Zunajcelični vezikli kot novi akterji pri boleznih ledvic

"Urin nam lahko iz dneva v dan, iz meseca v mesec in iz leta v leto zagotavlja zaporedno zgodbo o glavnih dogodkih v ledvicah." Dr. Thomas Addis, pionir ledvične fiziologije, je leta 1948 prišel do tega zaključka. Odkritje urinskih zunajceličnih veziklov (uEV) kot molekularnih posnemalcev ledvičnih celic je njegov pogled dvignilo na novo raven (slika 1). uEV vključujejo vezikle nano velikosti, ki brstijo navzven iz celične plazemske membrane zdravih ali umirajočih celic (mikrovezikli ali apoptotična telesca) ali se izločajo preko multivezikularnih teles v reguliranem procesu (eksosomi). V skladu z mnenjem dr. Addisa vsebujejo uEV markerje, specifične za bolezen in mesto, iz celic, ki obdajajo ledvične tubule in urinarni trakt,1 zaradi česar so neprecenljiv dodatek k markerjem ledvične disfunkcije, kot sta serumski kreatinin in proteinurija, ki sta nespecifična in poznejša. manifestirati. Razvijajoči se dokazi kažejo, da imajo uEV potencial za napovedovanje bolezni prej kot običajni markerji. Dejansko je bil prvi biomarker, ki temelji na uEV, nedavno odobren s področja urologije, kjer podpis uEV RNA služi kot neinvazivna presejalna metoda za raka prostate. Razen njihove vloge pri diagnozi in prognozi se uEV vse bolj preučujejo kot novi posredniki v mehanizmih ledvične bolezni in v kontekstu regenerativne medicine. Pred kratkim je Delovna skupina za urin Mednarodnega združenja zunajceličnih veziklov objavila izjavo o stališču, da bi izboljšali natančnost in standardizacijo analize uEV in pospešili klinično uporabo uEV.

Kliknite za fiziološko raztopino cistanche za ledvice

1 uEVs ZA DIAGNOSTIKO IN PROGNOZO

Uporaba uEV za diagnozo in prognozo v tekočih biopsijah je odvisna od dejstva, da zunajcelični vezikli (EV) ohranijo lastnosti celice, iz katere so oblikovani. Diagnostične študije uEV lahko na splošno razdelimo na dva pristopa: (1) pristope, osredotočene na analizo enega EV (na primer z analizo sledenja nanodelcev ali pretočno citometrijo) in (2) pristope, osredotočene na skupno analizo EV, kot je proteomika ali profiliranje RNA . Poudarek pristopov z enim EV je na splošno štetje uEV in ciljno fenotipiziranje, kot je odkrivanje izvorne celice EV in specifičnega tovora iz glomerularnih in tubularnih celic. Zgodnje študije so pokazale, da lahko zvišanje ravni uEV kaže na osnovno bolezen. Na primer, EV podocitov v urinu so bili povečani pri diabetični ledvični bolezni pred albuminurijo,2 in o zvišanju subpopulacij uEV pri preeklampsiji.3 Številne zgodnje študije so opazne zaradi heterogenosti v metodologiji in kasnejših izzivih z zunanjo validacijo. Številni uporabljajo neoptimalne instrumente, nimajo ustreznih kontrol ali validacije protiteles in ne vključujejo ortogonalnih pristopov za potrditev izolacije veziklov. Nedavna študija prikazuje sodoben pristop za oceno uEV s pretočno citometrijo, ki bo bistvenega pomena za prehod z raziskovalnega orodja na klinični test.4

Uporablja se celovita validacija izolacije veziklov, vključno z več proteinskimi markerji. Avtorji so vzpostavili tudi ključne kontrole: pufer, pufer plus reagenti, uEVs brez reagentov in pripravek liziranih veziklov za zmanjšanje lažno pozitivnih rezultatov, kot tudi kroglice "molekul ekvivalentnega topnega fluorokroma" za standardizacijo enot fluorescenčne intenzivnosti. Ti ključni koraki bodo omogočili medlaboratorijsko primerjavo rezultatov ne glede na instrument ali programsko opremo. Drugi pristop k diagnostiki uEV je skupna ocena vsebnosti uEV. Temeljna študija Pisitkun et al.5 iz leta 2004 je ugotovila izvedljivost proteomske ocene uEV in opredelila temeljne izzive, kot je interferenca Tamm-Horsfall proteina. Podobni pristopi k oceni tovora EV so bili opisani za nukleinske kisline, lipide in metabolite, vezane na EV. Ključna predpostavka pri sklepanju o spremembah ledvic na podlagi tistih, ki jih opazimo pri uEV, je, da molekularna sestava uEV odraža sestavo ledvic. Zdi se, da nedavno delo Wu et al.6 to podpira. Z uporabo proteomskega pristopa so avtorji pokazali močne korelacije med proteini uEV in tistimi, ki jih najdemo v celih ledvicah. Spremembe izražanja beljakovin v celih ledvicah po fiziološki stimulaciji (visok K1) so se odrazile v uEV, ki zagotavljajo močno podporo uporabi uEV kot nadomestnih meril ledvične patologije.

