Raziskovanje vloge novega homologa interlevkina-17 iz nevretenčarske morske školjke Mytilus Coruscus pri prirojenem imunskem odzivu: Ali je negativna regulacija Mc-Novela_miR_145 ključ?

Povzetek: Interlevkin-17 (IL-17) predstavlja razred vnetnih citokinov, ki sodelujejo pri kroničnih vnetnih in degenerativnih motnjah. Pred to študijo je bilo predvideno, da bi lahko homolog IL-17 bil tarča Mc-novel_miR_145 za sodelovanje pri imunskem odzivu Mytilus coruscus. Ta študija je uporabila različne raziskovalne metode molekularne in celične biologije za raziskovanje povezave med Mc-novel_miR_145 in homologom IL-17 ter njunimi imunomodulatornimi učinki. Bioinformatska napoved je potrdila povezanost homologa IL-17 z družino IL-17 školjk, čemur so sledili kvantitativni testi PCR v realnem času (qPCR), da bi dokazali, da je bil McIL-17-3 močno izražen v imunsko povezana tkiva in se odzvala na bakterijske izzive. Rezultati reporterskih testov luciferaze so potrdili potencial McIL-17-3 za aktiviranje NF-κb navzdol in njegovo ciljanje z Mc-novel_miR_145 v celicah HEK293. Študija je proizvedla tudi antiserum McIL-17-3 in ugotovila, da Mc-novel_miR_145 negativno uravnava McIL-17-3 s testi Western blotting in qPCR. Poleg tega je analiza pretočne citometrije pokazala, da Mc-novel_miR_145 negativno uravnava McIL-17-3 za ublažitev apoptoze, ki jo povzroča LPS. Skupaj so trenutni rezultati pokazali, da je imel McIL-17-3 pomembno vlogo pri imunski obrambi mehkužcev pred napadom bakterij. Poleg tega je bil McIL- 17-3 negativno reguliran z Mc-novel_miR_145 za sodelovanje pri apoptozi, ki jo povzroča LPS. Naše ugotovitve zagotavljajo nov vpogled v regulacijo nekodirane RNA v modelih nevretenčarjev.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Ključne besede: Mytilus kuskus; interlevkin-17; mikroRNA; apoptoza; prirojena imunost

1. Uvod

Imunski sistem igra ključno vlogo pri obrambi organizma pred vdorom eksogenih patogenov. Konvencionalno delimo obrambni sistem na prirojeno imunost in pridobljeno imunost. Prirojena imunost predstavlja prvo obrambno linijo telesa pred patogeni, ki lahko zazna invazijo patogenov in jih delno odstrani [1]. Prirojeno imunost posreduje veliko različnih celic, vključno z naravnimi celicami ubijalkami, monociti, nevtrofilci, eozinofili, bazofili in krožečimi dendritičnimi celicami, ki so skupaj znane kot prirojene imunske celice. Te celice sproščajo veliko število citokinov, ki so vključeni v celično komunikacijo in s tem pomagajo pri usklajevanju imunskih odzivov [2]. V primeru okužbe in vnetja citokini delujejo kot modulatorji: nekateri citokini poslabšajo bolezen (proinflamatorni), drugi pa krepijo zdravje (protivnetni) [3]. Citokini so podvrženi visokim stopnjam evolucijskega pritiska in tako kažejo diverzifikacijo sekvenc [4], medtem ko družina citokinov IL-17 kaže visoko ohranjenost, kar se kaže v pregibu cisteinskega vozla v funkcionalni arhitekturi, oblikovani z interakcijami med štirimi ohranjeni ostanki cisteina [5]. Nedavne študije so pokazale, da je IL-17 razred vnetnih citokinov, ki sodelujejo pri kroničnih vnetnih in degenerativnih motnjah [6]. IL-17 delujejo tako, da se specifično vežejo na receptorje za spodbujanje razvoja vnetja, imunske zavrnitve in hematopoeze. Družino citokinov IL-17 pri ljudeh sestavlja šest članov (IL-17A do IL-17F), ki jih kot odziv na IL proizvajajo aktivirani limfociti T in druge prirojene celične populacije. -1 in IL-23 [7,8]. Vse več dokazov pa kaže, da je družina IL-17 doživela opazno razširitev pri morskih mehkužcih in vrstah iglokožcev. V genomu škrlatnega morskega ježka Strongylocentrotus purpuratus je bilo odkritih okoli 30 genov IL-17 [9]. Podobno je bilo 31 genov, podobnih hobotnici IL-17-, najdenih pri glavonožcih Coleoid, pri čemer se 27 genov močno izraža v priseskih in koži [10]. Saco, et al. [11] je pridobil 379 edinstvenih zaporedij IL-17 iz 15 ponovno sekvenciranih genomov školjk in referenčnega genoma M. galloprovincialis [12] ter jih s filogenetsko analizo razdelil v 23 izoform. Nadalje so ugotovili, da so bile izooblike IL-17 iz vrst Mytilidae ohranjene med posamezniki in deljene med tesno povezanimi vrstami. Poleg vrst Mytilidae so bile velike družine IL-17 najdene tudi pri drugih vrstah mehkužcev, vključno s Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis in Pinctada fucata martensii [13]. Morska voda je polna patogenov in morski mehkužci so v stalnem stiku z njimi, zato je potreben močan arzenal imunskih molekul, nakar razširitev družine IL-17 tem živalim daje učinkovitejše imunske odzive.

Obstaja več študij, ki kažejo na pomembno vlogo, ki jo imajo IL-17 pri prirojeni imunosti mehkužcev. Raziskave so na primer pokazale, da je bila po okužbi z Vibrio harveyi raven mRNA IL-17D močno povečana pri Tegillarca granulosa [14], medtem ko je pri C. gigas CgIL17-5 pokazal izrazita reakcija na Vibrio splendidus [15]. Poleg tega se je pokazalo, da se IL-17 mehkužcev odzivajo na številne s patogeni povezane molekularne vzorce (PAMP), kot so lipopolisaharid (LPS), poliinozinska: policitidilna kislina (poliI: C) in peptidoglikan (PGN). LPS je glavna sestavina zunanje stene celične stene po Gramu negativnih bakterij in predstavlja enega najpogosteje uporabljenih imunskih stimulansov. Po drugi strani pa je polyI: C analog dvoverižne RNA, ki se pogosto uporablja kot simulator virusa v znanstvenih raziskavah. Po stimulaciji z LPS se je transkripcijska ekspresija genov družine IL-17 hitro sprožila pri pacifiški ostrigi C. gigas in biserni ostrigi P. fucata [16,17]. Tudi pri bisernih ostrigah je bilo ugotovljeno, da je PfIL-17 vključen v imunski odziv na stimulacijo polyI: C [17].

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Poleg tega je dvojni test luciferaze pokazal, da je PfIL-17 lahko aktiviral tarčne gene vretenčarjev, ki vsebujejo vezavna mesta NF-kB, in sodeloval pri signalni poti NF-kB v celicah HEK293 [17]. PGN je prisoten v celični steni gram-pozitivnih bakterij in se pogosto uporablja kot posnemalec gram-pozitivnih bakterij. Dokazano je bilo, da ima rekombinantni C. gigas IL17-5 močno afiniteto do PGN, o kateri še nikoli niso poročali pri interlevkinih vretenčarjev [18]. Te študije so bile uvod v razkritje imunomodulatorne funkcije IL-17 pri mehkužcih. Kot razred provnetnih citokinov lahko čezmerno izražanje IL-17 povzroči resno poškodbo celic. Organizmi so razvili različne mehanizme za nadzor prekomerne reakcije IL-17, od katerih mikroRNA (miRNA) predstavljajo najmočnejši in dobro raziskan razred nekodirajočih RNA. MiRNA so družina kratkih RNA, dolgih približno 22 nt, ki lahko uravnavajo izražanje ciljnih genov s translacijsko represijo ali razgradnjo mRNA [19]. Sedanje raziskave regulacije IL-17 z miRNA se v glavnem osredotočajo na njihove sinergične učinke pri človeških avtoimunskih boleznih, kot so multipla skleroza, revmatoidni artritis, psoriaza in druge [20]. Razvoj tehnike visoko zmogljivega sekvenciranja in biološkega izračuna omogoča skeniranje miRNA mehkužcev na genomski ravni, veliko število ohranjenih in novih miRNA pa je bilo identificiranih pri vrstah mehkužcev, kot so ploščata ostriga Ostrea edulis, pacifiška ostriga C. gigas , Lymnaea stagnalis, školjka M. galloprovincialis itd. [21–29]. Te študije zagotavljajo osnovne podatke in veliko podporo za funkcionalno interpretacijo miRNA v mehkužcih. V zvezi z imunoregulacijsko vlogo nekaterih miRNA pri mehkužcih, Tian, ​​et al. [30] so ugotovili, da lahko Pm-miR-29a pozitivno regulira IL-17 pri Pinctada martensii; po prekomerni ekspresiji Pm-miR-29a je bila ekspresija IL-17 v plašču in škrgah vrste povečana. Pri C. gigas je cgi-miR-2d povečal fagocitozo hemocitov ostrig z negativno regulacijo CgIκB2 [31] in negativno regulacijo ekspresije holinskega prenašalca podobnega gena v zgodnji fazi okužbe, ki je bil vključen v sofisticirano imunomodulacijo [32].

