Genetika osteopontina pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo: nemška študija o kronični ledvični bolezni

Povzetek

Ekološka zelišča za zdravje ledvic

Uvod

Osteopontin (OPN), kodiran z genom SPP1, je bil prvič opisan kot glikoprotein, ki pripada družini SIBLING (Small Integrin-Binding LIgand N-linked Glycoprotein) leta 1985 [1]. OPN se izraža v številnih tkivih, kot so osteoblasti, osteociti, odontoblasti (imajo vlogo pri mineralizaciji in resorpciji kosti [2,3]), makrofagi, celice gladkih mišic in endotelijske celice, najdemo pa ga lahko tudi v notranjem ušesu, centralni živčni sistem in placenta [1,2]. Čeprav je OPN mogoče odkriti v številnih tipih celic, se pretežno sintetizira in izraža v ledvičnem tkivu. Proizvodnjo OPN spodbujajo številni dejavniki, vključno s paratiroidnim hormonom, kalcitriolom, kalcijem, fosfatom in citokini. Protein lahko veže integrine prek specifičnega peptidnega zaporedja, motiva arginin-glicin-asparaginske kisline (RGD), kar omogoča interakcijo z različnimi tipi celic (prek poti jedrskega faktorja kapa B, [4,5]). V ledvicah lahko integrine najdemo v Bowmanovi kapsuli, glomerularnem epiteliju in vaskularnem epiteliju [6,7]. OPN se sintetizira v debelem naraščajočem delu Henlejeve zanke in distalnem tubulu [1,8].

V pregledu Kaleta (2019) so bile obravnavane znane (pato)fiziološke vloge OPN [1]. Na podlagi tega pregleda fiziološka vloga OPN v ledvicah še ni popolnoma razumljena, vendar je bilo predlagano, da je bistveno za tubulogenezo [1]. SPP1 mRNA in ekspresija proteina OPN sta bili povečani pri večinoma podganjih modelih bolezni ledvic, visoka ekspresija OPN pa je bila povezana s proteinurijo, zmanjšanim delovanjem ledvic in fibrozo [1]. Ena študija je identificirala različne polimorfizme v promotorski regiji SPP1, ki vplivajo na njeno transkripcijsko aktivnost [9]. V preteklosti je bilo več specifičnih različic gena SPP1 povezanih s patogenezo in napredovanjem različnih bolezni ledvic. Druge študije primera in kontrole so poročale o specifičnih različicah gena SPP1, ki so bile povezane z različnimi bolniki z boleznijo ledvic v primerjavi z (zdravo) kontrolno skupino: na primer, rs1126616 so večkrat poročali kot marker za lupusni nefritis in imunoglobulinsko A nefropatijo [10– 14]. V povezavi z diabetično nefropatijo so poročali o dveh SNP v SPP1, rs11730582 in rs17524488 [15,16]. Zato smo sklepali, da lahko prisotnost zmanjšane ledvične funkcije predstavlja dobro študijsko okolje za nadaljnje razumevanje našega razumevanja genetskih podlag ravni OPN pri ledvični bolezni, saj bi lahko bili nekateri biološki mehanizmi regulirani navzgor in bi jih bilo zato lažje zaznati, kar je prikazano pred [17–19]. V Jing et al. [19], na primer, obseg učinkov za znane lokuse, ugotovljene v GWAS serumskega urata pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo, je bil podobnega ali večjega obsega od tistih, o katerih poročajo populacijske študije. Nemška študija o kronični ledvični bolezni (GCKD) vključuje veliko kohorto bolnikov s kronično ledvično boleznijo [20]. Poleg demografskih in kliničnih podatkov so na voljo genetski podatki ter izhodiščne meritve OPN v serumu, kar zagotavlja idealno nastavitev za raziskovanje genetike OPN. V ta namen smo izvedli GWAS serumskih ravni OPN v študiji GCKD

