Odlaganje amiloida P v serumu je občutljiva in specifična značilnost membranski podobni glomerulopatiji s prikritimi depoziti IgG Kappa
Mar 04, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 in John M. Arthur2
KLJUČNE BESEDE:glomerulonefritis; prikriti depoziti; masna spektrometrija; membranski podobna glomerulopatija; subepitelijske depozite
Cistanche lahko izboljša delovanje ledvic
Membranozni glomerulopatija z maskiranimi depoziti kapa IgG (MGMID) je nedavno opisan vzorec glomerulonefritisa z edinstveno histopatologijo. Za vzorec je značilen subepitelijski in/ali mezangialniimunskiusedline, ki so "zamaskirane", za obarvanje z imunoglobulini z rutinsko imunofluorescenco, vendar močno obarvajo za IgG in lahko verigo kapa po razgradnji s proteazo. Bolniki s tem vzorcem glomerulonefritisa so najpogosteje mlade ženske s proteinurijo in nejasno zgodovino avtoimunske bolezni, kot je nizek titer protinuklearnih protiteles. Tu smo primerjali profil masne spektrometrije lasersko zajetih mikrodiseciranih glomerulov iz devetih ledvičnih biopsij MGMID z osmimi biopsijami, ki kažejo druge vzorce membranske glomerulopatije. Protein, ki se je v MGMID najbolj pomembno povečal, je bil serumski amiloid P. Imunsko barvanje je pokazalo serumski amiloid P, kolokaliziran z IgG v glomerulih MGMID, ne pa tudi z membransko glomerulopatijo, povezano s PLA2R. Serumski amiloid P je bil pozitiven v glomerulih vseh 32 biopsij MGMID, negativen pa v biopsijah drugih vrst membranskih glomerulopatij, kot so tiste, povezane s PLA2R in THSD7A. Med 173 biopsijami, ki niso izpolnjevale meril za MGMID ali amiloidozo, so bile štiri biopsije z obarvanjem glomerularnega seruma z amiloidom P. Vse štiri od teh biopsij s pozitivnim obarvanjem serumskega amiloida P so imele membranski vzorec glomerulopatije z depoziti IgG kapa, ki se je od MGMID razlikoval le po pomanjkanju "maskiranja". Tako pozitivno obarvanje znotraj glomerulnih depozitov za serumski amiloid identificira edinstveno obliko glomerulonefritisa, ki ima verjetno skupen patofiziološki mehanizem bolezni.
Membranozni glomerulopatija z maskiranimi depoziti kapa IgG (MGMID) je histopatološki vzorec glomerulonefritisa, opisan leta 2014, kar je bil prvi opis tako imenovanih maskiranih glomerulnih depozitov.1 Značilna histopatologija te bolezni vključuje prisotnost mezangialnih in subepitelnih depoziti z omejitvijo IgG kappa. Nenavadno je, da čeprav je obarvanje s komponento komplementa 3 (C3) pogosto razvidno z rutinsko imunofluorescenco na zamrznjenem tkivu, se obarvanje z Ig pogosto prikrije, kar pomeni, da kaže lažno negativno obarvanje z rutinsko imunofluorescenco, vendar pozitivno obarvanje, ko se ponovi na tkivu, vgrajenem v parafin po razgradnji s proteazo. Torej, če patolog ne vzdržuje visokega indeksa suma za to entiteto, bi jo lahko napačno diagnosticirali kot glomerulopatijo C3. Druge entitete, za katere je bilo opisano, da kažejo ta pojav maskiranja v glomerulnih depozitih, vključujejo membranoproliferativni glomerulonefritis s prikritimi monotipskimi depoziti Ig in krioglobulinemični glomerulonefritis.2,3
Bolniki, pri katerih je biopsija odkrila MGMID, so najpogosteje mlade ženske<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 odstotkov) je bilo negativnih na monoklonske Ig z elektroforezo serumskih beljakovin in niso opazili nobenih primerov v povezavi z osnovno hematološko malignostjo.4
Domnevali so, da bi skupne klinično-patološke ugotovitve med bolniki z MGMID lahko kazale na skupen molekularni patofiziološki mehanizem, ki poganja njihovo bolezen. Naš namen pri prvem poročanju o tej entiteti je bil določiti kohorto za nadaljnjo analizo.1 Tukaj opisujemo prisotnost proteinske serumske amiloidne komponente p (SAP), ki jo najdemo edinstveno v usedlinah glomerulov MGMID. Imunsko barvanje za SAP v glomerularnih usedlinah je občutljiva in specifična tehnika za diagnozo MGMID, ki zagotavlja tudi patogeni vpogled.