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Med izsušitvijo je bilo ugotovljeno, da je cgi-miR-365 induciran z noradrenalinom in neposredno spodbuja izražanje CgHSP90AA1 [33]. Nedavne študije so pokazale, da ogrodje miRNA 659_26519 cilja na kalmodulin za uravnavanje izražanja IL-17 v zgodnji fazi imunskega odziva C. gigas [34]. Poleg tega so bile specifične funkcije nekaterih miRNA opisane pri drugih nevretenčarjih, kot sta morska kumara Apostichopus japonicus [35–39] in kozica Litopenaeus vannamei [40]. Te študije so odprle tančico osnovnih mehanizmov miRNA pri nevretenčarjih in tudi zagotovile tehnične in metodološke reference za naše trenutne raziskave. V naši prejšnji študiji je bilo 26 miRNA in 667 genov M. coruscus biološko izračunanih za diferencialno izražanje po izzivu Vibrio alginolyticus, od katerih lahko Mcnovel_miR_145 cilja na homolog IL-17 in so vključeni v imunski odziv na bakterijsko okužbo [41]. Cilj te študije je identificirati gen IL-17 in raziskati njegovo potencialno vlogo pri prirojeni imunosti in njeno regulacijo z miRNA Mcnovel_miR_145 v M. coruscus. S to študijo želimo pridobiti boljše razumevanje mehanizmov imunskega odziva mehkužcev in osvetliti molekularne osnove njihove imunske obrambe pred patogeni. Ta raziskava lahko zagotovi tudi vpogled v regulacijo nekodirane RNA v modelih nevretenčarjev.

2. Rezultati

2.1. Karakterizacija McIL-17-3

Zaporedje cDNA McIL-17-3, ki vsebuje celotno ORF, 30 -UTR in delno 50 - UTR, je bilo in silico klonirano iz transkriptoma polne dolžine M. coruscus (pristopna številka: PRJNA798880, F{ {5}}prepis_12404). McIL-17-3 vsebuje regijo ORF 585 bp, ki kodira 194 aminokislin. Predvidena molekulska masa je 21,77 kDa, izoelektrična točka pa 5,21. Analiza SMART je razkrila tipično domeno IL-17 v tem proteinu (slika 1A). Filogenetsko drevo je bilo zgrajeno z rekrutiranjem IL-17 članov vrst vretenčarjev in Mytilidae, IL2 pa so bili uporabljeni kot zunanja skupina. Kot je prikazano na sliki 1B, so ti IL-17 zbrani v posebno vejo, da se razlikujejo od IL-2. Znotraj gruče IL-17 sta bili prikazani dve navidezni kladi, ena je sestavljena iz IL-17 vretenčarjev, druga pa iz IL-17 školjk. V skupini školjk IL-17 se je McIL-17-3 najprej združil z ustrezno molekulo iz druge vrste Mytilus, M. galloprovincialis (slika 1B).

2.2. Večkratna poravnava in napovedovanje terciarne strukture

Jedro McIL-17-3 je sestavljeno iz dveh parov antiparalelnih pramenov; en par vključuje verige 1 (ostanki 52–58) in 2 (ostanki 66–72 in 77–79), medtem ko drugi vključuje verige 3 (ostanki 89–103) in 4 (ostanki 110–125) (slika 2B, C) . Dva disulfidna mostova (Cys97/Cys134 in Cys125/Cys169) povezujeta pramene 1 in 3, 2 oziroma 4 (slika 2A, C). Dosledno imajo tudi drugi IL-17 mehkužcev ta dva disulfidna mostova med prameni 1 in 3, 2 in 4 (slika 2A, C). Čeprav imajo vretenčarski IL-17 tudi dva disulfidna mostova, obstajata med 2 in 4 (slika 2A, C).

2.3. Transkripcijska ekspresija McIL-17-3

Profil tkivne porazdelitve transkriptov McIL{{0}} je bil ocenjen s qPCR. Transkripti McIL-17-3 so bili izraženi v vseh testiranih tkivih, ravni izražanja v hemocitih in škrgah pa so bile znatno višje od tistih v adduktorski mišici (slika 3A). Ocenjeno je bilo tudi časovno izražanje hemocitnih transkriptov McIL-17-3 kot odgovor na izziv V. alginolyticus. Raven mRNA McIL-17-3 je bila znatno povečana pri 3 in 12 HPC (3.13- oziroma 4.35-kratno povečanje v primerjavi z 0 HPC), vendar ni bilo očitna časovna pravilnost na splošno (slika 3B).

Slika 1. Molekularna karakterizacija McIL-17-3. (A) Analiza arhitekture ohranjenih domen v McIL-17-3 z uporabo SMART. Prikazana je bila ohranjena domena IL-17. (B) Filogenetska analiza McIL-17-3. Filogenetsko drevo je bilo zgrajeno s programsko opremo MEGAX z 2000 ponovitvami zagona z uporabo metode sosednjega združevanja. McIL-17-3 je bil označen z zelenim trikotnikom. Vse vrste, vključene v filogenetsko drevo, so bile pridobljene iz baze podatkov Genebank, v drevesu pa so bile navedene tudi pristopne številke. Zeleni trikotnik v imenu McIL-17-3. (Za razlago sklicevanj na barvo v tej legendi slike je bralec napoten na spletno različico tega članka.)

2.4. Aktivacija Downstream s strani McIL-17-3

Kot je prikazano na sliki 4, je rekombinantni McIL-17-3 povečal aktivnost luciferaze pGLNF-κB-luc na način, ki je odvisen od odmerka. Pri 0.5 in 1.0 µg/jamico se je aktivnost luciferaze pGLNF-κB-luc povečala 2.07- oziroma 1.07-krat.

2.5. Potrditev McIL-17-3 kot ciljnega gena Mc-novel_miR_145

Z bioinformatičnim predvidevanjem vsebuje gen McIL{{0}} standardno ciljno zaporedje za Mc-novel_miR_145 pri svojem 30 UTR (slika 5A). Mimik in zaviralec Mc-novel_miR_145 sta bila sotransfektirana z reporterskim plazmidom McIL-17-3-30 UTR divjega tipa v celice HEK293, da potrdimo njuno korelacijo. Kot je prikazano na sliki 5B, lahko mimik Mc-novel_miR_145 zavira aktivnost luciferaze McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}kratno zmanjšanje v primerjavi s kontrolo), medtem ko zaviralec Mc-novel_miR_145 izjemno ublaži učinke (1.64-kratno povečanje v primerjavi z Mc-novel_ miR_145 mimik kot zgolj dodana skupina). Da bi ocenili, ali Mc-novel{{30}}miR_145 neposredno cilja na gen McIL-17-3 prek ciljnega mesta v 30 UTR, smo izdelali mutirano različico luciferaznih reporterskih plazmidov ki je mutiral Mc-novel_miR_145 ciljna zaporedja v McIL-17-3 30 UTR. Kot je prikazano na sliki 5C, je mimik Mc-novel_miR_145 bistveno zmanjšal aktivnost luciferaze celic, transficiranih z McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-krat). zmanjšanje), medtem ko v celicah, transficiranih z McIL-17-3-30 UTR-MUT, niso opazili nobene spremembe aktivnosti luciferaze. Poleg tega je mogoče od odmerka odvisne učinke Mc-nove_miR_145 posnemati inhibicijo McIL-17-3-30 UTR-WT luciferazne aktivnosti opaziti tudi 24 ur po transfekciji (0 .71-, 0.43- in 0.20-kratno zmanjšanje v primerjavi s kontrolo, slika 5D).

