Gosipitrin, naravno prisoten flavonoid, zmanjšuje z železom povzročene nevronske in mitohondrijske poškodbe: 2. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

2.5. Detekcija Gos-Fe(I) kompleksov

Verjetna hipoteza za razlago zgornjih rezultatov je, da Gos tvori prehodni kompleks s Fe(ll), ki olajša njegovo oksidacijo s kisikom. Ta prehodni kompleks bi lahko hitreje oddal svoje elektrone kot Fe()-citrat, pri čemer bi ustvaril bolj stabilen kompleks z Fe(III). Slika 6A prikazuje tipičen spekter Gos z največjo absorpcijo pri 276, 332 in 380 nm (črna črta). Dodatek Fe() je povzročil od koncentracije odvisno zmanjšanje največjih absorpcijskih vrhov in pojav novega blizu 500 nm (slika 6A). Pojav niza spektrov, ki izvirajo iz spektra Gos, je bil potrjen s prisotnostjo izosbestične točke pri λiso=405 nm （glej črne pike）, kar kaže na kemijsko ravnovesje (kompleksiranje) med prostim in kompleksiranim Gos. Vložek (slika 6A) prikazuje nastanek kompleksa s stehiometrijo 2:1 (Gos-železo). Stehiometrija takih Gos-železovih kompleksov je bila določena z Jobovo metodo, ki kaže prelomno točko pri molskem razmerju 0,5.

Za več informacij kliknite tukaj

Dodatni dokazi o korelaciji med železom in Gos so bili pridobljeni z IR spektroskopijo (slika 6B). Za prosti Gos in njegov železov kompleks se je širokopasovnost v območju 3000-4000 cm- obravnavala kot raztezanje vodikovega vezane hidroksilne skupine zaradi prisotnosti molekul vode. Način raztezanja v(C=O) prostega Gos se pojavi pri 1654 cm-I, ki je bil po nastanku kompleksa premaknjen proti 1636 cm-I. Ta rezultat nakazuje, da je Fe(Ⅱ) povezan s karbonilnim kisikom [31]. Poleg tega prisotnost v(Fe-O) raztezne vibracije pri 630 cm-I potrjuje nastanek kompleksa železo-Gos, saj prosti Gos ne kaže takšnega pasu.

Slika 6. (A) Učinki Fe(II) na Gos UV-VIS spekter (200-600 nm). Inkubacijska mešanica, ki je vsebovala 125 mM saharoze, 65 mM KCl, 10 mM HEPES pufra (pH 7,2), 2 mM citrata in Gos 1,6 μM. Koncentracije Fe（I） od vrha do dna sledi so bile {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 in 1.12 μM.Vstavi∶ Jobov graf za kompleks Gos-Fe(II） pri konstantni skupni koncentraciji 【Fe（D）】 plus 【Gos】=1,6 μM. Črna pika označuje izosbetično točko. Puščici navzdol in navzgor kažeta zmanjšanje in povečanje vrednosti absorbance pri 380 oziroma 500 nm. Poskusi so bili izvedeni pri 28 stopinjah. Hitrost skeniranja je bila 2 nm/sA. Izhodiščna vrednost je bila določena z inkubacijsko mešanico in 1,6 μM Fe (I). (B) Infrardeči spektri Gos in Gos-Fe (I). Prikazani so tipični primeri.

2.6. Gos je preprečil redukcijo Fe(III) z askorbatom

Železovo stanje železa, ki ga spodbuja Gos, predstavlja verjeten antioksidativni mehanizem, saj ovira katalitično aktivnost Fe(II). Kljub temu se lahko Fe(III) še vedno ponovno reducira v železovo obliko z naravnimi redukcijskimi sredstvi, kot je askorbat. Slednji bi lahko ponovno naložil biološke sisteme z Fe(II), ki sodeluje v reakcijah Fenton-Haber-Weiss, pri čemer nastane izjemno reaktiven radikal ·OH. Da bi preučili te možnosti, smo uporabili 1,10-fenantrolin za merjenje ravni nastajanja Fe(II) iz raztopine Gos （100 μM）, obdelane z 2 mM askorbata in različnimi koncentracijami Fe（II） ({{6} } μM）. Slika 7 prikazuje, da je odsotnost Gos omogočila največjo stopnjo redukcije Fe(II) v Fe(II) (črna črta z naklonom 5,85×10-3); vendar je bil ta proces upočasnjen zaradi prisotnosti Gos (1-min inkubacije, zelena črta) in po 5 minutah inkubacije z Gos se je stopnja redukcije Fe(I) z askorbatom zmanjšala skoraj 3-krat (rdeča črta z naklonom 2,04 × 10-3). Ta rezultat kaže sposobnost Gos, da zavira z askorbatom posredovano redukcijo Fe() v Fe(I)