Slika 1|Serumska amiloidna komponenta P (SAP) je znatno obogatena v mikrodiseciranih glomerulih bolnikov z membransko podobno glomerulopatijo s prikritimi depoziti IgG kapa. Za statistično analizo so bile uporabljene normalizirane absolutne vrednosti kvantifikacije na podlagi intenzivnosti MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Nemčija). Črtkane črte prikazujejo hevristične meje za spremembo zgiba in P-vrednost. (a) Graf vulkana, ki primerja 3 membranske primere s pozitivnimi receptorji za fosfolipazo A2 (PLA2R) z drugimi, identificira 2 proteina, ki sta očitna odstopanja v zgornjem desnem kvadrantu. (b) Graf vulkana, ki primerja 2 primera pozitivne membrane 7A (THSD7A), ki vsebujeta domeno trombospondina tipa 1, z drugimi identificira 2 proteina, ki sta očitna odstopanja, pri čemer THSD7A kaže največjo kratno spremembo. (c) Graf vulkana, ki primerja vzorce membranski podobni glomerulopatije z maskiranimi depoziti IgG kappa z vsemi drugimi vrstami membranskih primerov, identificira 6 proteinov, ki so jasni izstopniki v zgornjem desnem kvadrantu. C6, komponenta komplementa 6; C7, komponenta komplementa 7; CFHR1, protein 1, povezan s faktorjem komplementa H; HP1BP3, heterokromatinski protein 1, ki veže protein 3; HPRT1, hipoksantin fosforiboziltransferaza 1; IGHG3, Ig težka konstantna gama 3.
REZULTATI
Masna spektrometrija mikrodiseciranih glomerulov z laserskim zajemom
Analiza z masno spektrometrijo lasersko zajetih mikrodiseciranih glomerulov iz 9 primerov MGMID je bila primerjana z 8 primeri membranske glomerulopatije (MG), vključno s 3 primeri MG s pozitivnim receptorjem fosfolipaze A2 (PLA2R), 2 primeroma domene 7A, ki vsebuje trombospondin tipa 1 ( THSD7A)–pozitiven MG in 3 primeri lupusnega MG. V tej analizi je bilo identificiranih skupno 1695 beljakovin. Izvedena je bila analiza dokaza o načelu, da bi se preizkusilo, ali je mogoče z masno spektrometrijo odkriti beljakovine, ki sodelujejo pri patogenezi bolezni MG. Za vsako znano membransko vrsto je bila diferencialna številčnost beljakovin primerjana s preostalimi skupinami z uporabo normaliziranih vrednosti absolutne kvantifikacije na podlagi intenzivnosti (iBAQ). Statistična analiza je bila izvedena z uporabo Welchovega t-testa, rezultati pa so bili prikazani na grafu vulkana. PLA2R je bil znatno večji v primerih MG, povezanega s PLA2R, in je pokazal najmočnejšo kratno spremembo (slika 1a). THSD7A je pokazal najmočnejše kratne spremembe v MG, povezanem s THSD7A, čeprav z večjo P-vrednostjo zaradi majhne velikosti vzorca v tej skupini (n=2; slika 1b). Na splošno je ta dokazna analiza načela pokazala, da lahko masna spektrometrija mikrodiseciranih glomerulov z laserskim zajemom identificira beljakovine, ki so pomembne za patogenezo bolezni pri membranski glomerulopatiji.
Nato smo s tem pristopom poskušali identificirati proteine, ki bi lahko bili vključeni v patogenezo MGMID. Skupno 6 proteinov je bilo v vzorcih MGMID bistveno bolj razširjeno v primerjavi z drugimi skupinami (tabela 1). Protein z največjo kratno spremembo je bil SAP (slika 1c). Preostale beljakovine so sestavljale IgG Kappa, 3 proteini komplementa in heterokromatinski protein 1–vezavni protein 3 (HP1BP3). SAP je veljal za najboljšega kandidata, saj je bil odkrit v vseh vzorcih MGMID in je pokazal največjo razliko v številčnosti glede na vzorce, ki niso MGMID. Vsi Ig, identificirani z masno spektrometrijo v lasersko zajetih mikrodiseciranih glomerulih iz primerov membranske glomerulopatije z depoziti IgG kapa, so prikazani v dodatni tabeli S1. Spektralno štetje z vzorčenjem vseh proteinov, ki so pokazali povečano številčnost za $1 log2 v vzorcih MGMID in P-vrednost #0.1, je prikazano v dodatni tabeli S2.
Cistanchese lahko izboljšaledvicafunkcijo
SAP barvanje v primerih membranske glomerulopatije
Poliklonsko zajčje protitelo proti proteinu SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) je pokazalo močno pozitivno obarvanje vzdolž glomerulnih bazalnih membran primerov z MGMID, ki so bili kolokalizirani z IgG s konfokalno analizo. SAP ni pokazal kolokalizacije z IgG v glomerulih iz MG, povezanega s PLA2R (slika 2). Poliklonsko zajčje protitelo proti HP1BP3 je bilo testirano v 4 biopsijah z MGMID in je pokazalo negativno obarvanje v glomerulnih depozitih vseh 4 primerov.