Slika 2. Večkratne poravnave McIL-17-3 z drugimi člani družine IL-17. (A) Aminokislinsko zaporedje McIL-17-3 je bilo usklajeno z zaporedjem drugih IL-17, pridobljenih iz školjk in vretenčarjev, vključno z mišmi in cebricami. Ti cisteini, ki tvorijo kanonični vozel, so bili označeni z zeleno, zamenjani aminokislinski ostanki pa so označeni z rdečo. Cisteinski vozel je označen z barvnimi črtami, modra pomeni njihovo prisotnost pri mehkužcih, rdeča pa njihovo prisotnost pri vretenčarjih. Opomba: za vizualizacijo se ohrani le druga polovica poravnave zaporedja. (B) Terciarna struktura proteina McIL-17-3 je bila predvidena z uporabo švicarskega modela in programske opreme pyMol. Ti cisteini, ki tvorijo kanonični vozel, so bili označeni. (C) Risana predstavitev kanonične gube cisteinskega vozla. Ostanki cisteina so bili označeni s polnimi krogi; tisti, ki so bili prisotni v proteinih IL-17, so bili rumeni, medtem ko sta bila dva zgrešena siva. (Za razlago sklicevanj na barvo v tej legendi slike je bralec napoten na spletno različico tega članka.)

Slika 3. Analiza ekspresijskega profila transkriptov McIL-17-3. (A) Porazdelitev transkriptov McIL-17-3 v običajnih tkivih školjk. (B) Spremembe časovnega izražanja transkriptov McIL-17-3 kot odgovor na izziv V. alginolyticus. Rezultati so bili izraženi kot povprečje ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0,01). (Za razlago sklicevanj na barvo v tej legendi slike je bralec napoten na spletno različico tega članka.)

Slika 4. Aktivacija reporterja NF-κB z McIL-17-3. Rekombinantni vektor pEGFP-McIL- 17-3 v treh koncentracijah (0.1, 0.5 in 1.{{10}} µg/jamico) je bil sotransfektiran v celice HEK293 z uporabo Lipo6000TM 24 ur. Relativne aktivnosti luciferaze smo izračunali z normalizacijo na vrednost pRLTK. Eksperimentalne rezultate smo izrazili kot kratne spremembe s primerjavo aktivnosti luciferaze rekombinantnih celic, induciranih z vektorji, s tistimi celic, induciranih s praznimi vektorji, pri enaki koncentraciji. Vsaka vrednost je bila prikazana kot povprečje ± SD (n=3), stolpci s simbolom zvezdice pa so bili pomembno različni (* p < 0,05, ** p < 0,01).

Slika 5. Mc-roman_miR_145, namenjen McIL-17-3. (A) Zaporedje McIL-17-3 30 UTR je bilo vstavljeno v vektor pmiR-RB-Report™, v tem zaporedju so bili konstruirani divji in mutirani plazmidi. Mcnovel_miR{{10}} zaporedje in McIL-17-3-30 UTR ciljno mesto in zaporedje mutantnega mesta so bili označeni z rdečimi markerji. (B) Plazmid McIL-17-3-30 UTR-WT je bil sočasno transfektiran s posnemalcem Mc-novel_miR_145 ali Mc-novel_miR{{2{{37} }}} inhibitor v celice HEK293. (C) Celice HEK293 so bile transficirane z McIL-17-3-30 UTR-WT ali mutantnim tipom McIL-17-3-30 UTR-MUT, skupaj z Mc-novel_miR_145 ali NC , za 24 ur. Aktivnost luciferaze je bila izmerjena z dvojnim luciferaznim reporterskim testnim sistemom. (D) Poskusi z gradientom koncentracije so bili izvedeni za transfekcijo Mc-novel_miR_145. Vsi podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SD iz vsaj treh neodvisnih potrojenih poskusov. **, p < 0,01, *, p < 0,05 v primerjavi s kontrolami. (Za razlago sklicevanj na barvo v tej legendi slike je bralec napoten na spletno različico tega članka.)

2.6. Mc-novel_miR_145 Negativno uravnava izražanje McIL-17-3

Hemociti M. coruscus so bili transfektirani s posnemalcem Mcnovel_miR_145, zaviralcem Mcnovel_miR_145 in njihovimi ustreznimi kontrolami ter spremembami v McIL{{ 5}} izražanje je bilo ocenjeno na ravni transkripcije in beljakovin. Kot je prikazano na sliki 6A, je bilo izražanje Mc-novel_miR_145 znatno povečano (8.83-kratno povečanje) z njegovim posnemanjem in znižano ({{14 }}.41-kratno zmanjšanje) s svojim zaviralcem v hemocitih, kar kaže na učinkovite učinke teh sintetičnih spojin. Na sliki 6B je bila ekspresija endogenega McIL-17-3 znatno zavirana (0.51-kratno zmanjšanje) s posnemalcem Mc-novel_miR_145 ravni transkripcije in znatno induciran (242-kratno povečanje) z zaviralcem Mcnovel_miR_145. Da bi raziskali učinke Mc-novel_miR_145 na izražanje McIL-17-3 na ravni beljakovin, so izdelali poliklonsko protitelo proti McIL-17-3. Kot je prikazano na pasovih 2 in 3 na sliki 6C, je bil rekombinantni protein McIL-17-3 uspešno izražen v E. coli. Specifičnost protiteles smo preiskali s proteinom školjk iz hemocitov z Western blotom. Opažen je bil en pas okoli 22 kDa, ki ustreza molekulski masi McIL-17-3 (proga 4 na sliki 6C). Rezultati Western blota na sliki 6D so pokazali negativno regulacijo McIL-17-3 na ravni beljakovin z Mc-novel_miR_145.

Fslika 6. Mc-novel_miR_145 je zaviral izražanje McIL-17-3 v hemocitih M. coruscus. (A) Ekspresija Mc-novel_miR_145 je bila ocenjena s qPCR v hemocitih, transficiranih s 145 mimiki, 145 inhibitorji in njihovimi ustreznimi kontrolami. (B) Po 24-urni transfekciji so bile transkripcijske ravni McIL-17-3 določene s qPCR. (C) Rekombinantna ekspresija, čiščenje in priprava antiseruma za McIL-17-3. Proga M, standardni marker molekulske mase beljakovin. Proga 1, negativna kontrola (brez indukcije). Proga 2, induciran rekombinantni protein McIL-17-3. Proga 3, prečiščen McIL- 17-3. Proga 4, Western blot s protitelesom proti McIL{{20}} v hemocitih M. coruscus. (D) Po 24-urni transfekciji so bile ravni beljakovin McIL-17-3 določene z Western blotom. ** p < 0,01 v primerjavi s kontrolami

2.7. Apoptoza hemocitov

Stopnja apoptoze hemocitov štirih skupin, tj. NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS in Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS smo analizirali s pretočno citometrijo z dvojnim barvanjem. Potem ko je bil McIL-17-3 čezmerno izražen, je bila stopnja apoptoze hemocitov, izzvanih z LPS, znatno povečana v primerjavi s kontrolno skupino (slika 7A(a,b), B). Ko je bil McIL-17-3 sotransfektiran z Mc-novel_miR_145, se je stopnja apoptoze hemocitov, inducirana z LPS, znatno zmanjšala v primerjavi s stopnjo McIL-17-3, transfektiranega samega (slika 7A( b,c), B). Nasprotno pa je stopnja apoptoze hemocitov pokazala izjemno povečanje v skupini Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS v primerjavi s skupino McIL-17-3+LPS (slika 7A (b,d), B).

