Eksperiment 3 Učinek Cistanche Deserticola feniletanol glikozida na podganji perimenopavzalni model Ⅲ

Poskus 3 Učinek feniletanol glikozida Cistanche deserticola na perimenopavzalni model podgan

1 Eksperimentalni materiali

1.1 Poskusne živali

Podgane Wistar, stopnja SPF, samice, ki jih zagotavlja Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., številka certifikata za podgane za to serijo: 0017216; številka laboratorijskega certifikata SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Eksperimentalna zdravila

Feniletanolni glikozid Cistanche deserticolaje bil pripravljen po metodi poskusa 1, vsebnost pa je dosegla 66,47 %. Gengnian'an kapsula, sestavine: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, lubje potonike, Poria cocos, biserna mati, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vinska trta, Uncaria, lebdeča pšenica, polygonum multiflorum . Funkcije in indikacije:Nahranite jin in umirite jang, lajšati težavein umiri um. Uporablja se za menopavzalne vročine in potenje, vrtoglavico, tinitus, razdražljivost in nespečnost. Tehnični podatki: 0.3g na kapsulo. Uporaba in odmerjanje: peroralno, 3 kapsule naenkrat, 3-krat na dan. Proizvajalec: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Številka proizvodne serije: 121104. Številka odobritve: National Drug Approval No. Z14021848.

Mehke kapsule s sojinimi izoflavoni in vitaminom E, seznam sestavin: sojini izoflavoni v prahu, vitamin E, sončnično olje, želatina, glicerin, voda, tartrazin, titanov dioksid. Ikonične sestavine in vsebina: Vsakih 100 g vsebuje 55,2 mg sojinih izoflavonov (preračunano kot genistein) in 608,5 mg vitamina E. Zdravstvene funkcije: Povečuje gostoto kosti. Navodila za uporabo in odmerjanje: Vzemite 1 kapsulo 2-krat na dan s toplo vodo. Specifikacije: 500 mg × 100 kapsul. Proizvajalec: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Številka proizvodne serije: 13070302. Številka odobritve: National Food Health G20080032.

KAKO ČASA TRAJA, DA CISTANCHE ZAČNE DELOVATI?

1.3 Eksperimentalni reagenti

Natrijeva karboksimetilceluloza, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., številka serije: 20120418; natrijev penicilin za injiciranje, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikacija: 4 milijone enot, številka proizvodne serije: c1206807;

Raztopina formaldehida (analitsko čista), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., številka proizvodne serije: 20130902; 0,9 % injekcija natrijevega klorida, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikacija: 250 ml, številka proizvodne serije: 13082405B;

Kloralhidrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, številka serije 20120827; Podgana E2 ELISA komplet za odkrivanje, R&D Company, številka serije: 20140101A; Komplet za odkrivanje podgan T ELISA, R&D Company, številka serije: 20140101A; Komplet za odkrivanje LH ELISA podgan, R&D Company, številka serije: 20140101A; Komplet za odkrivanje podgan FSH ELISA, R&D Company, številka serije: 20140101A;

2 Eksperimentalne metode

2.1 Modeliranje in administracija zdravil

Metoda modeliranja: Vzemite 100 samic podgan Wistar s telesno težo 210~230g, naključno izberite 12 podgan kot prazno skupino in opravite lažno operacijo, preostale podgane pa bodo uporabljene za ustvarjanje menopavze modeli. Ko smo podgane stehtali, smo podgane anestezirali z intraperitonealno injekcijo 10 % kloralhidrata (0,3 ml/100 g) in fiksirali trebušni položaj. Nato so podgane obrezali izpod zadnjega rebra na hrbtu na presečišču srednje aksilarne črte in približno 2 cm od stranske strani hrbtenice ter jih nato razkužili. Koža in hrbtne mišice so zarezane približno 1 cm, v vidnem polju reza pa je vidna mlečno bela sijoča ​​maščobna masa, vanjo pa je vraščen jajčnik. Z majhno pinceto nežno primite maščobno maso in jo izvlecite iz reza, ločite maščobno maso in videli boste skupino tankih, nepravilnih, rumeno-rdečih jajčnikov. Pri rezanju najprej podvežite jajcevod (vključno z maščobo) pod jajčnikom s tanko nitjo, popolnoma odstranite levi jajčnik in odstranite 80% desnega jajčnika. Po operaciji so maternične rogove vrnili v trebušno votlino, zašili mišice in kožo ter na enak način odstranili oba jajčnika. Po operaciji so bile živali skrbno vzgojene in intramuskularno injicirane z 200,000 u/kg penicilina (po 0,1 ml) za preprečevanje okužbe, enkrat na dan 3 zaporedne dni. 5 dni po operaciji smo začeli s pregledom vaginalnih brisov podgan eno za drugo, enkrat na dan 5 zaporednih dni. Podgane z estrusnimi reakcijami v brisu so bile zavržene. Izbrali smo 72 popolnoma kastriranih podgan in jih naključno razdelili v 6 skupin. Za eksperimentalne namene so to modelna skupina, skupina Gengnianan, skupina sojinih izoflavonov in skupina velikih, srednjih in majhnih odmerkov Cistanche deserticola feniletanol glikozidov.