Barvanje s SAP je bilo izvedeno na skupno 211ledvicabiopsijez glomerulonefritisom (tabela 2). Skupaj 36 primerov z depoziti imunskega tipa je bilo obarvanih pozitivno na SAP. Vsi primeri, ki so bili obarvani pozitivno, so imeli skupne določene histopatološke značilnosti, vključno s prisotnostjo mezangialnih in subepitelnih depozitov z omejitvijo IgG kappa in brez endokapilarnih ali membranoproliferativnih sprememb s svetlobno mikroskopijo. SAP je bil negativen v vseh primerih, s prikritimi depoziti, ki niso bili MGMID, vključno s 3 primeri krioglobulinemskega glomerulonefritisa in 3 primeri prikritega membranoproliferativnega glomerulonefritisa. Prav tako je bil negativen v vseh 19 primerih proliferativnega glomerulonefritisa z depoziti monoklonskih Ig (PGNMID), vključno s primeri z IgG1 kapa (4 primeri), IgG2 lambda (1 primer), IgG 3 kapa (8 primerov) in IgG3 lambda (6 primerov). ). Vseh 30 primerov poliklonalne membranske glomerulopatije (PLA2R, THSD7A, lupus in segmentna) je bilo negativnih na SAP. Proučevali so tudi dodatne oblike glomerulonefritisa, ki so bile negativne. Med glomerulonefritisom, povezanim z okužbo, je bilo 7 pozitivnih na IgG obarvanje in 6 z dokazi subepitelnih grbastih depozitov. Kot je bilo pričakovano, je vseh 6 primerov amiloidoze pokazalo pozitivno obarvanje amiloidnih usedlin. Vendar pa je bil umazan vzorec odlaganja v močnem nasprotju z zrnatim obarvanjem, prisotnim v primerih MGMID. Reprezentativne fotomikrografije glomerulov na madežu SAP iz različnih ledvičnih bolezni so prikazane na dodatni sliki S1.
Vseh 32 primerov, predhodno opredeljenih kot MGMID, je bilo pozitivnih na SAP. Poleg tega je bilo obarvanje na SAP v glomerulih pozitivno pri 4 od 25 primerov membranske glomerulopatije z monotipskim odlaganjem IgG, ki ni bilo prikrito z rutino
imunofluorescenca, vključno s 4 od 13 primerov z IgG1 kapa, 0 od 2 primerov z IgG1 lambda, 0 od 5 primerov z IgG2 kapa, 0 od 4 primerov z IgG3 kapa in {{ 12}} od 1 primera z IgG4 kappa. Na splošno je bilo 32 od 36 (89 odstotkov) SAP-pozitivnih glomerulopatij prikritih in sodijo v kategorijo MGMID, medtem ko so bili drugi 4 od 36 (11 odstotkov) razkriti in diagnosticirani kot MG z depoziti IgG1 kappa. Bolniki z monotipsko membransko glomerulopatijo, ki se ni prikrila, vendar so bili pozitivni na SAP, so bili povprečno stari 33 let, z razmerjem med ženskami in moškimi 4:0. Primeri z monotipsko membransko glomerulopatijo, ki niso prikrili, vendar so bili negativni na SAP, so imeli povprečno starost 59,3 leta z razmerjem med ženskami in moškimi 15:4.
Tabela 1|Beljakovine so se znatno povečale v glomerulih bolnikov zmembranski podobni glomerulopatijis prikritimi depoziti IgG kappa, kot je pokazala masna spektrometrija
Serumska reaktivnost na SAP
Serume 22 bolnikov z MGMID, 12 s PLA2R-pozitivno membransko glomerulopatijo in 6 normalnih kontrol so testirali na reaktivnost IgG na SAP z encimsko vezanim imunskim testom (ELISA). Čeprav je med bolniki v vsaki skupini obstajalo nekaj variabilnosti, med skupinama ni bilo bistvene razlike v reaktivnosti IgG proti SAP (dodatna slika S2).