Slika 7. Stopnja apoptoze hemocitov je bila ocenjena s pretočno citometrijo z uporabo propidijevega jodida (PI) in barvanja FITC-Annexin-V

3. Razprava

IL-17 velja za eno od pomembnih družin protivnetnih citokinov, ki lahko učinkovito sodelujejo pri patogenezi različnih bolezni [42]. V naši prejšnji študiji je homolog M. coruscus IL-17 pokazal diferencialno izražanje pred in po okužbi z V. alginolyticus s sekvenciranjem transkriptoma [41], kar kaže na njegovo potencialno vlogo pri prirojenem imunskem odzivu na bakterijski izziv. Tu smo opisali ta homolog IL-17 in ga poimenovali McIL-17-3. Napoved funkcionalne domene je razkrila tipično domeno IL-17, ki zagotavlja trenutno identificirano gensko pripadnost družini citokinov IL-17. V filogenetskem drevesu je ta novi gen IL-17 pokazal zelo tesno sorodstvo z IL-17- 3 iz druge vrste Mytilus, M. galloprovincialis. Poleg tega so si delili zelo visoko 95-odstotno identiteto aminokislin, zato smo imenovali trenutni novi gen IL-17 kot McIL-17-3, da bi sledili konvenciji o poimenovanju, ki se uporablja pri vrstah Mytilus. Družina IL-17 je sestavljena iz šestih članov in petih receptorjev pri ljudeh [43], vendar je doživela veliko genetsko ekspanzijo pri morskih nevretenčarjih, zlasti pri školjkah [11]. Na podlagi tega naši podatki kažejo, da McIL-17-3 ni neposredno povezan z nekaterimi geni v človeški družini IL-17. Guba cisteinskega vozla, ki se nahaja na -listih, je tipična značilnost družine IL-17 [5]. Pričakovano je napoved terciarne strukture razkrila gubo cisteinskega vozla v proteinu McIL-17-3, kar je dodatno poglobilo pripisovanje McIL-17-3 družini citokinov IL-17. Za nadaljnje raziskovanje diferenciacije aminokislinskih zaporedij IL-17 med različnimi vrstami, nekaj tipičnih IL-17 školjk in Mus musculus IL-17-A do IL-17-F in Danio rerio IL-17-1 do IL-17-3 so bili izbrani za izvedbo analize večkratne poravnave. Rezultati so pokazali zanimivo ugotovitev, da je bil položaj disulfidne povezave IL-17 v školjkah in vretenčarjih nedosleden: ti dve disulfidni vezi sta obstajali med -verigami 1 in 3, 2 in 4 v školjkah, vendar le med -verige 2 in 4 pri vretenčarjih. Na prvem in četrtem cisteinskem mestu vretenčarski IL-17 zamenjajo cistein s serinom; nasprotno pa na drugem cisteinskem mestu školjke IL-17 nadomestijo cistein s treoninenciacijo pri disulfidni povezavi pri školjkah in vretenčarjih, njegov osnovni mehanizem pa je nejasen in ga je treba dodatno preučiti. Glede na polimorfizem IL-17 v školjkah disulfidna povezava med -verigama 1 in 3 morda ni tako močna kot tista med 2 in 4, kar jim daje večjo plastičnost v školjkah. Kakorkoli že, analiza funkcionalnih domen in terciarne strukture kaže, da je trenutno identificirani McIL-17-3 tipičen za citokin IL-17 školjk in bi lahko imel podobno funkcionalno vlogo kot njegovi dvojniki v mehkužcih. Izražanje genov IL-17 v človeških tkivih je zelo različno, pri čemer so nekateri izraženi le v nekaj celicah, drugi pa v velikem številu tkiv [44,45]. Večina študij o mehkužcih je pokazala, da imajo IL-17 konstitutivni profil izražanja [13,15,17,46,47]. Kljub temu so Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu in Yu [47] pokazali nedosleden rezultat pri C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} in -6 sta bila močno izražena v škrgah C. gigas, prebavnih žlezah in plašču, vendar komaj izražena v drugih tkivih. Tukaj so bili transkripti McIL-17-3 najdeni v vseh pregledanih tkivih, kar kaže na njegove številne funkcionalne vloge pri različnih fizioloških dejavnostih. Vendar pa visoke ravni izražanja McIL-17-3 v nekaterih tkivih mehkužcev, povezanih z imunostjo, kot so hemociti, škrge in prebavne žleze, kažejo na njegovo tesnejšo vpletenost v imunski odziv. Njegova hitra odzivnost na napad V. alginolyticus poglablja to točko. Injiciranje V. alginolyticus je bistveno povečalo izražanje McIL-17-3, podobne rezultate pa so opazili tudi pri drugih IL-17 mehkužcev. Injekcija V. anguillarum v C. gigas je povzročila hitro povečanje številčnosti transkriptov CgIL-17 v hemocitih, kar nakazuje, da gre za imunski gen zgodnje faze [46]. Ko je C. gigas utrpel napad drugega patogena, V. splendidus, je bila tudi raven mRNA CgIL-17-5 v hemocitih znatno povišana [15]. Stimulacija LPS, glavne patogene komponente bakterij, je močno povečala izražanje PfIL-17 v prebavnih žlezah biserne ostrige P. fucata [17]. Poleg tega bi lahko LPS induciral izražanje CgIL-17-3 v C. gigas [47] in PmIL-17-2 v P. fucata martensii [13]. Ti rezultati skupaj kažejo, da je imel IL-17 pomembno vlogo pri imunski obrambi mehkužcev pred napadom bakterij. V tej študiji je McIL-17-3 pokazal aktivacijsko sposobnost spodnje poti NF-κB. Podobne rezultate so opazili tudi pri nekaterih vrstah mehkužcev. Pri biserni ostrigi P. fucata je PfIL-17 prav tako pokazal aktivacijo poti NF-κB v celicah HEK293 s testi reporterja luciferaze [17]. Pri C. gigas je CgIL-17-5 spodbujal aktivacijo CgMAPK in jedrsko translokacijo CgRel in CgAP-1 za spodbujanje ekspresije mRNA citokinov in antibakterijskih peptidov [15]. Dokazano je, da način delovanja IL-17 temelji na njegovi združitvi v dimere (homodimere ali heterodimere), katerih aktivnost je močno odvisna od njihove vezave na receptorje (IL-17Rs), ki jih tarča. Ti receptorji vsebujejo ohranjeno citoplazemsko domeno (SEFIR), ki medsebojno deluje z adapterskimi proteini, da sproži poti signalne transdukcije za aktiviranje transkripcijskih faktorjev, kot je NF-κB, in spodbujanje izražanja imunskih in provnetnih ciljnih genov, kot so citokini in protimikrobni peptidi [ 11,48,49].

