJAVNOSTPHGS75% ECH 30% ACT 12%