Rezultati Opis nabora analize GCKD

Tabela 1 podaja pregled izhodiščnih značilnosti izbranega števila spremenljivk za celotno kohorto študije GCKD in nabor analize GWAS, v katerem udeleženci s popolnimi podatki o genetiki, meritvah OPN ter ocenjeni hitrosti glomerularne filtracije (eGFR) in albuminu v urinu Vključeno je razmerje med - in kreatininom (UACR) (slika S1). Med celotno kohorto in nizom analize ni bilo večjih odstopanj. Na splošno je bil za niz analize GWAS značilen delež 60% moških s povprečno starostjo 6{{10}},2 let (SD: 12.0). , z mediano vrednostjo 46,0 ml/min/1,73 m2 (p25: 37,0; p75: 57,0) za eGFR in 50,2 mg/g (p25: 9,4; p75: 382,8) za UACR (tabela 1). Med vključenimi udeleženci jih je 35 % imelo prevladujoč diabetes mellitus, 16 % jih je bilo kadilcev, 30 % pa je poročalo o zgodovini srčno-žilnih bolezni (KVB). Mediana ravni OPN v celotni kohorti je bila 29,2 ng/ml (p25: 20,7; p75: 41,9; tabela 1). Ravni OPN so se v povprečju zvišale v kategorijah eGFR in kategorijah UACR z mediane 25,4 ng/mL za kronično ledvično boleznijo stopnje G1/2 na 38,5 ng/ml za kronično ledvično boleznijo stopnje G4/5, pa tudi z mediane vrednosti OPN 25,6 ng/ml za UACR stopnjo A1 pomenijo vrednosti OPN 34,2 ng/ml za UACR stopnjo A3 (S2 slika).

Študija povezav celotnega genoma in natančno preslikavo

Izvedli smo GWAS za ravni OPN v serumu (log{{0}}transformirano) z uporabo ~7,7 milijona visokokakovostnih avtosomnih dvoalelnih različic študije GCKD s frekvenco manjših alelov (MAF) �0,01 (S1 tabela). Graf kvantil-kvantil, ki primerja opazovane in pričakovane p-vrednosti iz OPN GWAS, ni pokazal inflacije (faktor inflacije λ=1.01), skladno z odsotnostjo sistematičnih napak (S3 slika). Na splošno je graf na Manhattnu razkril tri pomembne regije v celotnem genomu, povezane z ravnmi OPN (p-vrednost<5.0E-08; S4 Fig). Besides the three identified regions, the conditional analysis did not reveal additional independent signals (S5 Fig). The respective association results for the three index SNPs (= SNP with the lowest p-value in the respective region) are presented in Table 2. For all three SNPs, the coded allele was present frequently (allele frequency range 0.5– 0.75). The respective coded allele in our cohort decreased OPN levels on average (S6 Fig) with effect estimates per copy of the coded allele ranging from -0.10 to -0.18 (SE: 0.01–0.02; Table 2). One of the index SNPs on chromosome 4 (rs10011284, 4:88833389) is located upstream of SPP1, which encodes the protein OPN itself (Fig 1A). The other index SNP on chromosome 4 (rs4253311, 4:187174683) maps into the KLKB1 gene (intronic variant), encoding the protein prekallikrein (PK) that is converted to kallikrein (KAL); a protease implicated in the surface-dependent activation of coagulation, bradykinin (BK) release, and potentially the renin-angiotensin-aldosterone system (Fig 2A). The index SNP on chromosome 5 (rs2731673, 5:176839898) maps closest to the F12 gene, which encodes coagulation factor XII, a serine protease that cleaves KLKB1-encoded PK to KAL, among other functions and is also related to blood coagulation, fibrinolysis, and the generation of BK (S7 Fig). A summary of annotations combined from different publicly accessible databases and related to all three SNPs is provided in S2 Table. We next tested whether these three index SNPs were associated with serum OPN levels in the Young Finns Study (YFS) cohort, a population-based study with a mean age of 38 years (SD: 5.0) and a mean eGFR of 92.6 mL/min/1.73m2 (SD: 20.7; S1 Methods). Both SNPs on chromosome 4, rs10011284 and rs4253311, were significantly associated with OPN levels showing also direction consistency (Table 2 and Figs 1B and 2B). In contrast, rs2731673 closest to the F12 gene did not replicate in the YFS cohort (S7 Fig). The two replicated SNPs on chromosome 4 explained 1% of OPN levels each within the GCKD study and did not show a non-additive effect on OPN levels (S8 Fig). Moreover, statistical fine-mapping was performed for the two replicated loci to resolve associated loci into potentially causal variants by constructing credible sets that collectively accounted for a 99% posterior probability of containing the variant or variants that cause the association signal (PPA; Material and methods, [21]). However, fine-mapping results are inconclusive as both constructed sets are large, and single variants included only exhibit low PPA estimates (S3 Table)

Kolokalizacijske analize

Da bi izvedeli več o molekularnih mehanizmih in povezanih fenotipih, na katerih temeljijo identificirani asociacijski signali za OPN, smo primerjali vzorce rezultatov OPN GWAS v vnaprej določenih regijah z ustreznimi povzetki statistike GWAS iz treh drugih virov z uporabo podatkov o ljudeh (za podrobnosti glejte Material in metode). Primerljivi vzorci lahko kažejo na skupno biološko osnovo.

