Sinergistične kombinacije zdravil na osnovi zdravila In Silico iz zeliščnih zdravil: primer uporabe Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Modul nevroprotekcije

Nevroprotekcija so mehanizmi in strategije, ki se uporabljajo za zaščito pred nevronskimi poškodbami ali degeneracijo v CŽS po akutnih motnjah (npr. kap ali poškodba/travma živčnega sistema) ali kot posledica kroničnih nevrodegenerativnih bolezni (npr. Parkinsonova bolezen, Alzheimerjeva bolezen, multipla skleroza). Cilj nevroprotekcije je omejiti nevronsko disfunkcijo/smrt po poškodbi osrednjega živčevja in poskušati ohraniti najvišjo

možna celovitost celičnih interakcij v možganih, ki povzročijo nemoteno delovanje živčevja. Kot je razvidno iz slike 4, so nekatere tarče na poti serotonergične sinapse vključene v funkcijo nevroprotekcije. Na primer, proizvodnja prostaglandinov prek PTGS1 in PTGS2 (znanih tudi kot COX-1 in COX-2) je bistven posrednik pri spodbujanju protivnetnih in novih mehanizmov za razrešitev56. Nedavna študija je pokazala, da se genska ekspresija ADCY5, encima, ki katalizira nastajanje cAMP57, zmanjša z metilacijo promotorja v COX-2-induciranih človeških celičnih linijah HCC58. Na podlagi zgornje analize domnevamo, da lahko kopičenje COX-2 vpliva na izločanje sAPP, cepitev APP, ki jo cepi -sekretaza, ki jo modulira cAMP in nadalje izvaja nevroprotektivni učinek59,60. Naši rezultati kažejo, da ima nevroprotekcija pomembno vlogo pri zdravljenju nevrovnetja.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPREČEVANJE PARKINSONOVE BOLEZNI FUNKCIJA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentalna validacija

Sposobnost preživetja celic mikroglije BV2, obdelanih s spojinami

Celice mikroglije BV2 (8×104 celic/ml) se hranijo s koncentracijami od 37,5 do 300 μM na mililiter gojišča brez seruma štirih spojin 24 ur. Viabilnost celic kontrolne skupine, gojene v odsotnosti seruma z manj kot 0,1 % DMSO, smatramo za 100 % (slika 5 (a-d)). Pri predpisanih odmerkih skupin niso opazili pomembne celične citotoksičnosti.

Validacija sinergije zdravil in potencialnega protivnetnega učinka in vitro

Za nadaljnjo oceno dobljenih rezultatov in silico so bile izbrane štiri spojine, ki pokrivajo tri sinergistične pare, in sicer izoakteozid, 2'-acetilakteozid, ehinakozid in verbaskozid, da bi preučili njihove sinergistične učinke zdravil in potencialni protivnetni učinek z uporabo celic BV2, zdravljenih z LPS. Zlasti izvajamo Western blot analizo za ekspresijo beljakovin iNOS in COX-2, da potrdimo sinergijo in protivnetne učinke predvidenih kombinacij zdravil.

Kot je prikazano na sliki 5(e–g), so navedene ravni proteinov iNOS in COX-2 v skupini testiranih celičnih linij BV2. Opažamo, da se je pri zdravljenju z izoakteozidom ali 2′-acetilakteozidom izražanje beljakovin iNOS in COX-2 v celicah BV2 znatno zmanjšalo pri različnih ravneh odmerka. Vendar pa zdravljenje s kombinacijo izoakteozida in 2'-acetilakteozida povzroči znatno povečanje vnetnih dejavnikov iNOS in COX-2 (slika 5(e)). Slika 5(f) to prikazujezdravljenje z ehinakozidom ali verbaskozidom, kot samostojno sredstvo, povzroči zmanjšanje izražanja iNOS in COX-2. Poleg tega je po pričakovanjih zdravljenje z ehinakozidom v kombinaciji z verbaskozidom v koncentraciji 150 µM povzročilo izrazitejše zmanjšanje