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Ti rezultati kažejo, da imajo IL-17 mehkužcev morda enak način delovanja kot njihovi primerki pri vretenčarjih. To je treba potrditi v prihodnjih študijah. Korelacije med miRNA in IL-17 so bile ugotovljene v več modelih človeških bolezni. Niimoto, et al. [50] je potrdil pozitivno korelacijo med ekspresijo miR-146a in IL-17a v mononuklearnih celicah periferne krvi in ​​sinoviju bolnikov z revmatoidnim artritisom ter povzel vitalno funkcijo miR-146a v diferenciacijo celic, ki proizvajajo IL-17-. Pri bolnikih s psoriazo miR-146a deluje kot močan zaviralec vnetja kože, ki ga povzroča IL-17-, in njegove nizke ravni lahko prispevajo k zgodnjemu začetku bolezni pri genetsko dovzetnih posameznikih [51]. MiR-146a lahko izboljša parodontitis z znižanjem izražanja IL-17 in zaviranjem proliferacije izvornih celic človeških parodontalnih ligamentov [52]. MiR-155 negativno uravnava izražanje IL-17 za sodelovanje pri gostiteljevem imunskem odzivu na postvirusno bakterijsko pljučnico v pljučih miši; miR-155 inhibirane miši kažejo močnejšo ekspresijo IL-17 v pljučih, ki jo spremlja izboljšan bakterijski očistek [53]. Te študije kažejo, da IL-17 uravnava več miRNA in se razlikuje glede na bolezen in tip celice [20]. V prejšnji študiji smo izvedli integrirano analizo miRNAome in transkriptoma, da bi raziskali interaktivno regulacijo miRNA-mRNA z M. coruscus kot odziv na okužbo z V. alginolyticus. Rezultati so napovedali, da bi lahko Mc-novel_miR_145 ciljal na McIL-17-3, da bi sodeloval pri prirojenem imunskem odzivu na bakterijsko okužbo [41]. Z namenom poglobljenega raziskovanja osnovnega mehanizma Mcnovel_miR_145 regulacije McIL-17-3 je bila v teh študijah izvedena vrsta laboratorijskih poskusov. Izračun je napovedal, da bi Mc-novel_miR_145 lahko ciljal na 30 UTR McIL-17-3. Naslednji testi reporterja luciferaze, izvedeni v celicah HEK293, sotransfektiranih z Mc-novel_miR_145 mimikom, mimikom NC, inhibitorjem, inhibitorjem NC z McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT reporterjem plazmidi so to točko še dodatno potrdili. Poleg tega so bili Mc-novel_miR_145 mimik, mimični NC, inhibitor in inhibitor NC transfektirani v hemocite M. coruscus, da bi ovrednotili njihove učinke na izražanje McIL-17-3 na ravni transkripcije in beljakovin . Izražanje McIL-17-3 je bilo znatno znižano regulirano v Mc-novel_miR_145 mimični transfekcijski skupini, medtem ko je bilo znatno povečano regulirano v Mc-novel_miR _145 skupina za transfekcijo zaviralcev, kar kaže na negativno regulacijo McIL-17-3 s strani Mc-novel_miR_145. Trenutni rezultati so bili v nasprotju s prejšnjo študijo. Pri Pinctada martensii so Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao in Du [30] ugotovili, da čeprav lahko Pm-miR-29a cilja na IL-17, je bila regulacija pozitivna, saj je izražanje IL{{ 65}} v plašču in škrgah Pinctada martensii je bil povečan po prekomerni ekspresiji Pm-miR-29a. Glede na to, da P. martensii in M. coruscus pripadata školjkam in sta si razmeroma tesno povezana, ti nedosledni rezultati kažejo, da se regulacija IL-17 v mehkužcih lahko razlikuje glede na miRNA. Razen tega nobena literatura ni poročala o korelaciji med miRNA in IL-17 pri mehkužcih, zato ni več vzporednih študij za primerjavo trenutnih rezultatov. Vendar pa je nekaj študij poročalo o ciljnih odnosih med specifičnimi miRNA in specifičnimi imunsko povezanimi geni pri mehkužcih.

Na primer, cgi-miR-2d poveča fagocitozo hemocitov ostrig z negativno regulacijo CgIκB2 v Crassostrea gigas [31]. Poleg tega cgi-miR-2d tudi negativno uravnava izražanje enega gena, podobnega prenašalcu holina, da sodeluje pri prefinjeni imunomodulaciji hemocitov ostrig v zgodnji fazi okužbe [32]. Te študije vsaj kažejo, da imajo miRNA potencialno vlogo pri prirojeni imunski signalizaciji z usmerjanjem na specifične gene v mehkužcih, tako kot pri vretenčarjih. Nato smo skušali raziskati potencialno funkcijo interakcije med Mcnovel_miR_145 in McIL{{10}} v prirojeni imunosti M. coruscus in njuno vlogo pri Apoptoza, ki jo povzroči LPS, je v središču naše pozornosti. LPS je zelo vnetna molekula, ki je sestavni del zunanje ovojnice vseh po Gramu negativnih bakterij. Pokazalo se je, da LPS inducira apoptozo v različnih celicah in tkivih, kot so makrofagi [54], endotelne celice [55] in mišja pljuča [56]. Preliminarni poskus je pokazal, da je izpostavljenost LPS pri nominalni koncentraciji 0,1 mg/mL 24 ur znatno povzročila apoptozo hemocitov iz M. coruscus. Po prekomerni ekspresiji McIL-17-3 se je stopnja apoptoze hemocitov M. coruscus bistveno povečala v primerjavi s kontrolno skupino, kar kaže, da lahko McIL-17-3 okrepi apoptozo hemocitov M. coruscus, ki jo povzroči LPS. Trenutni rezultati so bili skladni z nekaterimi prejšnjimi študijami. Pri človeških nevtrofilcih lahko IL-17A zmanjša anti-apoptotične učinke, ki jih posreduje granulocitni makrofag-kolonijo stimulirajoči faktor [57]. IL-17 inducira apoptozo vaskularnih endotelijskih celic, kar je potencialni mehanizem akutnega koronarnega sindroma [58]. Genetska delecija IL-17A zmanjša apoptozo alveolarnih celic tipa II in tako ublaži kronično obstruktivno pljučno bolezen [59]. Vendar pa še vedno obstaja nekaj nasprotnih argumentov. Ko so miši okužene z virusom Theilerjevega mišjega encefalomielitisa, IL-6 in IL-17 sinergistično spodbujata obstojnost virusa z zaviranjem celične apoptoze [60]. Ti konflikti kažejo, da je osnovni mehanizem apoptoze, ki jo posreduje IL-17-, zapleten in IL-17 lahko igrajo nasprotne funkcije, odvisno od vrste okužbe.

Ko so bili McIL-17-3 sotransficirani z Mc-novel_miR_145, je bila raven apoptoze, inducirane z LPS, znatno znižana v primerjavi z edinim transfektiranim McIL-17-3 V skupini je bila raven apoptoze ustrezno regulirana navzgor, potem ko je bil McIL-17-3 sotransfektiran z zaviralcem Mc-novel_miR_145. Dokazano je, da Mc-novel_miR_145 negativno uravnava McIL-17-3, zato smo zaključili, da McIL-17-3 poslabša apoptozo hemocitov, ki jo povzroča LPS, medtem ko Mc-novel _miR_145 je omilil učinke. V zadnjih nekaj letih so pri mehkužcih odkrili več miRNA, za katere se je izkazalo, da sodelujejo pri apoptozi človeških in mišjih celic. Na primer, miR-125b in miR- 335 sta bila najdena v ploščati ostrigi Ostrea edulis [21], miR-184 je bila najdena v hemocitih ostrig Crassostrea gigas [23] in miR{{ 26}}, -29, -96, -182 in -193 so bili najdeni v regeneracijskem centralnem živčnem sistemu L. stagnalis [25]. Te miRNA, povezane z apoptozo, identificirane z visoko zmogljivim sekvenciranjem in biološkimi izračuni, potrjujejo obstoj apoptoze, posredovane z miRNA, pri mehkužcih. Chen et al. poročali o povečani regulaciji miR-2d po izzivu Vibrio splendidus v hemocitih Crassostrea gigas. Prekomerna ekspresija miR-2d je bila povezana z zmanjšano ekspresijo IκB2 in znatnim povečanjem stopnje fagocitoze hemocitov, povezano z zaviranjem apoptoze [31]. Rezultati so bili skladni z našo trenutno študijo, skupaj pa se zdi, da nakazujejo, da miRNA izvajajo zaviralno funkcijo na apoptozo celic pri mehkužcih. Pravzaprav je večina z apoptozo povezanih miRNA pri ljudeh pokazala zaviralne učinke na apoptozo. MiR-146 ščiti celice A549 in H1975 pred apoptozo, ki jo povzroči LPS, in vnetno poškodbo prek povečane regulacije Sirt1 in tako blokira poti NF-κB in Notch [61]. Poleg tega miR-146 oslabi apoptozo hepatocitov, ki jo povzroči obsevanje in LPS, z zaviranjem poti TLR4 [62]. MiR-93 zavira apoptozo hondrocitov pri osteoartritisu z usmerjanjem na signalno pot TLR4/NF-κB [63]. MiR-129-5p lajša poškodbe hrbtenjače pri miših z zaviranjem apoptoze prek poti HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. Vendar pa še vedno obstaja nekaj specifičnih miRNA, ki kažejo ojačitvene učinke na apoptozo. Ugotovljeno je bilo na primer, da miR-203 pospeši apoptozo, ki jo povzroča LPS, tako da cilja na PIK3CA v alveolarnih epitelnih celicah [65]. Ti rezultati kažejo na zapletenost osnovnega mehanizma apoptoze, ki jo posreduje miRNA.