Slika 7. Gos zavira redukcijo Fe(ⅢI) z askorbatom v odsotnosti mitohondrijev jeter podgan. Eksperimentalni pogoji: 125 mM saharoza, 65 mM KCl, 10 mM pufer HEPES (pH7,2), 1 mM citrat, Gos 100 μM. Poskusi so bili izvedeni pri 28 stopinjah. Askorbat（4 mM） in 5 mM 1,10-fenantrolina smo dodali po 1 minuti ali 5 minutah inkubacije Gos-Fe(I). Črte so reprezentativne za tri teste.

2.7. Gos Ščiti pred 2-oksidativno razgradnjo deoksiriboze

Za dokumentiranje zmožnosti Gos, da prednostno deluje na železo namesto na proste radikale, so bile izvedene konkurenčne študije za oceno učinkovitosti Gos in lovilcev dveh·OH (DMSO in salicilat) pri zaščiti 2,8 ali 28 mM 2-deoksiriboze pred železom -posredovana oksidativna poškodba (slika 8). Čistilci·OH pri 20 mM so zaščitili 28 mM 2-deoksiriboze znatno manj kot 2,8 mM2-deoksiriboze (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Slika 8. Učinek čistilcev Gos in ·OH dimetil sulfoksida (DMSO) in salicilata na oksidativne poškodbe 2,8 ali 28 mM 2-deoksiriboze, ki jih povzroči Fe(II)-EDTA in askorbat. Raztopine so bile inkubirane 30 min pri 37 stopinjah in so vsebovale 10 mM fosfatnega pufra (pH7,2), 2-deoksiribozo (2,8 ali 28 mM）), 150 μM EDTA in 50 μM Fe（ⅢI） Reakcije so se začele z dodatkom askorbata do končne koncentracije 2 mM. Vrstice prikazujejo povprečje ± SD (n =3). Kontrole vsebujejo samo DMSO (0,001 odstotka), kar je koncentracija topila v vzorcih Gos. Za*p je bil uporabljen enostranski t-test<0.05, n.s.,="">

3. Razprava

Železo, ki se sprošča v več nevrodegenerativnih stanjih, vključno z ishemično in hemoragično možgansko kapjo, izzove deregulacijo homeostaze železa v možganih, kar vodi v patofiziologijo nevroloških poškodb [4,32-34]. Zdi se, da je na podcelični ravni mitohondrijska okvara vpletena v nevronsko smrt, ki jo posreduje železo [10,15,35-38]. Predklinični dokazi podpirajo prednost uporabe kelatorjev železa, predvsem deferoksamin mesilata, proti nevrodegeneraciji, vključno z vsemi vrstami možganske kapi [7, 16]. Vendar so njihovi visoki stroški in nedostopnost ter širok spekter neželenih učinkov klasičnih kelatorjev železa privedli do uporabe naravnih kelatorjev za uravnavanje železa pri dishomeostazi [39,40].