ravni izražanja beljakovin (iNOS in COX-2), kar kaže na sinergistične protivnetne učinke te kombinacije zdravil. Podobno, kot je prikazano na sliki 5(g), kombinacija ehinakozida in 2'-acetilakteozida kaže pomemben sinergistični učinek na inhibicijo COX-2 pri koncentraciji 75 μM ali 300 μM. Vendar pa za iNOS pri odmerku 300 μM kombinacija predstavlja izrazito supresijo proteina. V nasprotju s tem ugotavljamo, da ni očitnih inhibicijskih učinkov na iNOS in COX-2 pri kombinaciji izoakteozida in 2'-acetilakteozida ali ehinakozida in verbaskozida v koncentraciji 75 μM (dodatna slika 2), poleg tega pa zdravljenje z drugimi pari kaže veliko šibkejši učinek v primerjavi s posameznimi sredstvi pri odmerku 150 ali 300 μM, kar lahko vidimo na sliki 5 (e–g).

Če povzamemo, študija in vitro zagotavlja dodatne informacije za presejalne kombinacije zdravil s potencialno protivnetnimi učinki in dokazuje zanesljivost strategije in silico screen.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE NEVROVNETJA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskusija

Nevrovnetje je vpleteno v večino nevroloških, psihiatričnih in nevrorazvojnih bolezni, ki niso le posledica, ampak so lahko tudi sprožilec patologije. Vendar pa so trenutna zdravljenja vnetja nevronov večinoma monoterapije, omejene z dobro znanimi stranskimi učinki, kot vemo, lahko zaviralci COX-2 povzročijo srčno-žilne okvare kot odgovor na dolgotrajno zdravljenje, zdravljenje, usmerjeno na TNF, pa lahko povzroči okužbo prek imunosupresija. Kombinatorni terapevtski pristopi so lahko nujni za izboljšanje zdravljenja zapletenih bolezni z naslednjimi prednostmi: nasprotna robustnost mreže in kompenzacija obvoda, povečana klinična učinkovitost ob ohranjanju minimalne toksičnosti za človeka in zmanjšan odmerek vsake spojine63. Vendar pa je raziskovanje sinergističnih kombinacij zdravil med spojinami, pridobljenimi iz zeliščnih zdravil na podlagi sistemske farmakologije, omejeno z možnim glavnim razlogom za velike količine spojin.

V delu najprej pridobimo 63 potencialnih bioaktivnih spojin izzel Cistanche tubulosa, ki izpolnjuje merila (DL Večje ali enako 0.18) za nadaljnjo analizo s pomočjo napovedi, ki je nepogrešljiva za odkrivanje bolj obetavnih molekul z želenimi lastnostmi. Po preslikavi 133 tarč 63 potencialnih bioaktivnih spojin v zbirko podatkov dobimo 43 tarč, povezanih z nevrovnetjem, nato pa lahko analiza združevanja GOBP predvidenih tarč verjetno prispeva k zdravljenju nevrovnetja. Analitični rezultat mreže CT je pokazal povprečno stopnjo na spojino 11,209 oziroma 7,651 na tarčo, 38 jih je prilagodilo več kot 7 tarč (večje od povprečne stopnje). Na primer, ehinakozid (mol41), predviden s 7 tarčami, verbaskozid (mol33), z 9 tarčami, ali miza B (mol57), z 8 tarčami, bi lahko igral ključno vlogo pri nevroprotekciji v skladu z naraščajočo literaturo.

Dosegamo neposredne terapevtske cilje, kot so APP, MAPT (znan tudi kot Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 in HTR2A (znan tudi kot 5-HT2A), GRIN2B (podenota 2B tipa glutamatnega ionotropnega receptorja NMDA) in GRIA1 (glutamatni ionotropni receptor AMPA tipa podenota 1) ali potencialne tarče na nižji stopnji, kot sta PTGS274 ali NOS275, ki so povezani z nevrovnetjem ali različnimi boleznimi živčnega sistema.