4. Materiali in metode

4.1. Eksperimentalno načrtovanje

Najprej je bil McIL-17-3 identificiran in karakteriziran iz M. coruscus z bioinformacijsko analizo. Po tem so tkivno porazdelitev transkriptov McIL-17-3 in njegov odziv na bakterijski izziv ocenili s kvantitativnimi testi PCR v realnem času (qPCR). Nato je bila povezava med McIL-17-3 in Mc-novel_miR_145 določena z analizo reporterja luciferaze, izvedeno v celicah HEK293 in hemocitih M. coruscus. Poleg tega je bila njihova funkcionalna vloga pri apoptozi, ki jo povzroča LPS, ocenjena s pretočno citometrijo.

4.2. Umetna morska voda

Po treh dneh prezračevanja komunalne vode iz pipe smo dodali instant morski kristal (Haiding LTD, Ji'an, Kitajska), temeljito premešali in stopili, da smo dosegli slanost 30 ‰. Konfigurirano umetno morsko vodo je treba pred uporabo prezračevati 2 uri.

4.3. Živali

Klapavica z debelim oklepom M. coruscus (dolžina oklepa 9,82 ± 0,53 cm; širina oklepa 4,68 ± 0,45 cm; mokra teža 71,2 ± 2,7 g) je bila kupljena na tržnici Donghe v mestu Zhoushan, provinca Zhejiang, Kitajska. Vse školjke so bile več kot en teden pred nadaljnjimi poskusi shranjene v rezervoarjih, napolnjenih z ASW približno 25 ◦C in slanostjo 30‰.

4.4. Identifikacija cDNA McIL-17-3

Homolog IL-17 (McIL-17-3) je bil in silico kloniran iz polnega transkriptoma M. coruscus (pristopna številka: PRJNA798880, F01_transkript_12404). Postopek Blast je bil izveden za napoved domnevnega aminokislinskega zaporedja McIL-17-3, čemur je sledila analiza funkcionalne domene s SMART in ocena filogenetskega razmerja z MEGA-X. Večkratna poravnava je bila izvedena s postopkom ClustalW. Švicarski model in združenje sta bila uporabljena za napovedovanje terciarne strukture proteina McIL-17-3. Podroben postopek je bil v skladu z našo prejšnjo študijo [66].

4.5. Kvantitativni PCR testi v realnem času

Kvantitativni testi PCR v realnem času (qPCR) so močno orodje za odkrivanje in merjenje ravni izražanja genov. Tu je bila porazdelitev McIL-17-3 v tkivih ocenjena z metodo qPCR. Poleg tega so bile s qPCR odkrite tudi spremembe v izražanju mRNA McIL-17-3 kot odziv na bakterijsko okužbo. Profil tkivne porazdelitve McIL-17-3 je bil določen v škrgah, plašču, prebavnih žlezah, gonadi, adduktorski mišici in hemocitih z uporabo qPCR, programiranega pri 95 ◦C za 10 minuto, čemur je sledilo 40 ciklov po 95 ◦C za 10 s, 60 ◦C za 45 s. Ta tkiva so bila secirana iz devetih posameznikov školjk in združena skupaj, da bi ublažili individualno diferenciacijo. V eksperimentu z bakterijskim izzivom je bil kot imunski dražljaj uporabljen živ V. alginolyticus. Volumen 100 µL bakterij, raztopljenih v morski vodi (1 × 108 CFU mL-1), smo vbrizgali v adduktor školjk. Za kontrolo niso bile uporabljene nobene vbrizgane školjke. Iz vsake skupine je bilo naključno vzorčenih devet školjk 0, 3, 6, 12, 24 in 36 ur po izzivu (hpc). Hemociti iz treh školjk so bili združeni, da se štejejo za en vzorec, in za vsako časovno točko so bili trije vzorci. MikroRNA smo ekstrahirali s kompletom za ekstrakcijo miRNA (HaiGENE, kat. št.: B1802), cDNA pa smo sintetizirali s kompletom miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, kat. št.: 4992786) in qPCR smo izvedli z uporabo komplet miRcute Plus miRNA qPCR (Tiangen, kat. št.: 4992887). Geni U6 in -actin so bili uporabljeni kot interne reference za qPCR oziroma miRNA qPCR. Specifični pari primerjev, uporabljeni v tem poskusu, so navedeni v tabeli 1. Relativne ravni izražanja so bile izmerjene z uporabo metode 2−∆∆Ct [67].

Tabela 1. Pari primerjev PCR so bili uporabljeni v tej študiji.

4.6. Celična kultura

Celice HEK293 sesalcev (RiboBio Ltd., Guangzhou, Kitajska) so bile uporabljene za izvedbo testov reporterja luciferaze za določitev spodnje aktivacije z McIL- 17-3 kot tudi povezave med Mc-novel_miR{{ 4}} in McIL-17-3. Celice HEK293 smo gojili v gojišču OPTI-MEM (GIBCO) pri 37 ◦C, 5 % CO2. Za nadaljnje raziskovanje regulacije McIL-17-3 z Mc-novel_miR_145 in njihove funkcionalne vloge pri apoptozi, ki jo povzroča LPS, so bili hemociti M. coruscus pridobljeni iz adduktorske mišice vsakega školjko z iglo za enkratno uporabo s premerom 0.5 mm (25 G), ki vsebuje 0.5 ml antikoagulanta. Hemocite smo zbrali s centrifugiranjem 5 minut pri 3000 obratih na minuto, 4 ◦C in dodali 0,25 % tripsina (Solarbio). Hemocite smo suspendirali v mediju L-15, ki je vseboval 15 % fetalnega govejega seruma (Solarbio) in gojili pri 26 ◦C s 5 % CO2.

4.7. Sinteza posnemovalca in zaviralca miRNA

Mc-novel_miR_145 mimik, inhibitor in kontrolne nukleotide je sestavil GenePharma (Šanghaj). Njihovo zaporedje je naslednje: Mc-roman_miR_145 mimik, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-novel_miR_145 inhibitor, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (kemično modificiran z 20 Ome); posnemalec negativne kontrole, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; in zaviralec negativne kontrole, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (kemično spremenjen z 20 Ome).

4.8. Luciferazna reporter analiza

Luciferazni reporterski testi se pogosto uporabljajo za proučevanje izražanja genov in regulativne aktivnosti. Količina proizvedene svetlobe je sorazmerna s količino proizvedenega encima luciferaze, ki nato odraža aktivnost regulatornega elementa. Aktivnost luciferaze se nato izmeri z luminometrom, rezultati pa se analizirajo in interpretirajo za določitev regulatorne aktivnosti proučevanega elementa. Za analizo nadaljnje aktivacije McIL{{0}} so bili uporabljeni reporterski testi luciferaze. V tem poskusu je plazmid pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5 in 1.0 µg/jamico) skupaj s pGLNF-κb- luc reporterski plazmid (0,25 µg/vdolbino) so transfektirali v celice HEK293 z uporabo Lipo6000TM 24 ur. Prazen plazmid pEGFP-N1 smo uporabili kot kontrolo. Aktivnost luciferaze je bila izmerjena s sistemom Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, ZDA) v skladu s specifikacijo, pri čemer je bila kot interkontrola uporabljena luciferaza Renilla. Mc-novel_miR_145, ki cilja na McIL-17-3, so potrdili tudi reporterski testi luciferaze. Bioinformatični izračun je napovedal, da lahko Mc-novel_miR_145 cilja na 30 -UTR McIL-17-3, in nato kloniral 30 -UTR McIL{{ 29}} v luciferazni reporterski vektor pmiR-RB-ReportTM za konstruiranje divjega reporterskega plazmida McIL-17-3-30 UTR-WT. Reporterski vektor McIL-17-3-30 UTR-MUT mutantnega tipa je bil konstruiran z mutacijo nukleotida na 1023–1040 mestih: TCCGAAGCGCTTTTCTGG v AGGCTTCGCGAAGACC. Oligo RNA (Mc-novel_miR_196 NC, mimik, NCi, inhibitor) je bil transfektiran skupaj z McIL-17-3- 3 0 UTR-WT ali McIL-17-3-30 UTR-MUT v HEK293 celic z uporabo Lipo6000TM.