Metoda priprave: Metoda priprave: {{0}}.5% CMC Metoda priprave: Odtehtajte 4 g natrijeve karboksimetilceluloze in jo zmešajte z destilirano vodo, da dobite 800ml. Odmerki velikih, srednjih in majhnih odmerkov skupine feniletanol glikozidov Cistanche deserticola so bili 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg oziroma 33,33 mg/kg (dajanje volumna 1 ml/100 g). Način priprave: odtehtajte 1333,3 mg, 666,7 mg oziroma 333,3 mg skupnih flavonoidov maline, raztopite jih z majhno količino 0,5 % CMC, nato nastavite prostornino na 100 ml, dobro premešajte in to je to. Gengniangan kapsule (450 mg/kg, pomešane z destilirano vodo do 45 mg/ml, 1 ml/100 g, kar ustreza 10-kratnemu kliničnemu odmerku); Način priprave: Vzemite 15 kapsul Gengnianan, najprej jih raztopite z majhno količino 0,5 % CMC, nato prilagodite prostornino na 100 ml in dobro premešajte, kar je odmerek suspenzije kapsul Gengnianan (450 mg/kg). Mehke kapsule sojinega izoflavona vitamina E (166,67 mg/kg, uporabite destilirano vodo, da dobite 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, kar ustreza 10-kratnemu kliničnemu odmerku); Metoda priprave: Vzemite 4 mehke kapsule sojinega izoflavona vitamina E, najprej raztopite z majhno količino 0,5 % CMC, nato nastavite volumen na 120 ml in dobro premešajte, da dobite odmerek suspenzije mehke kapsule sojinega izoflavona vitamina E (16,67 mg/kg). ).

Način dajanja: Živali v vsaki skupini so dobile ustrezna zdravila 10. dan po operaciji. Slepo skupino in modelno skupino smo dajali z enakim volumnom 0,5 % raztopine CMC (volumen sonde je bil 1 ml/100 g), skupino z gengniananom pa smo dajali suspenzijo kapsule Gengnianan (450 mg/kg, kar ustreza 10-kratnemu kliničnemu odmerku). ). ), skupini s sojinim izoflavonom so peroralno dajali suspenzijo mehke kapsule vitamina E iz sojinega izoflavona (166,67 mg/kg, kar ustreza 10-kratnemu kliničnemu odmerku) ter velike, srednje in majhne odmerkeFeniletanolni glikozid Cistanche deserticolaskupinam so dajali peroralno glede na skupino. Veliki, srednji in majhni odmerki feniletanol glikozida Cistanche deserticola (odmerki so 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg oziroma 33,33 mg/kg, volumen odmerka je 1 ml/100 g), dani enkrat na dan z intragastrično aplikacijo, neprekinjeno . zdravila 30 dni.

2.2 Predmeti opazovanja in metode odkrivanja

Rezultati vodoravnega in navpičnega gibanja podgan v vsaki skupini so bili izmerjeni 29 dni po dajanju. 2 uri po zadnji želodčni uporabi (na tešče 15 ur) odstranite zrkla za zbiranje krvi, ločite serum inplazma, ter izmeri vsebnost E2, T, LH, FSH, GnRH in BGP v serumu ter vsebnost -EP v plazmi; podgane so secirali. Odstranite timus, vranico, maternico in preostalih 20 % tkiva jajčnikov, stehtajte njihovo mokro težo in izračunajte organski indeks timusa, vranice in maternice (indeks organa=mokra teža organa mg/teža podgane g) , in nato odstranite možgane. Za hipotalamus in hipofizo smo tkivne homogenate pripravili iz hipotalamusa, hipofize in 1/2 maternice ter vsebnost estrogenskih receptorjev v hipotalamusu, hipofizi in materničnih tkivnih homogenatih ter androgene določili smo vsebnost receptorjev v homogenatih hipotalamičnega tkiva. Timus, vranica, maternica in jajčnik so bili fiksirani v 10% raztopini formaldehida, vstavljeni v parafin, razrezani in obarvani z HE. Thehistomorfološke spremembev vsaki skupini opazovali pod svetlobnim mikroskopom.