Slika 2|Kolokalizacija IgG in serumske amiloidne komponente P (SAP). (a–c) Imunofluorescenčni poskusi, izvedeni na vzorcu ledvične biopsije bolnika z diagnozo membranski podobni glomerulopatiji z maskiranimi depoziti kapa IgG, kažejo obarvanje zrnate glomerularne bazalne membrane za (a) SAP in (b) IgG. (c) Obstaja močna kolokalizacija SAP in IgG v depozitih glomerularne bazalne membrane. (d–f) Imunofluorescenčni poskusi, izvedeni na vzorcu ledvične biopsije bolnika s 3 membranskimi glomerulopatijami, pozitivnimi na receptor fosfolipaze A2, kažejo (d) negativno obarvanje glomerularne bazalne membrane za SAP in (e) pozitivno obarvanje zrnate glomerularne bazalne membrane za IgG. (f) Pri tem bolniku z membranskimi glomerulopatijami, povezanimi z receptorjem 3 fosfolipaze A2, ni kolokalizacije. Če želite optimizirati ogled te slike, si oglejte spletno različico tega članka v tabeli 2|Rezultati obarvanja serumske amiloidne p komponente (SAP) v biopsijah ledvic
AA, amiloid A; AL, amiloidna lahka veriga; C3, komponenta komplementa 3; GBM, glomerularna bazalna membrana; MG, membranska glomerulopatija; MGMID, membranski podobna glomerulopatija s prikritimi depoziti IgG kapa; MPGN, membranoproliferativni; glomerulonefritis; PGMNID, proliferativni glomerulonefritis z monoklonskimi kapa depoziti IgG; PLA2R, receptor za fosfolipazo A2; THSD7A, domena trombospondina tipa 1, ki vsebuje 7A.
DISKUSIJA
MGMID je nedavno opisan in edinstven vzorec glomerulopatije, za katerega so značilni subepitelijski in mezangialni depoziti, ki se obarvajo na IgG kappa s parafinskim IF (slika 3). Bolniki s tem vzorcem glomerulopatije so ponavadi mlade ženske (starost<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">
SAP je 25-kDa pentamerni protein v družini pentraksina, ki ga kodira gen APCS in ga je veliko v serumu ter kot sestavni del glomerularne bazalne membrane.5 Čeprav natančna funkcija SAP ni jasna, je znana za interakcijo v plazmi s široko paleto beljakovin, vključno s komponentami komplementa, apolipoproteini in regulatorji koagulacije in proteolize.6 Tvori stabilne, od kalcija odvisne interakcije s svojimi ligandi, vključno s proteini, lipoproteini in DNK, ter jih ščiti pred razgradnjo. SAP služi kot topna molekula za prepoznavanje vzorcev, vključena v prirojeni imunski odziv, ki prepoznava različne molekularne vzorce, povezane s patogeni in poškodbami, vključno z mikrobnimi komponentami in ostanki apoptotičnih celic.7 Interakcija SAP z molekulami, povezanimi s patogeni ali poškodbami vzorcev spodbuja s komplementom posredovano čiščenje ostankov apoptotičnih celic z neposredno vezavo na komponento komplementa 1q (C1q) in aktivacijo klasične poti komplementa. Kljub aktivaciji komplementa je znano, da SAP zagotavlja imunoregulacijo in zmanjšuje nevtrofilnevnetjev tkivih zaradi zmanjšane adhezije endotelija,8 zmanjšane funkcije elastaze,9 in zmanjšanega premikanja v tkiva.10 Znano je tudi, da je SAP glavni vezavni protein za DNK in kromatin v plazmi.11
Pri boleznih je SAP najbolj znan po tem, da je del depozitov amiloidoze. Čeprav je manj dobro raziskan, obstajajo tudi dokazi, da bi lahko igral vlogo pri človeških in živalskih modelih avtoimunskih bolezni. Protitelesa SAP so odkrili pri bolnikih zavtoimunskibolezniin zmanjšano izražanje SAP dokazano spodbujaavtoimunostipri mišjih modelih. Protitelesa proti SAP so odkrili pri 44 odstotkih bolnikov s sistemskim eritematoznim lupusom, pri čemer so titri protiteles povezani z aktivnostjo bolezni.12 Ugotovljeno je bilo, da pomanjkanje SAP povzroči razvoj spontane avtoimunosti pri miših C57BL/6, nagnjenih k avtoimunim boleznim, in pri neavtoimunskih nagnjene miši 129/Sv pri križanju z mišmi C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13, vendar ne samo pri sevu 129/Sv, kar kaže na to, da je morda potrebna osnovna genetska dovzetnost za pomanjkanje SAP, da povzroči avtoimunost.14 miši kažejo nastajanje protiteles proti jedru, protiteles proti enoverižni DNA, protiteles proti dvoverižni DNA in revmatoidnih faktorjev. Razvijejo proliferativnoimunskikompleksno posredovan glomerulonefritis, pogosteje pri samicah.13 V mišjem modelu lupusnega nefritisa, kjer je glomerulonefritis induciran z injiciranjem aktivirane lastne DNA v serumu, je genska terapija SAP s plazmidnim vektorjem zmanjšala nastajanje protiteles proti dvojnoverižni DNA , odlaganje imunskih kompleksov in ledvično vnetje ter preprečili nastanek lupusnega nefritisa.15
Slika 3|Ugotovitve biopsije ledvic pri membranski podobni glomerulopatiji s prikritimi depoziti IgG kapa. Tukaj so prikazane mikrofotografije biopsije, prikazane na sliki 2. (a) Segmentne konice so prisotne vzdolž glomerularnih bazalnih membran, z barvanjem z metenamin srebrom po Jonesu (prvotna povečava × 400). (b) Elektronska mikroskopija razkrije subepitelne depozite, prisotne vzdolž glomerularne bazalne membrane (prvotna povečava × 12, 000). (c) Barvanje glomerulov negativno za IgG z rutinsko imunofluorescenco na svežem tkivu (neposredna imunofluorescenca; prvotna povečava × 400). ( d ) Glomeruli iz istega primera se pozitivno obarvajo na tkivo, vgrajeno v parafin, po prebavi s proteazo (neposredna imunofluorescenca; originalna povečava × 400). ( e ) Glomeruli kažejo obarvanje za kappa in ( f ) ne za lambda na tkivu, vgrajenem v parafin, prebavljenem s proteazo (neposredna imunofluorescenca; prvotna povečava × 400). Če želite optimizirati ogled te slike, si oglejte spletno različico tega članka na www.ledvica-international.org.