4.9. Rekombinantna ekspresija, čiščenje in priprava antiseruma

Za oceno učinka Mc-novel_miR_145 na izražanje proteina McIL-17-3 smo pripravili antiserum McIL-17-3. Fragment cDNA, ki pokriva odprti bralni okvir (ORF) McIL-17-3, je bil pomnožen z enim specifičnim parom primerjev (tabela 1) in vstavljen v vektor pET-32a. Rekombinantni plazmid pET-32a-McIL{{10}} smo transformirali v Escherichia coli (DE3) (Takara) in inkubirali v gojišču LB (ki vsebuje 50 mg L-1 kanamicin) pri 37 ◦C s stresanjem pri 130 obratih na minuto 4 ure. Ko je optična gostota dosegla absorbanco 0.6 pri 600 nm, smo bakterijski raztopini dodali izopropil-beta-D-tiogalaktopijo znotraj (IPTG) s končno koncentracijo 1 mM, da induciramo izražanje rekombinantnega McIL{ {24}} protein (rMcIL-17-3). Po 6-urni inkubaciji pri 37 °C smo medij 30 minut centrifugirali pri 8000 obratih na minuto, da smo zbrali bakterije, čemur je sledila suspenzija v pufru TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). rMcIL-17-3 smo očistili z afinitetno kromatografijo z Ni-nitrilotriocetno kislino (NI-NTA) in očiščen protein 24 ur dializirali iz imidazola. Nastali protein smo izolirali z redukcijsko elektroforezo v 12 % SDS-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE). Očiščeni protein je bil ponovno zvit v gradientu urea-TBS glicerolnega pufra (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM reduciranega glutationa, 10 % glicerola, 0,2 mM oksidnega glutationa, koncentracija gradienta sečnine 6, 4, 3, 2 , 1 in 0 M sečnine v vsakem gradientu, pH 7,4, vsak gradient pri 4 ◦C 12 h). Nato je bil dobljeni protein uporabljen za imunizacijo 6-tednov starih miši, da pridobijo poliklonska protitelesa.

4.10. Western Blotting

Vzorce beljakovin smo ekstrahirali iz hemocitov z liznim pufrom RIPA (Beyotime), nato pa smo koncentracijo zaznali s kompletom BCA. Po izolaciji s SDS-PAGE smo protein prenesli na PVDF membrane z zapiranjem s 5% posnetim mlekom v prahu v TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8,0), čemur je sledila inkubacija protiteles proti McIL-17-3 čez noč. Nato so bile membrane 3 ure inkubirane z razredčeno raztopino kozjega protitelesa IgG proti miši in konjugata alkalne fosfataze (Thermo Fisher Scientific, kat. št.: 31324) v pufru za redčenje sekundarnega protitelesa (Beyotime, P0258). Končno je imunoreaktivne proteine ​​zaznal sistem za zaznavanje ECL.

4.11. Apoptoza

Apoptozo hemocitov smo ocenili s pretočno citometrijo v skladu s priročnikom kompleta za odkrivanje apoptoze FITC-Annexin-V (Beyotime). Na kratko, zbrane hemocite smo 24 ur obdelovali z LPS (0.1 mg/mL), 20 nM plazmida pEGFP-McIL-17-3, Mc novel_miR{{9} } posnemalec in inhibitor Mc-novel_miR_145. Po izpiranju s PBS smo celice ponovno suspendirali v mediju L15 pri končni koncentraciji 1 × 106 celic mL-1 in jih obarvali s FITC-Aneksinom-V in PI tako, da smo jih inkubirali pri sobni temperaturi 25 minut v temi. . Končno je bil uporabljen instrument za pretočno citometrijo (Beckman CytoFLEX FCM) za odkrivanje celične apoptoze, podatki pa so bili analizirani s programsko opremo FlowJoTM 10. 4.12. Statistična analiza Eksperimentalni rezultati so bili predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD). Rezultati so bili obdelani z uporabo dvosmerne ANOVA analize variance s Tukeyjevim testom večkratnih primerjav, za analizo podatkov in izdelavo številk pa je bila uporabljena programska oprema Origin2021.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

5. Sklepi

V tej študiji je bil nov homolog IL-17, McIL-17-3, identificiran iz M. coruscus in ugotovljeno je bilo, da igra ključno vlogo pri imunski obrambi mehkužcev pred napadom bakterij. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da McIL-17-3 negativno regulira Mc-novel_miR_145, kar prispeva k njegovi udeležbi pri apoptozi, ki jo povzroča LPS. Rezultati te študije zagotavljajo dragocen vpogled v regulativno vlogo IL-17 v imunskem odzivu školjk in poudarjajo potencial nekodirajoče RNA pri uravnavanju mehanizmov imunske obrambe nevretenčarjev. Vendar je pomembno opozoriti, da v tej študiji obstajajo nekatere omejitve. Natančneje, mehanizem, na katerem temelji način delovanja McIL-17-3, ni bil raziskan in zahteva nadaljnje preiskave. Poleg tega se je ta študija osredotočila le na interakcijo med Mc-novel_miR_145 in McIL-17-3 in ni raziskala morebitne vpletenosti drugih miRNA v imunski odziv. Na splošno ta študija poudarja pomembno vlogo nekodirajoče RNA v mehanizmih imunske obrambe in nakazuje, da bi lahko njihova modulacija služila kot potencialna strategija za ciljno usmerjene terapije za različne bolezni.

Reference

1. Medžitov, R.; Janeway, C., Jr. Prirojena imunost. N. angl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]

2. Lacy, P.; Stow, JL. Sproščanje citokinov iz prirojenih imunskih celic: povezava z različnimi potmi trgovanja z membrano. Blood J. Am. Soc. Hematol. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]

3. Dinarello, CA Provnetni citokini. Skrinja 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]

4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Imunski sistem in imunski odzivi pri ribah in njihova vloga v primerjalni študiji imunosti: model za višje organizme. Immunol. Lett. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]

5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17s sprejmejo gubo cistinskega vozla: Struktura in aktivnost novega citokina, IL-17F, in posledice za vezavo na receptor. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]

6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, JP Faktorji IL17 so zgodnji regulatorji v epiteliju črevesja med vnetnim odzivom na Vibrio v ličinki morskega ježka. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]

7. Cua, DJ; Tato, CM Prirojene celice, ki proizvajajo IL-17-: stražarji imunskega sistema. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 479–489. [CrossRef]

8. Mills, KH IL{1}} in IL-17-proizvajajoče celice v zaščiti proti patologiji. Nat. Rev. Immunol. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]

9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Imunski genski repertoar je kodiran v genomu vijoličnega morskega ježka. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]

10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS. Genom hobotnice in razvoj nevronskih in morfoloških novosti glavonožcev. Narava 2015, 524, 220–224. [CrossRef]

11. Šačo, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Razvoj in raznolikost interlevkina-17 poudarjata širitev pri morskih nevretenčarjih in njegovo ohranjeno vlogo pri imunosti sluznice. Spredaj. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Ogromna variacija prisotnosti in odsotnosti genov oblikuje odprt pan-genom v sredozemski školjki. Genome Biol. 2020, 21, 1–21. [CrossRef]

13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Razvoj in analiza delovanja gena za interlevkin -17 iz Pinctada fucata martensii. Ribe školjke Immunol. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Q.; Xiao, G.; Hu, G.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interlevkin-17D posreduje z okužbo Vibrio harveyi povezane spremembe pri Tegillarca granulosa z aktivacijo aktivatorskega proteina 1 in vivo. Akvakultura 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. Lv, X.; Sonce, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 uravnava izražanje mRNA imunskih efektorjev z indukcijo fosforilacije CgMAPK in jedrske translokacije CgRel in CgAP-1 v pacifiški ostrigi Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. Wang, L.; Sonce, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 ureja izražanje IL17-4 in IL17-5 pri pacifiški ostrigi Crassostrea gigas. Ribe školjke Immunol. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]

17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; On, M.-X. Interlevkin-17 v biserni ostrigi (Pinctada fucata): molekularno kloniranje in funkcionalna karakterizacija. Ribe školjke Immunol. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]