Analiza mreže Compound-Target-Pathway prikaže 12 spojin iz najboljših 10 parov zdravil prek algoritma PEA, povezanih s 43 potencialnimi tarčami in potmi, povezanimi z nevrovnetjem, na primer kalcijeva signalna pot, interakcija nevroaktivnega liganda in receptorja oz. TNF signalna pot itd. V sistemu bi te predvidene spojine lahko delovale ne samo na proteine ​​navzgor, ampak tudi na nižje poti, povezane z nevroinflamacijo in vnetnimi biomarkerji, zlasti. Poleg tega so na voljo dodatne informacije za pregledovanje kombinacij zdravil s potencialno protivnetnimi učinki, zanesljivost strategije in silico screen pa je preverjena z eksperimentalno validacijo. Pot nevrovnetja je sestavljena iz poti Alzheimerjeve bolezni, signalne poti kalcija, signalne poti GnRH, signalne poti VEGF in serotonergične sinapse. Analitični rezultati so nam jasno pojasnili, da so moduli celične smrti, vnetja in nevroprotekcije ponazorjeni za dešifriranje mehanizmaCistanche tubulosa za zdravljenje nevroinflamacije.

Nevrovnetje spremlja različne nevrodegenerativne bolezni, ki bi lahko bile ne le posledica, ampak tudi sprožilec patologije, zato se predlagajo protivnetne terapije kot obetaven pristop k zdravljenju. Na naše razočaranje, čeprav smo spoznali omejitve monoterapij, so ocena in osnovni mehanizmi kombiniranih terapij še vedno glavni izzivi pri razvoju nove alternativne strategije. To delo bi torej lahko ponudilo nove terapevtske priložnosti za nevrovnetje in lahko odpre novo pot za odkrivanje kombinacij zdravil iz naravnih izdelkov.

Materiali in metode

Zbirka spojin

Skupno 66 kemičnih sestavin Cistanche tubulosa je ročno zbranih iz TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, vključno s 26 feniletanoidnimi glikozidi, 22 iridoidi, 4 lignani, 7 monoterpenskimi glikozidi, 2 dušikovima snovema, 3 benzen akriloil sladkorji, 1 sterol, 1 ketol. Glede na toglikozidi v Cistanche tubulosaobičajno hidrolizirajo, da sprostijo aglikon, ki se nato absorbira v črevesni sluznici, zato upoštevamo molekule brez glikola, ki so označene kot _qt. To je vodilo do nastanka 103 spojin. Te molekule so navedene v dodatni tabeli S1.

Ocena podobnosti zdravilu

Da bi pridobili potencialne bioaktivne spojine iz Cistanche tubulosa, ocenjujemo podobnost teh sestavin zdravilu z izračunom podobnosti Tanimoto med rastlinskimi spojinami in povprečnimi molekularnimi lastnostmi vseh kemikalij v zbirki podatkov Drugbank. Model napovedovanja DL je bil uspešno uporabljen v številnih študijah za izbiro bioaktivnih spojin. V delu je indeks DL večji od ali enak 0.18 kandidatov opredeljen kot mejna vrednost, ki bolje ustreza kasnejši analizi.

Ciljna napoved zdravila

Identifikacija ciljev učinkovitosti za vodilne spojine ostaja ključni korak za napredovanje spojin v razvoj zdravil. Tu se uporabljata dve interni orodji: SysDT in WES, da se pridobijo informacije o molekularni tarči za lovljenje zdravil. SysDT je ​​samostojni model, ki se izvaja s kombinacijo kemičnih, genomskih in farmakoloških informacij, ki temelji na dveh zmogljivih matematičnih orodjih: Random Forest (RF) in Support Vector Machine (SVM) za učinkovito reševanje problema identifikacije ciljev. Pridobljeni model je služil kot dragocena platforma za napovedovanje interakcij med zdravilom in tarčo s skupno natančnostjo 97,3 %, natančnostjo aktivirane napovedi 87,7 % in natančnostjo inhibirane napovedi 99,8 %. Za zajem obetavnejših komponent so kriteriji filtriranja v tej študiji opredeljeni kot vrednost RF, večja ali enaka 0.7 ali SVM, večja ali enaka 0.8.