Cistanche lahko izboljša imuniteto

Zaščitno delovanje Gos je prikazano na celicah HT-22 in mitohondrijih podganjih možganov, inkubiranih z mešanico železa/citrata, kjer smo našli močno zaščito pred oksidativnimi poškodbami, ki jih povzroča železo. Mišje hipokampalne celice HT-22, izpostavljene preobremenitvi z železom (24 h), so pokazale zmanjšano sposobnost preživetja, kar je bilo tesno povezano z zgodnjo disipacijo potenciala mitohondrijske membrane in zmanjšanjem ATP (slika 2A-C). To nakazuje, da mitohondrijska okvara prispeva k smrtnosti nevronov. Dejansko se pričakuje, da bo pod našimi pogoji vsaj del Fe(II), naloženega v nevrone, dosegel organele, saj je pred smrtjo nevronov, ki jo je povzročilo železo, sledila izguba mitohondrijske funkcije. Zato je bilo dokazano, da preobremenitev z železom povzroči smrt celic HT-22 mišjega hipokampusa in fragmentacijo mitohondrijev [41,42]. Podobno dolgotrajna izpostavljenost železu poveča mitohondrijske ravni ROS v celicah dopaminergičnega nevroblastoma SHSY5Y [43]. Poleg tega so po izpostavitvi 100 uM železovega železa potrdili obsežen dotok železa v nevrone hipokampusa in poškodbe mitohondrijev [36]. Tu smo opazili, da je ohranjanje sposobnosti preživetja hipokampalnih nevronov, na katere vpliva železo, ki ga povzroča Gos, tesno povezano z ohranjanjem njihovega potenciala mitohondrijske membrane in ravni ATP.

Tako kot v nepoškodovanih celicah je neposredna mitohondrijska izpostavljenost železovemu železu povzročila obsežno otekanje organele, razpršitev membranskega potenciala in izgubo ATP (slika 3A-C). V tem eksperimentalnem okolju je Gos lahko zaščitil z železom preobremenjene mitohondrije, kar se je izrazilo z ohranitvijo zgoraj navedenih parametrov. V tem smislu je bilo opaženo, da so mitohondriji, obremenjeni z mikromolarno koncentracijo železa, podvrženi mitohondrijskemu prepustnemu prehodu v pore in razpadu △Y na način, ki je občutljiv na kelacijo železa, vendar ni odvisen od antioksidativnega delovanja katalaze |44]. Zanimivo je, da so poročali, da antioksidant Mito-Tempo ščiti hipokampalne nevrone pred poškodbami zaradi preobremenitve z železom, tako da odstrani mitohondrijski superoksidni anionski radikal in ohrani mitohondrijsko morfološko celovitost in membranski potencial [36]. Pred kratkim smo opisali antioksidativne učinke tega flavonoida in njegovo sposobnost zaščite celic PC12 pred smrtjo, povzročeno s kemično hipoksijo [29], pri čemer smo ugotovili, da je lovljenje prostih radikalov in antioksidativna sposobnost Gos delno vključena v zaščito pred z železom posredovano. HT-22 in mitohondrijske poškodbe. Vendar pa izboljšana učinkovitost Gos proti lipoperoksidaciji, ki jo povzroča železo, v primerjavi z lipoperoksidacijo, ki jo povzroča tertbutil hidroperoksid (slika 4A, B), močno nakazuje, da je njegova sposobnost interakcije z železom glavni mehanizem proti poškodbam, ki jih povzroča železo.

Za nadaljnjo karakterizacijo interakcije Gos-Fe je bilo izvedenih več poskusov brez celic in mitohondrijev. Opazili smo, da ko je bil polifenol soinkubiran z Fe (II), koncentracija kovinskih ionov upada, medtem ko je prišlo do ustreznega povečanja stopnje porabe kisika (slika 5A-C). Ti učinki kažejo, da Gos odstrani Fe(II) iz citratnega kompleksa in ga oksidira v obliko železa v procesu, ki zahteva O2 kot akceptor elektronov. Posledično Gos spodbuja upad koncentracije Fe(II), ki lahko ovira hidroksilne radikale prek Fentonovih reakcij. Ker kompleks Gos-Fe(II) omogoča oksidacijo ustreznih reducentov, kot je askorbat, kar ima za posledico tvorbo/regeneracijo Fe(II), smo lahko dokazali, da Gos zavira redukcijo Fe(II), ki jo posreduje askorbat. na Fe(II).

Hipoteza, da Gos močno medsebojno deluje z železom, je bila tudi tukaj potrjena s spektroskopskimi tehnikami in podkrepljena s prejšnjimi rezultati, kjer so različni nizi

Stehiometrija kompleksa Gos-železo je bila označena z masno spektroskopijo z elektronsko spinsko ionizacijo [45].