Kljub omejitvi lahke verige, ugotovljeni pri biopsiji, trenutno ni dokazov, da bi bila ta entiteta povezana z osnovnimi limfoproliferativnimi motnjami ali krožečimi monoklonskimi Ig.4 Zato se MGMID ne bi smel obravnavati kot znotraj spektra monoklonske gamopatije, ki je pomembna za ledvice. čas. Negotova je tudi vloga avtoprotiteles SAP. Za razliko od drugih oblik membranske glomerulopatije z beljakovino, ki je specifično prisotna v imunskih depozitih, kot je bolezen, povezana z PLA2R,16 se zdi, da MGMID ne poganjajo avtoprotitelesa, usmerjena proti SAP, saj nismo uspeli zaznati reaktivnosti serumskih protiteles proti SAP pri bolnikih z MGMID . Alternativna razlaga je, da je IgG kappa prisoten kot posledica normalne interakcije med tema dvema proteinoma in ne avtoimunske interakcije antigen-protitelo, saj je znano, da je veriga Ig kapa del normalnega interaktoma serumskega SAP.6 Zato čeprav je uporabno za tkivno diagnostiko te entitete, testiranje na protitelesa SAP v serumu trenutno ne služi kot neinvazivna diagnostika in osnovni vzrok te bolezni ostaja uganka.
Klinični izidi pri MGMID so zelo različni in segajo od spontane remisije do napredovanja do končne faze.ledvicabolezens ponovitvijo pri presaditvi. Retrospektivna analiza ni pokazala nobene povezave med uporabljenim zdravljenjem in kliničnim izidom.4 Odkritje vpletenosti SAP v to bolezen ima potencialne posledice za terapijo. Zdravljenja, ki so neposredno usmerjena na SAP, so se izkazala za zgodnja obljuba pri zdravljenju amiloidoze.17,18 Poleg tega rezultati masne spektrometrije kažejo, da bi bile terapije, usmerjene na kaskado komplementa, lahko koristne pri zdravljenju te oblike glomerulonefritisa, glede na to, da je večina beljakovin, ki so bile povečane, pri MGMID so glomeruli povezani s komplementom. Potrebne so dodatne študije za identifikacijo biomarkerjev aktivnosti za to bolezen, pa tudi terapije.
Razlog za prikrivanje imunskih depozitov v biopsijah MGMID pri rutinski imunofluorescenci ostaja skrivnost. Prisotnost SAP v nahajališčih odpira nove možne razlage za ta pojav v primerih MGMID. Na primer, znano je, da so interakcije proteina SAP močno odvisne od Ca2þ,6 mnogi transportni mediji in pufri, ki se uporabljajo pri obdelavi ledvičnega biopsijskega tkiva za imunofluorescenco, pa so brez Ca2þ. Ta in vitro odsotnost Ca2þ bi lahko povzročila motnje v imunskih usedlinah, tako da niso več na voljo za odkrivanje z imunofluorescenco na zamrznjenem tkivu. Depoziti imunskega kompleksa pa bi ostali na voljo za odkrivanje v tkivu, fiksiranem s formalinom, zaradi kovalentnih kemičnih vezi med proteini v tkivu, ki jih povzroči formalin.