Ponderirana podobnost ansambla (WES) je nov zmogljiv računalniški model za natančno določanje neposrednih tarč zdravila za dejanske bioaktivne sestavine. Kot novo orodje se dobljeni model dobro obnese pri napovedovanju vezave s povprečno občutljivostjo 85 % (SEN) in nevezujočih vzorcev z 71 % (SPE) s povprečnimi površinami pod krivuljami delovanja sprejemnika (ROC, AUC) 85,2 % in povprečno skladnost 77,5 %. Dobljene tarče se nadalje preslikajo v Uniprot, da se naknadno normalizirajo njihova imena in organizmi. Tukaj izberemo le tarče Homo sapiensa za nadaljnjo analizo. Kandidatne tarče izbranih spojin so preslikane v zbirko podatkov CTD, da dobimo z njimi povezane bolezni, in končno izločimo potencialne tarče, povezane z nevroinflamacijo.

Obogatitev in analiza GO za tarče

Za sondiranje vpletenih bioloških procesov pridobljenih tarč preslikamo tarče v DAVID in v tem razdelku so izbrani izrazi z vrednostjo P, manjšo od 0.05.

Analiza kombinacije zdravil

V našem prejšnjem delu je bil sistemski farmakološki okvir izkoriščen za napovedovanje kombinacij zdravil na novo zasnovanem modelu, imenovanem pristop verjetnostnega ansambla (PEA), za analizo klinične učinkovitosti in neželenih učinkov kombinacij zdravil. Podrobneje je bilo razvito Bayesovo omrežje, ki se integrira z algoritmom podobnosti, za modeliranje kombinacij iz sestavljenih molekularnih in farmakoloških učinkov. Nato je bila predstavljena kombinirana ocena, ki je zajemala klinično učinkovitost in neželene učinke za predvidene pare. Na kratko, kaže, da bi PEA lahko napovedala učinkovitost parov z visoko specifičnostjo in občutljivostjo (AUC=0.90) v našem delu. V tem delu izberemo deset najboljših kombinacij zdravil glede na njihove sinergijske verjetnosti, ki predstavljajo možnost indukcije sinergije med dvema spojinama.

Gradnja in analiza mreže/poti

Da bi raziskali razmerja med aktivnimi sestavinami in vnetnimi boleznimi, Cytoscape 2.8.1, priljubljen bioinformatični paket za vizualizacijo bioloških omrežij in integracijo podatkov, ustvari omrežje spojina-tarča (CT) in omrežje spojine-tarče-poti (CTP). Kvantitativne lastnosti omrežja analizirata naslednja vtičnika Network Analyzer in CentiScaPe 1.2. V grafični mreži vozlišča označujejo spojine, tarče ali poti, medtem ko robovi kodirajo interakcijo zdravilo-tarča. Za nadaljnje raziskovanje bioloških učinkov delovanja celičnih tarč z moduliranjem več presnovnih poti je integrirana "pot" sestavljena s posodobljenimi informacijami o patologiji nevroinflamacije. Prvič, z uporabo preslikave v bazo podatkov KEGG se doseženi ciljni profili združijo v več poti. Po opustitvi posrednih odsekov se relativno sintetizirana pot ročno integrira na podlagi patoloških in kliničnih podatkov.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE PARKINSONOVE BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentalna validacija

Priprava vzorcev

Ehinakozid, verbaskozid, izoakteozid in 2'-acetilakteozidso kupljeni pri Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kitajska). Testne vzorce raztopimo v dimetil sulfoksidu (DMSO) (Sigma, ZDA), da dobimo 100 mM, kot osnovno raztopino, in nato shranimo pri 4 stopinjah. Končne razredčitve DMSO, dodanega gojišču, nikoli niso presegle 0,1 %, kar je zagotovilo, da ni vpliva na sposobnost preživetja celic.