Ti rezultati so dokazali zaščitne učinke Gos pred poškodbami nevronov, ki jih povzroča železo, verjetno z interakcijo z železovimi ioni, kar ovira njegovo vpletenost v tvorbo katalitskih reaktivnih kisikovih vrst. Poleg tega to kaže na tvorbo prehodnega kompleksa za prenos naboja med Fe(Ⅱ) in Gos, pospešuje oksidacijo Fe(II) in nastaja bolj stabilen kompleks Fe(III)-Gos, ki ne more sodelovati v fazi razmnoževanja lipidov peroksidacija. Poleg tega biološko pomembno redukcijsko sredstvo, kot je askorbat, ni moglo zmanjšati železovega železa v prisotnosti Gos, kar je omejilo prooksidantne lastnosti nekaterih flavonoidov, ki sodelujejo pri ponovnem kroženju železovih ionov. [30]. Gos v mikromolarnih koncentracijah je bil učinkovitejši od klasičnih čistilcev pri preprečevanju oksidacije 2-deoksiriboze, ki jo posreduje železo. To visoko učinkovitost lahko pripišemo tvorbi redoks-aktivnega Gos-Fe(II)/(), kot smo prej opazili za druge polifenole, ki so izboljšali svojo učinkovitost kot antioksidantov po interakciji z železom v različnih in vitro paradigmah oksidativne škode [ 22, 46-48].

Ugotovljeno je bilo, da lahko kelatna sredstva, ki vsebujejo kisik kot ligand (okso ligand, O2-), kelirajo železo in spodbujajo oksidacijo Fe(I), stabilizacijo Fe(II) in posledično povzročijo zmanjšanje njegov redukcijski potencial49]. Pri fiziološkem pH kateholi zlahka tvorijo termodinamično stabilne bis komplekse z železovim železom, čemur dajejo prednost nizke koncentracije ligandov. Prisotnost kateholnega dela v strukturi Gos kaže na podoben mehanizem interakcije z železom, kar bi lahko pojasnilo doseženo zaščito pred poškodbami nevronskih celic in mitohondrijev, ki jih povzroča železo. V zvezi s tem smo že prej dokazali, da mangiferin in gutiferon A spodbujata oksidacijo železovega železa in ovirata redukcijo železovega železa [23,24,26-28].

Sposobnost Gos, da kelira železo, lahko tudi spodbudi signalne poti, ki prispevajo k nevroprotekciji. Na primer, encimi domene prolil hidroksilaze (PHD), klasični encimi, ki inducirajo hipoksijo, lalfa (HIF-1o), ki spreminjajo hidroksilacijo pod normoksijo, so bili opredeljeni kot kritične tarče kelatorjev železa, ki so klinično koristni pri mnogih nevrološke motnje [50, 51]. To je razumljivo, saj je PHD odvisna od dvovalentnega železa kot sklopitvenega faktorja [52]. Več genov, ki so bili vključeni v nevroprotekcijo, regulira HIF-la, kot so eNOS, VEGF in EPO [53]. Poleg tega bi lahko aktivacija HIF, ki je posledica inhibicije PHD, preprečila mitohondrijsko okvaro in apoptozo, ki jo povzroča oksidativni stres, neodvisno od njegove vloge transkripcijskega faktorja [54].

Ferroptoza, nedavno označena od železa odvisna regulirana celična smrt, je bila predlagana kot mehanizem, prek katerega umrejo nevroni, izpostavljeni hemoragični poškodbi [8]. Mitohondrijska disfunkcija je bila nedavno povezana s celično smrtjo feroptoze [55]. Zato bi lahko bila inhibicija feroptoze, ki rešuje mitohondrijsko funkcijo pred poškodbami železa, tudi verjeten mehanizem za nevroprotekcijo pred z železom posredovanimi nevrološkimi motnjami, zaščitenimi z Gos, ki bi si zaslužile nadaljnjo pozornost. Opraviti je treba dodatne raziskave o domnevnih koristnih učinkih Gos na in vivo živalskih modelih nevrodegeneracije, povezane z železom, da bi predlagali ta flavonoid kot terapevtski poseg proti poškodbam možganskega tkiva, ki jih povzroča deregulacija homeostaze železa.