Tukaj prvič opisujemo edinstveno prisotnost SAP v glomerularnih depozitih MGMID. Dodatno pokažemo, da obarvanjeledvicabiopsijeza SAP identificira primere s klinično-patološkimi značilnostmi, podobnimi tistim v MGMID, brez maskiranja, z rutinsko imunofluorescenco. Glede na te rezultate verjamemo, da pozitivno obarvanje znotraj glomerulnih depozitov za SAP identificira edinstveno obliko glomerulonefritisa, ki ima skupen patofiziološki mehanizem bolezni. Do nedavnega opisa MGMID so bili ti primeri diagnosticirani v številne različne kategorije, od glomerulopatije C3 do glomerulonefritisa, povezanega z okužbo, do atipične membranske glomerulopatije.1 Hiter razvoj diagnostičnih meril in naše razumevanje te oblike glomerulonefritisa poudarjata moč mase spektrometrijo za patofiziološki vpogled v imunsko pogojen glomerulonefritis.
METODE
Tehnike obdelave biopsije ledvic
Uporabljene so bile standardne tehnike obdelave ledvične biopsije, vključno s svetlobno, imunofluorescenčno in elektronsko mikroskopijo.19,20 Vsi vzorci svetlobne mikroskopije so bili obarvani s hematoksilinom in eozinom, Jonesovim metenamin srebrom, Massonovim trikromom in periodično kislino–Schiffovim reagentom. Vse direktne imunofluorescenčne odseke smo odrezali na 4 mm in reagirali s poliklonskimi kunčjimi protičloveškimi protitelesi proti IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogenu ter k- in l-lahkim verigam, označenim s fluoresceinom (Dako, Carpenteria, CA) 1 uro in sperite; pokrovno stekelec smo nanesli z uporabo vodnega pritrdilnega medija. Izbrani primeri so bili obarvani na s fluoresceinom označena poliklonska mišja protičloveška protitelesa proti IgG1, IgG2, IgG3 in IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Parafinska imunoflfluorescenca je bila izvedena po razgradnji s proteazo, kot je opisano prej. 2,3 Za analizo z masno spektrometrijo je bilo izbranih skupno 9 biopsij MGMID in 8 primerjalnih kontrolnih biopsij z membransko glomerulopatijo drugih vrst. Protokol študije je odobril Odbor za institucionalni pregled rešitev in je bil v skladu z načeli Helsinške deklaracije.
Cistanche lahkotonificiratiledvica
Masna spektrometrija mikrodiseciranih glomerulov z laserskim zajemom
Ledvično biopsijsko tkivo iz s formalinom fiksiranega parafinskega tkiva smo razrezali na debelino 10 mm na Leica PET-membranski okvir (Leica, Wetzlar, Nemčija). Te preparate smo nato obarvali s hematoksilinom. Glomerule smo z mikroskopom Leica DM60{{20}0B mikroskopom razrezali v mikrocentrifugirne epruvete. Mikrodisecirane glomerule smo lizirali v 2 odstotkih natrijevega dodecil sulfata in 0,1 M ditiotreitola pri 99 stopinjah 1 uro in obdelali s filtrsko podprto pripravo vzorcev (FASP).21 Očiščeni lizat smo prenesli na koncentratorje Vivacon 500 (MWCO 30 kDa; Sartorius). , Göttingen, Nemčija). Natrijev dodecil sulfat smo odstranili s ponavljajočimi se izpiranji z 8 M sečnino v 0,1 M tris(hidroksimetil)-aminometanu/Cl, pH 8,5; vzorce smo nato alkilirali z 0,05 M jodoacetamidom. Jodoacetamid smo odstranili s 3 izpiranji z 8 M sečnino/0,1 M tris(hidroksimetil)-aminometan/Cl, pH 8,5, čemur so sledila 3 izpiranja z 0,05 M amonijevim bikarbonatom. Beljakovine smo razgradili s tripsinom (stopnja zaporedja, Promega, Madison, WI) v m/m razmerju 40:1 pri 37 stopinjah 16 ur. Peptide smo zbrali s centrifugiranjem in razsolili na konicah C18-Stage (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Prebavljene peptide smo analizirali z NanoLC-tandemsko masno spektrometrijo z uporabo Thermo Orbitrap Fusion Lumos masnega spektrometra (Thermo Scientific). Peptidi so bili naloženi na kolono z reverzno fazno pastjo (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA), ki je vsebovala 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) nabito površinsko hibridno smolo, povezano s 150 mm X 0.075 mm analitična kolona, ki vsebuje enako smolo z reverzno fazo, kot je bila uporabljena v pasti. Tekočinski kromatografski sistem nanoAcquity ultraperformance (Waters Corp.) je bil nato uporabljen za ustvarjanje 60-minutnega gradienta od 98:2 do 60:40 razmerje pufer A:B (pufer A=0,1 odstotka mravljinčne kisline). 0,5 odstotka acetonitrila; pufer B=0,1 odstotka mravljinčne kisline, 99,9 odstotka acetonitrila).