2.2.1 Preskus z metodo odprtega polja

Eksperimentalna naprava je kubična odprta škatla z višino 40 cm ter dolžino in širino 80 cm. Okolne stene in dno so črne. Dno je sestavljeno iz 25 blokov enake površine, razdeljenih z belimi črtami. Med poskusom je bila podgana postavljena v kvadratek na sredini odprte škatle in ocena horizontalne aktivnosti števila blokov, ki jih je podgana prečkala na dnu v 5 minutah (štejejo se lahko kvadratki z vsemi štirimi tačkami), in kolikokrat so se zadnje okončine postavile pokonci (dve sprednji taci sta bili v zraku). (ali oprijemanje stene) ocena navpične dejavnosti. Po vsakem poskusu je treba blato v celoti odstraniti in vsako podgano izmerimo enkrat 2 uri po dajanju. Ta poskus je bil izveden v tihi sobi.

2.2.2 Metoda določanja kompleta

Pridobite vzorce seruma: uporabite epruvete, ki ne vsebujejo pirogenov in endotoksinov. Med operacijo se izogibajte stimulaciji celic. Po odvzemu krvi jo 10 minut centrifugirajte pri 3000 obratih na minuto, da hitro in previdno ločite serum in rdeče krvne celice. Pridobite vzorce plazme: antikoagulirane s heparinom antikoagulantne epruvete. Centrifugirajte pri 3000 obratih na minuto 30 minut in vzemite supernatant. Pridobite vzorce tkivnega homogenata: dodajte ustrezno količino fiziološke raztopine v tkivo in ga pretlačite. Centrifugirajte pri 3000 obratih na minuto 10 minut in vzemite supernatant.

Metoda določanja kompleta ELISA za podganji (Rat) estradiol (E2) je enaka kot v poskusu 2. Koncentracije standardov (S0-S5) so 0, 4, 8, 16, 32 in 64 pmol/l.

Testna metoda kompleta Rat (Rat) Testosterone (T) ELISA Kit je enaka kot testna metoda kompleta Estradiol ELISA. Koncentracije standardov (S{{0}}S5) so {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 in 320 pg / ml. Metoda določanja kompleta za odkrivanje luteinizirajočega hormona (LH) podgane (Rat) ELISA je enaka kot metoda določanja kompleta za odkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standardov (S0-S5) so 0, 3, 6, 12, 24 in 48 ml/ml. Metoda testiranja kompleta ELISA za podganji (Rat) folikle stimulirajoči hormon (FSH) je enaka kot metoda testiranja kompleta ELISA za estradiol. Koncentracije standardov (S0-S5) so 0, 0,75, 1,5, 3, 6 in 12 IU/L. Metoda določanja kompleta za odkrivanje ELISA gonadotropin-sproščujočega hormona (GnRH) podgane (Rat) je enaka kot metoda določanja kompleta za odkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standardov (S0-S5) so 0, 5, 10, 20, 40 in 80 mlU/ml.

Metoda določanja kompleta za odkrivanje osteokalcina podgane (BGP/OCN) ELISA je enaka kot metoda določanja kompleta za odkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standardov (S{{0}}S5) so 0, 0.75, 1,5, 3, 6 in 12 ng/ml. Metoda določanja kompleta za odkrivanje podgan (Rat) -endorfina (-EP) ELISA je enaka kot metoda določanja kompleta za odkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standardov (S0-S5) so 0, 3, 6, 12, 24 in 48 pg/mL. Metoda določanja kompleta za odkrivanje estrogenskega receptorja (ER) podgane (Rat) ELISA je enaka kot metoda določanja kompleta za odkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standardov (S{{20}}S5) so 0, 4, 8, 16, 32 in 64 pg/mL. Metoda določanja kompleta za odkrivanje ELISA androgenega receptorja (AR) podgane (Rat) je enaka kot metoda določanja kompleta za odkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standardov (S0-S5) so 0, 25, 50, 100, 200 in 400 pg/mL.

2.3 Metode statistične obdelave

Za analizo podatkov je bil uporabljen medicinski statistični paket SPSS17.0 za statistično obdelavo podatkov. Podatki meritev so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon (-x±s). Za primerjavo med skupinami smo uporabili enosmerno analizo variance. Za testiranje homogenosti varianc je bila uporabljena metoda LSD. , za neenakomerne variance je bil uporabljen Games-Howellov test, za podatke o ocenah pa Riditov test.

Iz tabele 11 in slike 14 je razvidno, da so bili v primerjavi s slepo skupino timusni indeks, vranični indeks in maternični indeks pri podganah v modelni skupini znatno zmanjšani (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Učinki na ravni biokemičnega indeksa krvi pri perimenopavzalnih modelih podgan

Serumske vsebnosti E2, T, LH, FSH, GnRH in BGP ter vsebnosti -EP v plazmi podgan v vsaki skupini so prikazane v tabelah 12–13 in slikah 15–17.