18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, starodavni vnetni citokin v Crassostrea gigas, ki kaže funkcije heterogenosti v primerjavi z molekulami interlevkina17 vretenčarjev. Dev. Comp. Immunol. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]

19. Denli, AM; Vrhovi, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Obdelava primarnih mikroRNA z mikroprocesorskim kompleksom. Narava 2004, 432, 231–235. [CrossRef]

20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Regulacija IL-17 pri avtoimunskih boleznih s transkripcijskimi faktorji in mikroRNA. Spredaj. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]

21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Vloga mikroRNA v imunskem procesu ravne ostrige Ostrea edulis proti bonamiozi. Okužiti. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]

22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Identifikacija ohranjenih in novih mikroRNA v pacifiški ostrigi Crassostrea gigas z globokim sekvenciranjem. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]

23. Zhou, Z.; Wang, L.; Pesem, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Identifikacija in značilnosti imunsko povezanih mikroRNA v hemocitih ostrig Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Potencialna regulacija mikroRNA imunsko povezanih genov v hemocitih nevretenčarjev. Sci. Totalno okolje. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]

25. Walker, SE; Spencer, GE; Nekakov, A.; Carlone, RL Identifikacija in karakterizacija mikroRNA med regeneracijo osrednjega živčnega sistema mehkužcev, ki jo povzroča retinojska kislina. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. Stresni odziv, ki ga posreduje mikroRNA, pri vrstah školjk. Ecotoxicol. Okolje. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Odkritje in funkcionalno razumevanje miRNA v mehkužcih: pristop profiliranja celotnega genoma. RNA Biol. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]

28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Kopanje miRNAomov školjk: med ohranjanjem in inovacijami. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]

29. Sonce, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, ​​J.; Liu, Z. Ekspresijski podpis mikroRNA v progastih in gladkih adduktorskih mišicah Yesso pokrovače Patinopecten yessoensis. Genomika 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. Tian, ​​R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a je sodeloval pri tvorbi sedefa in imunskem odzivu z usmerjanjem Y2R v Pinctada martensii. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]

31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. Za nevretenčarje specifična in imunsko odzivna mikroRNA poveča fagocitozo hemocitov ostrig z usmerjanjem na CgIκB2. Sci. Rep. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. MiRNA, specifična za nevretenčarje, je ciljala na starodavni holinergični nevroendokrini sistem ostrig. Odpri Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]

33. Chen, H.; Xin, L.; Pesem, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. MiRNA, ki se odziva na norepinefrin, neposredno spodbuja ekspresijo CgHSP90AA1 v hemocitih ostrig med sušenjem. Ribe školjke Immunol. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]

34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Kalmodulin, ki ga cilja miRNA oder659_26519, uravnava izražanje IL-17 v zgodnjem imunskem odzivu ostrig Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 modulira protibakterijske aktivnosti celomocitov in pripravo LPS prek ciljanja na Tollip v Apostichopus japonicus. Ribe školjke Immunol. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]

36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 modulira dihalni izbruh v celomocitih Apostichopus japonicus preko ciljanja Toll-u podobnega receptorja. Dev. Comp. Immunol. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]

37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a uravnava apoptozo celomocitov v morski kumari Apostichopus japonicus s ciljanjem na Aj14-3-3ζ in vivo. Ribe školjke Immunol. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]

38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 povezuje metabolizem lipidov in celično apoptozo pri Apostichopus japonicus, okuženem z bakterijami, prek ciljanja na CTRP9. Spredaj. Immunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]

39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 iz Apostichopus japonicus zavira apoptozo celomocitov in deluje kot miR-92goba za uravnavanje izražanja Bax kot odziv na okužbo z Vibrio splendidus. Akvakultura 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; On, J.; Xu, X. MikroRNA-1–posredovana inhibicija poti NF-κB s potjo JAK-STAT pri nevretenčarju Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]

41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. Integrirana analiza miRNAome in transkriptoma razkriva regulacijo omrežja miRNA-mRNA v debeli školjki Mytilus coruscus, okuženi z Vibrio alginolyticus. Mol. Immunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]

42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martin, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Kritična vloga interlevkina (IL) -17 pri vnetnih in imunskih motnjah: posodobljen pregled dokazov, ki se osredotočajo na spore. avtoimunska. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. družina citokinov IL-17. J. Alergijska klinika. Immunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]

44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Vrhunsko: IL-17D, nov član družine IL-17, spodbuja proizvodnjo citokinov in zavira hemopoezo. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]

45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. Družina citokinov IL-17. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]

46. ​​Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Hitro kopičenje transkripta homologa interlevkina 17 v hemocitih Crassostrea gigas po izpostavljenosti bakterijam. Dev. Comp. Immunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]

47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Genomska karakterizacija in analiza izražanja petih novih genov IL-17 v pacifiški ostrigi, Crassostrea gigas. Ribe školjke Immunol. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]

48. Gaffen, SL Struktura in signalizacija v družini receptorjev IL-17. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]

49. Hata, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 stimulira vnetne odzive preko NF-κB in MAP kinaznih poti v človeških miofibroblastih debelega črevesa. Am. J. Physiol. - Gastrointest. Liver Physiol. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]

50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MikroRNA-146a se izraža v celicah T, ki proizvajajo interlevkin-17, pri bolnikih z revmatoidnim artritisom. BMC mišično-skelet. Disord. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]

52. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a zavira IL-17-posredovano vnetje kože in je genetsko povezano z luskavico. J. Alergijska klinika. Immunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]

52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG mikroRNA-146a zniža IL-17 in IL-35 ter zavira proliferacijo izvornih celic človeških parodontalnih ligamentov. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]

53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 uravnava imunski odziv gostitelja na povirusno bakterijsko pljučnico preko poti IL-23/IL-17. Am. J. Physiol. - Pljučna celica. Mol. Physiol. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]

54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, Č.; Celada, A. LPS inducira apoptozo v makrofagih večinoma z avtokrino proizvodnjo TNF-. Blood J. Am. Soc. Hematol. 2000, 95, 3823–3831.

55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Mehanizmi endotelne apoptoze, povzročene z bakterijskimi lipopolisaharidi. Am. J. Physiol.-Lung Cell. Mol. Physiol. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]

56. Brass, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Kronično vdihavanje LPS povzroči emfizemu podobne spremembe v mišjih pljučih, ki so povezane z apoptozo. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]

57. Zmaj, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 oslabi anti-apoptotične učinke GM-CSF v človeških nevtrofilcih. Mol. Immunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]

58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Ma, C.; Zhang, L. IL-17 inducira apoptozo vaskularnih endotelijskih celic – potencialni mehanizem za akutni koronarni sindrom pri človeku. Clin. Immunol. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]

59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Genetska delecija IL-17A zmanjša vnetje, ki ga povzroča cigaretni dim, in apoptozo alveolarnih celic tipa II. Am. J. Physiol. - Pljučna celica. Mol. Physiol. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]

60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS. Interlevkin-6 (IL-6) in IL-17 sinergistično spodbujata obstojnost virusa z zaviranjem celične apoptoze in citotoksične T-celične funkcije. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]

61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 ščiti celice A549 in H1975 pred apoptozo, ki jo povzroči LPS, in vnetno poškodbo. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]

62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p oslabi z obsevanjem povzročeno in LPS povzročeno aktivacijo jetrnih zvezdastih celic in apoptozo hepatocitov z zaviranjem poti TLR4. Cell Death Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]

63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 zavira apoptozo hondrocitov in vnetje pri osteoartritisu z usmerjanjem na signalno pot TLR4/NF-κB. Int. J. Mol. med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]

64. Wan, G.; Kaj.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p lajša poškodbe hrbtenjače pri miših z zaviranjem apoptoze in vnetnega odziva prek poti HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 pospešuje apoptozo v alveolarnih epitelijskih celicah, ki jih spodbuja LPS, tako da cilja na PIK3CA. Biochem. Biophys. Res. Komun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. Molekula Nrf2 sproži antioksidativno obrambo pred akutno izpostavljenostjo benzo(a)pirenu v debeli školjki Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Analiza podatkov PCR v realnem času s primerjalno CT metodo. Nat. protokol 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]