Izražanje genov. Najprej smo izvedli kolokalizacijske analize statistike povzetka OPN GWAS, povezane z dvema ponovljenima lokusoma, z ustrezno statistiko povzetka GWAS izražanja genov v cis z uporabo podatkov iz projekta GTEx in študije NEPTUNE

(Material and methods). Colocalization (posterior probability of H4 [p12] >0.8) of the OPN association signals were detected with the expression of MEPE in the lung (Fig 3A) and of SPP1 in the pancreas (Fig 3B and S4 Table). Furthermore, colocalization was found between the OPN association signal and expression of F11 in six other tissues (in descending order of H4): tibial artery (Fig 3C), brain cortex, terminal ileum part of the small intestine, muscular of the esophagus, transverse colon, and aortic artery (S4 Table). Except for the colocalization of the OPN signal with an expression of MEPE in the lung, the effect direction of both traits (OPN and gene expression) was concordant (alpha12>0; Tabela S4). Plazemski proteom. Poleg tega so bile analize kolokalizacije izvedene z uporabo GWAS povzetkov statistik povezav SNP v cis in trans z ravnmi ~3,000 različnih plazemskih proteinov (pGWAS), o katerih so poročali Sun et al. (Material in metode, [22]). Medtem ko ni bila prisotna kolokalizacija za povzetek statistike GWAS OPN in proteinov v cis, je bilo ugotovljeno, da se rezultati pGWAS za 87 proteinov iz različnih razredov beljakovin trans kolokalizirajo z rezultati OPN GWAS za rs4253311 pri KLKB1 (tabela S5). Za večino rezultatov kolokalizacije

Slika 3. Primerjava povzetkov statističnih podatkov iz OPN GWAS in GTEx kolokalizacije tkiva: (A) MEPE: OPN in pljučno tkivo (H4: p12=0.99), (B) SPP1: OPN in trebušna slinavka (H4: p{{ 6}}.85); (C) F11: OPN in tibialna arterija (H4: P12=0.98). Levo: raztreseni graf, ki primerja asociacijske p-vrednosti obeh virov med seboj (lestvica -log10). Zgoraj desno: rezultati OPN GWAS za območje, ki nas zanima. Spodaj desno: rezultati GTEx GWAS za področje zadevnega organa. Barve odražajo korelacijo LD (r2) z uporabo 1000G EUR populacije kot reference.

(60/87, 69 %) je bila smer delovanja OPN in proteinov skladna, kar je posledica dejstva, da je aktivirana KKS vključena v širok spekter procesov, kot so vnetja, rak, srčno-žilne bolezni, pa tudi (pato )fiziološke vloge v ledvicah in centralnem živčnem sistemu. Za 86 preslikane proteine ​​je bila izvedena analiza obogatitve genske ontologije (GO), da bi ocenili, ali so bili njihovi kodirni geni obogateni z izrazi, ki predstavljajo specifične celične komponente in molekularne funkcije (material in metode, tabela S6). Zaradi hierarhične strukture referenčnih seznamov so vpleteni izrazi delno odvisni drug od drugega, kar kaže na primer prekrivanje navzgor reguliranih molekularnih funkcij ter navzgor reguliranih aktivnosti hormonov in receptorjev (slika S9).

Bolezni UK Biobank (UKB).

To address the interplay between genetic modulation of OPN levels and phenotypes we further conducted a colocalization analysis with binary UKB disease traits that showed a genome-wide significant association in the GeneAtlas resource [23]. Based on marginal association statistics, no positive colocalization was detected between OPN and various disease traits (S7 Table). Still, for four of seven traits with an association signal different from the OPN signal in the region (H3: p1.2>0.8), je bil zaznan drugi neodvisni asociacijski signal za zadevno lastnost bolezni pri UKB. Nato smo izvedli dodatne kolokalizacijske analize na podlagi pridobljene pogojne asociacijske statistike in identificirali pozitivno kolokalizacijo med asociacijskim signalom OPN pri rs4253311 na lokusu KLKB1 in rs1593 za globoko vensko trombozo (DVT; H4: p12=0.96; S7 tabela in slika S10). V GeneAtlas GWAS za GVT je bil glavni alel rs1593 (A, frekvenca alela=0.87) povezan z večjim tveganjem za GVT (ALI=1.2, p-vrednost 2,4e{{ 18}}), kot je bil glavni alel rs4253311 (glavni alel: G, frekvenca alela=0.51, ALI=1.13, p-vrednost=2.6e{{27 }}).