Iz tabel 12–13 in slik 15–18 je razvidno, da sta bili serumski ravni E2 in T pri podganah v modelni skupini v primerjavi s slepo skupino znatno znižani (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Preglednica 14 Učinek feniletanol glikozida Cistanche deserticola na serumske ravni GnRH in plazemske ravni -EP pri podganjem perimenopavzalnem modelu (-x±s)

Iz tabele 14 in slik 19-20 je razvidno, da je bila v primerjavi s slepo skupino serumska raven GnRH pri podganah v modelni skupini znatno povečana, raven -EP v plazmi pa znatno znižana (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Učinki na vsebnosti ER in AR v tkivih modelov podgan v perimenopavzi

Vsebnosti ER in AR v ustreznih tkivih podgan v vsaki skupini so prikazane v tabelah 16–17 in slikah 22–23.

Iz tabele 17 in slike 23 je razvidno, da je bila raven AR v hipotalamusu modelne skupine v primerjavi s slepo skupino znatno nižja (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Učinki na morfologijo organskega tkiva pri podganah v modelu perimenopavze

Rezultati patološkega in histološkega opazovanja maternice, timusa in vranice podgan v vsaki poskusni skupini so naslednji. Patološke fotografije so prikazane v Dodatku 1 za patološke fotografije modelov podgan v perimenopavzi.

5.1 Vpliv na morfologijo materničnega tkiva pri podganah v modelu perimenopavze

Glede na različne stopnje sprememb v endometriju, žlezah in miometriju podgan v vsaki poskusni skupini so uporabili polkvantitativne standarde za razdelitev morfologije patološkega tkiva na štiri ravni, maternice podgan v vsaki poskusni skupini pa izmerjeno. Rezultati opazovanja so prikazani v tabeli 18.

"-" Epitelijske celice endometrija, žleze, miometrij in seroza so normalni; "+" endometrijske epitelne celice in žleze so atrofirane, miometrij in seroza pa sta normalna; "++" epitelij endometrija Celice in žleze so delno atrofirane, mišična plast je rahlo atrofirana in seroza je normalna; "+++" endometrijske epitelne celice in žleze so močno atrofirane, seroza pa je normalna.

Po testu Ridit je iz tabele 18 razvidno, da je maternica podgan v modelni skupini v primerjavi s slepo skupino pokazala pomembne patološke poškodbe tkiva (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Vpliv na morfologijo tkiva jajčnikov pri podganah v modelu perimenopavze

Glede na različne stopnje sprememb v foliklih, rumenem telescu, granuloznih celicah in krvnih žilah v jajčnikih podgan v vsaki skupini poskusov so bili uporabljeni polkvantitativni standardi za razdelitev morfologije patološkega tkiva na štiri ravni. Jajčnike podgan v vsaki skupini poskusov smo izmerili in opazovali. Rezultati so prikazani v tabeli 19.

Preglednica 19 Vpliv feniletanol glikozida Cistanche deserticola na patološke spremembe jajčnikov pri modelih podgan v perimenopavzi Enota: samo

»-« lahko prikazuje rastoče folikle, zrele folikle in rumeno telesce na vseh ravneh. Rumeno telo je dobro razvito, z veliko plastmi granuloznih celic, bogato folikularno tekočino in bogatimi krvnimi žilami; »+« lahko prikazuje rastoče folikle, zrele folikle in rumeno telesce, vendar je število zrelih foliklov in rumenega telesca majhno. , folikli so manjši, granulozne celice pa manj plastne; »++« lahko prikazuje zrele folikle in rumeno telesce z več rumenim telescem, manj granuloznimi celicami in manj krvnimi žilami; "+++" nima foliklov, več je rumenega telesca in jajčnik je atrofičen, avaskularen.

Po testu Ridit je iz tabele 19 razvidno, da so jajčniki modelne skupine podgan v primerjavi s slepo skupino pokazali pomembne patološke lezije tkiva (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Učinki na morfologijo tkiva timusa in vranice pri perimenopavzalnih modelih podgan

Z mikrometrom izmerite debelino najdebelejših in najožjih delov timusne skorje vsake podgane v vsaki poskusni skupini, da dobite povprečje; Uporabite osnovno linijo mikrometra, da pade na vranične nodule, izmerite debelino vraničnih vozličev na obeh straneh. z osrednjo arterijo kot središčem in izračunajte povprečje. Izmerjeni rezultati so prikazani v tabeli 20 in sliki 24.

Iz tabele 20 in slike 24 je razvidno, da sta se v primerjavi s slepo skupino debelina skorje timusa in volumen vraničnih vozličev v modelni skupini bistveno zmanjšala (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).