uEVs ZA DELOVANJE IN REGENERACIJO

Vse več je zanimanja za funkcionalno in regenerativno vlogo uEV. Celice lahko komunicirajo s sproščanjem EV, ki modulirajo procese v prejemnih celicah.7–9 V ledvicah so bile opisane tri vrste takšne komunikacije: (1) intranefronska komunikacija, ki lahko pojasni, kako glomerularna (npr. poškodba podocitov s proteinurijo) in tubularna poškodba (npr. hipoksija) povzroči intersticijsko fibrozo,9 (2) intratubularno komunikacijo (med tubularnimi segmenti),7 in (3) komunikacijo med cirkulacijo in ledvicami, kar je bilo dokazano pri bolnikih z aktivnim vaskulitisom in dokazano nosi B{{7} }kininske receptorje.8 Razumevanje signalnih poti, ki izvirajo iz uEV, bi lahko na koncu vodilo do novih terapevtskih ciljev pri ledvični bolezni. Vendar pa je za funkcionalne študije pomembno preučevati čiste pripravke EV in primerjati te frakcije z izoliranim materialom, ki ni EV (»EV corona« ali eluat, ki ni EV).1

Raziskovalec začenja prevajati ugotovitve in vitro v modele in vivo, vključno z uporabo označenih ali označenih EV, in potrjevati ugotovitve v človeških kohortah. Na primer, Lv et al.10 so uporabili transwell sistem kulture, da bi dokazali, da tubularne epitelne celice, stimulirane z albuminom, proizvajajo EV, ki vsebujejo vnetne citokine CC Motif Chemokine Ligand 2 (CCL2). EV iz teh z albuminom obdelanih tubularnih epitelijskih celic so bili injicirani v miši in povzročili tubularno poškodbo v in vivo modelu. Poleg tega so sporočilno RNK CCL2 v uEV našli pri bolnikih s proteinurično nefropatijo IgA, kar podpira translacijski potencial.10 Terapevtsko vlogo EV, pridobljenih iz matičnih celic, so že dolgo preučevali pri akutni ledvični bolezni in kronični ledvični bolezni. Pred kratkim je bila regenerativna vloga uEV zdravih darovalcev dokazana v modelu AKI, ki ga povzroča glicerol.11 uEV so izboljšali okrevanje ledvic, spodbudili proliferacijo tubularnih celic in zmanjšali izražanje markerjev vnetja in poškodb ter obnovili endogeno izgubo Klotho. Avtorji so izvedli dodatne korake čiščenja, da bi pridobili čiste EV, temeljito karakterizacijo EV EV (CD81, CD63) in beljakovine, ki niso povezane z EV (kalretikulin). Avtorji so vključili tudi več ključnih kontrol, vključno z ne-EV frakcijami in EV iz neledvičnih virov.

PRIHODNJE USMERITVE

UEV so preučevali 0,17 let od glavne objave Pisitkun et al.5 leta 2004. Zakaj se zanimanje za uEV kot nove akterje pri boleznih ledvic vedno veča? Pravzaprav je leto 2004 začelo dobo vse večje strogosti v študijah uEV, kjer je področje postopoma premagalo ključne ovire za klinično uporabo. Ugotovljena je bila biologija in nakladanje tovora EV; Razvite so bile nove izolacijske metode, ki so vodile do čistejših izolatov EV.1 Razviti so bili označevalci kakovosti, raziskane in potrjene metode normalizacije uEV, uvedene pa so bile 12 in minimalne zahteve za poročanje (pregledano v ref. 1). Medtem se je raziskava uEV vedno povečala zaradi obljub, ki jih imajo uEV. Najpomembneje je, da so uEV obogatene "košare" informacij o molekularnih procesih in poteh, ki jih je mogoče izslediti do ene vrste celice. Tako so potencialno bolj občutljivi kot izločene beljakovine ali RNA v urinu in so lahko tudi bolj specifični. Dejansko je bilo izvedenih več poskusov preučevanja električnih vozil, specifičnih za določene segmente tubulov. Vendar pa je to še vedno izziv, saj številni proteinski označevalci prepoznajo samo znotrajcelične epitope, kar lahko zahteva permeabilizacijo uEV z detergenti.12 Seznam proteinov, ki se lahko uporabljajo v ta namen, kot je opisano v nedavno objavljenem dokumentu o stališču uEV.1 Čeprav je izolacija uEV je še vedno zelo zamuden in delovno intenziven, visoko zmogljive metode karakterizacije uEV se razvijajo in karakterizirajo12 s potencialom za pospešitev procesa pridobivanja klinično uporabnih ledvičnih biomarkerjev, kot so markerji zavrnitve presadka, ki bi lahko zaobšli potrebo po biopsija ledvic.13 Mnogi od teh napredkov so povečali kompleksnost informacij, ki jih je mogoče pridobiti iz uEV. Zato so se trenutni izzivi preusmerili od iskanja metod izolacije in karakterizacije, ki so dovolj občutljive za preučevanje teh novih glasnikov, k izboljšanju specifičnosti z (nadaljnjo) optimizacijo metod normalizacije, nadzora kakovosti in temeljitega poročanja. Tukaj razširjamo priporočila iz dokumenta o stališču uEV1 z izbrano zbirko virov za raziskave uEV (tabela 1). Končno bo reševanje teh izzivov vodilo do hitrih in natančnih metod z nizkimi variacijami, ki so potrebne za klinično uporabo. Ti naslednji koraki bi lahko omogočili, da pristopi, ki temeljijo na uEV, nadomestijo biopsije ledvic v naslednjem desetletju.

za več informacij:ali.ma@wecistanche.com