Peptidi so bili eluirani iz kolone z integrirano razpršilno konico (Picofrit, New Objective) in ionizirani z elektrosprejem (2.0 kV), čemur je sledila analiza tandemske masne spektrometrije z uporabo disociacije, povzročene s trkom (HCD) z višjo energijo. Raziskovalni pregledi peptidnih prekurzorjev so bili izvedeni pri ločljivosti 240 K (pri 400 m/z) s ciljnim številom ionov 5 × 105. Tandemska masna spektrometrija je bila izvedena z izolacijo pri 1, 6 Th s kvadrupolom, fragmentacijo HCD z normalizirano energijo trka 30 in analizo masne spektrometrije s hitrim skeniranjem v ionski pasti. Dobljene podatke tandemske masne spektrometrije smo iskali glede na najnovejšo zbirko podatkov Uniprot o ljudeh, ki vsebuje vnose Swiss Prot in TREMBLE, z uporabo
MaxQuant (Inštitut za biokemijo Maxa Plancka, Planegg, Nemčija). Vizualizacija podatkov je bila izvedena z uporabo Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Stopnja lažnega odkritja je bila nastavljena na 1 odstotek za ujemanje peptida s spektrom. Za kvantifikacijo so bile uporabljene normalizirane vrednosti iBAQ iz MaxQuant. Porazdelitve iBAQ za vsak vzorec so bile mediano prilagojene za nadzor razlik v obremenitvi. Vrednosti iBAQ, enake nič, so bile odstranjene iz nabora podatkov. Za statistično testiranje hipotez je bil izveden 2-vzorčni Welchov t-test za vsak protein z uporabo normaliziranih vrednosti iBAQ za 2 skupini. Če je bila beljakovina odkrita samo v eni skupini, je bil izveden 1-vzorčni Welchov t-test z uporabo najmanjše odkrite vrednosti iBAQ kot ničelne hipoteze.
SAP barvanje
V formalinu fiksirani parafinski odseki, odrezani na 3 mm, so bili deparafinizirani in pridobivanje antigena je bilo izvedeno pri 99 stopinjah. Odseki so reagirali s kunčjim poliklonskim anti-SAP poliklonskim protitelesom (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA), čemur je sledil Rhodamine Red X-konjugiran kozji anti-kunčji sekundar, ki je bil adsorbiran v trdni fazi, da se zagotovi minimalna navzkrižna reakcija s človekom IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Vsak primer je bil izveden s pozitivnimi in negativnimi kontrolami. Barvanje smo ovrednotili s standardno imunofluorescenčno mikroskopijo. Ocenjeno je bilo za pozitivno, če je bilo v glomerulih pozitivno obarvanje zrnate kapilarne zanke, in negativno, če kapilarne zanke ni bilo
obarvanje v glomerulih. Kolokalizacijo IgG in SAP v glomerularnih bazalnih membranah smo pregledali s konfokalno mikroskopijo z uporabo konfokalnega laserskega skenirajočega mikroskopa Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Nemčija). Za to analizo je poliklonski (flfluorescein izotiocianat-konjugiran) kunčji protičloveški IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) reagiral s tkivom, pridobljenim s toploto, po obarvanju za SAP, kot je opisano zgoraj. Izvedene so bile negativne kontrole, da se zagotovi specifičnost protiteles z izpuščanjem primarnih protiteles. Štirje primeri MGMID so bili testirani na prisotnost HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) z barvanjem z imunoperoksidazo.
Testiranje serumskih protiteles proti SAP
SAP protein (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) je bil razredčen na 3 ng/ml v karbonatnem bikarbonatnem pufru (pH 9,6) in prevlečen na {{ 6}}ploščo Immulon H2 (Thermo Scientific) čez noč pri 4 stopinjah. Plošče smo sprali x 3 z 200 ml pralnega pufra (1 × fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom in 0,05 odstotka tweena) in blokirali 2 uri z blokirnim pufrom (1 × fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom, 0,05 odstotka). tween, 1 odstotek ribje želatine). Plošče smo nato sprali × 3 z 200 ml pralnega pufra. Dodali smo 20 mikrolitrov razredčenega seruma (1:100 v pralnem pufru) na vdolbinico in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi. Plošče smo sprali × 7 z 200 ml pralnega pufra, čemur je sledil dodatek detekcijskega protitelesa, anti-človeški IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Plošče smo sprali × 7 z 200 ml pralnega pufra. Nato smo zmešali substrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin peroksidaze in substrat peroksidaze Sol B v razmerju 1:1 in 100 ml dodali na ploščo. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 100 ml 2M H2SO4, ki smo jo pustili na preskusni napravi 20 minut pred odčitavanjem pri 450 nm. Za nadzor, da bi zagotovili, da je protein SAP vezan na ploščo, smo uporabili kunčje anti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) v serijski razredčitvi, ki ji je sledil anti-kunčji IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Kontrola je pokazala dobro korelacijo med razredčitvijo protiteles in absorbanco, s srednjo vrednostjo R-kvadrata 0,95.