Celična kultura

Mišje mikroglije BV2 je prvotno razvila celična banka Kitajske akademije znanosti v Šanghaju in jih gojila v 25 ali 75 cm2 z Dulbeccovim modificiranim Eagleovim medijem (DMEM/25 mM HEPES) (Gibco BRL, ZDA), dopolnjenim z 10 % fetalnega govejega seruma (FBS). (Gibco BRL, ZDA), penicilin G (100 enot/ml) in streptomicin (100 mg/ml) v vlažnem inkubatorju s 5 % CO2/95 % O2 pri 37 stopinjah.

Test viabilnosti celic

Celice mikroglije BV2 posejemo v 96-ploščo z vdolbinicami z gostoto 1 × 105 celic/ml, po 18-urni inkubaciji celice obdelamo s 100 ul svežega medija z ali brez različnih navedenih koncentracij preskusnih vzorcev za dodatnih 24 ur. Test CCK-8 (BestBio, Šanghaj, Kitajska) je priročna in zanesljiva metoda za določanje sposobnosti preživetja celic. Da odstranimo ozadje testnih vzorcev, zavržemo celotno gojišče kulture, nato pa dodamo 100 ul/vdolbinico svežega medija, ki vsebuje 10 % raztopino CCK-8. Vrednosti OD pri 450 nm odčitamo na bralniku mikroplošč (Molecular Devices, Kalifornija, ZDA) po 3-urni inkubaciji pri 37 stopinjah in 5 % CO2.

Western blot analiza

Celični protein se ekstrahira iz celičnih linij z uporabo Qproteome™ Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen, Nemčija) po navedenih postopkih po protokolu proizvajalca. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, ZDA) se uporablja za kvantifikacijo beljakovin. Ekvivalentne količine beljakovin (50ug) se denaturirajo z vrenjem pri 100 stopinjah 10 minut s pufrom za nalaganje vzorcev 2 x laemmli (Bio-Rad, ZDA) in 5% -merkaptoetanolom v razmerju 1:1 in naložen na pas na 12 % SDS-PAGE (natrijev dodecil sulfat poliakrilamidni minigeli), elektrotransferiran na 0,45 μm membrane poliviniliden fuorida (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, ZDA) 150 minut pri 200 mA. Nato so membrane blokirane v 3 % govejem serumskem albuminu (BSA) pri sobni temperaturi in inkubirane s primarnimi protitelesi iNOS in COX-2 (Abcam) pri 4 stopinjah čez noč. Po treh temeljitih izpiranjih v tris-pufrizirani fiziološki raztopini-Tween (TBST), vsakemu po 5 minut, se membrane testirajo s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s hrenovo peroksidazo (HRP) (razredčine 1:10000; Abcam), 1,5 ure pri sobni temperaturi. Imunoreaktivne pasove nato vizualiziramo z uporabo kompleta za odkrivanje kemiluminiscence ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornija, ZDA) po pranju dvakrat v TBST in enkrat v TBS, vsakič 5 minut. Denzitometrične vrednosti so normalizirane z uporabo -aktina kot nakladalne notranje kontrole.

Statistična analiza

Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka, Western blot analiza pa se ponovi v treh neodvisnih poskusih z enakim rezultatom. Enosmerna analiza variance se uporablja za primerjavo razlik povprečij za tri ali več skupin, statistična značilnost se analizira s Studentovim t-testom med dvema skupinama.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE PARKINSONOVE IN ALZHEIMERJEVE BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%