Cistanche za izboljšanjeledvicafunkcijo
RAZKRITJE
Vsi avtorji so izjavili, da nimajo konkurenčnih interesov.
DOPOLNILNO
MATERIAL Dodatna datoteka (PDF)
Slika S1. Reprezentativne slike obarvanja glomerulnega SAP pri različnih ledvičnih boleznih.
Slika S2. Študije seroreaktivnosti proti SAP z encimsko imunskim testom.
Tabela S1. Vsi Ig, identificirani z masno spektrometrijo v lasersko zajetih mikrodiseciranih glomerulih iz primerov membranski podobni glomerulopatiji z depoziti IgG kapa.
Tabela S2. Spektralno štetje z vzorčenjem vseh proteinov je pokazalo za $1 log2 povečano številčnost v vzorcih MGMID in P-vrednost # 0.1.
REFERENCE
1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. Membranozni glomerulopatija s prikritimi depoziti IgG kapa.LedvicaInt. 2014; 86: 154–161.
2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Parafinska imunofluorescenca v laboratoriju za ledvično patologijo: več kot reševalna tehnika. Mod Pathol. 2015;28:854–860.
3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, et al. Membranoproliferativni glomerulonefritis s prikritimi monotipskimi imunoglobulinskimi depoziti. Kidney Int. 2015;88:867–873.
4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et al. Kliničnopatološke značilnosti membranski podobni glomerulopatiji s prikritimi depoziti IgG kappa. Kidney Int Rep. 2016; 1: 299–305.
5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. Struktura pentamerne amiloidne P komponente človeškega seruma. Narava. 1994; 367: 338–345.
6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. Komponenta serumskega amiloida P (SAP) interaktomira v človeški plazmi, ki vsebuje fiziološke ravni kalcija. Biokemija. 2017; 56: 896–902.
7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et al. Prepoznavanje vzorcev s pentraksini. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.
8. Bottazzi B, Informato A, Messa M, et al. Pentraksini PTX3 in SAP pri prirojeni imunosti, regulaciji vnetja in preoblikovanju tkiv. J Hepatol. 2016; 64: 1416–1427.
9. Li JJ, McAdam KP. Komponenta humanega amiloida P: zaviralec elastaze. Scand J Immunol. 1984; 20: 219–226.
10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Serumski amiloid P: sistemski regulator prirojenega imunskega odziva. J Leukoc Biol. 2014; 96: 739–743.
11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Zaščitne molekule – C-reaktivni protein (CRP), serumski amiloid P (SAP), pentraksin3 (PTX3), lektin, ki veže manozo (MBL), in apolipoprotein A1 (Apo A1), in njihova avtoprotitelesa: razširjenost in klinični pomen pri avtoimunosti. J Clin Immunol. 2005; 25: 582–591.
12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Protitelesa proti serumski amiloidni komponenti P pri bolnikih s sistemskim eritematoznim lupusom korelirajo z aktivnostjo bolezni. Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1698–1702.
13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Komponenta serumskega amiloida P nadzoruje razgradnjo kromatina in preprečuje antinuklearno avtoimunost. Nat Med. 1999; 5: 694–697.
14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. Avtoimunost in glomerulonefritis pri miših s ciljno delecijo serumskega amiloidnega P komponentnega gena: pomanjkanje SAP ali kombinacija sevov? Imunologija. 2004; 112: 255–264.
15. Zhang W, Wu J, Qiao B, et al. Izboljšanje lupusnega nefritisa z gensko terapijo s komponento serumskega amiloida P z različnimi mehanizmi, ki so se razlikovali od različnih stopenj bolezni. PloS One. 2011;6:e22659.
16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et al. Receptor fosfolipaze A2 tipa M kot tarčni antigen pri idiopatski membranski nefropatiji. N Engl J Med. 2009; 361: 11–21.
17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. Terapevtski očistek amiloida s protitelesi proti serumski amiloidni P komponenti. N Engl J Med. 2015; 373: 1106–1114.
18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, et al. Ponavljajoči se odmerki protiteles proti komponenti amiloida P v serumu odstranijo amiloidne usedline pri bolnikih s sistemsko amiloidozo. Sci Transl Med. 2018;10.
19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Praktične smernice za biopsijo ledvic. Mod Pathol. 2004; 17: 1555–1563.
20. Walker PD. Ledvična biopsija. Arch Pathol Lab Med. 2009; 133: 181–188.
21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Univerzalna metoda priprave vzorcev za analizo proteoma. Nat metode. 2009; 6: 359–362.