Uporaba fenolnih spojin iz vode oljčne vegetacije pri pitovnih piščancih: učinki na črevesno mikrobioto in na rok uporabnosti prsnih filejev 3. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

2.7.Oksidacija lipidov

Oksidacijo lipidov so proučevali z merjenjem sekundarnih (TBAR) in primarnih (D232 in D270)oksidacijaspojine (tabela 7). Med tremi poskusnimi skupinami niso opazili bistvenih razlik, čeprav je treba omeniti, da je prišlo do rahlega povečanja vrednosti TBAR za piščance v skupini L2 glede na tiste v skupinah L1 in L0, medtem ko je D232 pokazala nasprotni trend. Ta dva analitična indikatorja sta bila pomembno povezana (TBAR proti D232 r=-0).5,p<0.001 and="" tbars="" vs.="" d270r=""><0.05). the="" cooking="" treatment="" caused="" decreases="" in="" the="" primary="" oxidation="" products=""><0.01), which="" were="" followed="" by="" increases="" in="" the="" secondary="" ones="" (p=""><0.001). no="" interactions="" between="" diet="" and="" cooking="" were="" observed.="" on="" the="" contrary,="" [31]and="" [45]="" observed="" a="" significant="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" breasts="" from="" chickens="" whose="" diets="" were="" supplemented="" with="" either="" olive="" cake="" or="" omww.="" similarly,="" [46]="" observed="" a="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" quadriceps="" femoris="" of="" chickens="" whose="" diets="" were="" enriched="" with="" omww="" permeate="" and="" the="">

Za več informacij kliknite tukaj

Oke et al. [16] so dodali različne količine izvlečka oljčnih listov (5, 10 in 15 ml/liter) v pitno vodo, dobavljeno brojlerjem seva Abor acre, pri čemer so opazili pomemben učinek na znižanje ravni malondialdehida (MDA) v krvi. Ibrahim idr. [42], so opazili znatno zmanjšanje koncentracije MDA v piščančjih prsih, pridobljenih z dodajanjem prehrane z naraščajočimi vsebnostmi fermentiranih ali encimsko fermentiranih posušenih oljčnih tropin. Za razliko od drugih študij v pričujoči niso opazili zaščitnega učinka proti oksidaciji mišične maščobe v mišičnem tkivu. Obstaja veliko dejavnikov, ki povzročajo variabilnost in razlike med študijami. Poleg pasme živali in dolžine obdobja pitanja lahko drugi dejavniki, kot so hranilna sestava obroka, vnos krme, temperatura okolja in drugi stresni pogoji vodijo do zelo različnih rezultatov, ki jih je pogosto težko primerjati. Ne zadnja vrsta matrice, s katero je prehrana obogatena s fenoli (oljčne pogače, oljčne tropine, izvleček oljčnih listov, rastlinski vodni izvleček, če naštejemo samo nekatere) zaradi koncentracije aktivnih spojin in prisotnosti dodatnih snovi s sinergističnim ali zaščitnim delovanjem, prisotnim v istem matriksu, lahko pomembno vpliva na antioksidativno delovanje tako in vivo kot v mesnem tkivu po zakolu [47]. Potencialne zdravstvene koristi vključevanja antioksidantnih dodatkov v sveže meso in mesne izdelke niso vedno dokazane [48]. Nasprotno, številne primarne in sekundarne lipidne in beljakovinske oksidacijske spojine, kot nprhidroperoksidi, epoksidi,4-hidroksinonenal, malonaldehidso prepoznane kot potencialne rakotvorne snovi ali lahko vplivajo na prenos celičnega signala, kot je to v primeru karbonilnih spojin [49]. V primeru svežega mesa je možnost povečanja antioksidativnega potenciala z obroki živali zelo sugestivna možnost, zlasti pri uporabi naravnih in ne sintetičnih snovi. Dejansko je za razliko od mesnih izdelkov, kjer tehnologija ponuja različne možnosti intervencije za povečanje antioksidativnega potenciala, pri svežem mesu edina alternativa intervenciji s prehrano živali obdelava, usmerjena na površino izdelka, ki pa mora biti v skladu z veljavno zakonodajo. Preostala količina fenolov, izmerjena v prsnem mesu te študije, verjetno ne bo imela neposrednih koristi za zdravje, lahko pa posredno. Kuhanje mesa, na primer, povzroči neto izgubo antioksidativne obrambe tkiva, zato obogatitev mesnega tkiva s spojinami, ki so še vedno aktivne tudi po toplotni obdelavi, kot je v primerufenoli, je zelo zanimiva za uporabo zaradi podaljšanja roka uporabnosti in varnosti samega izdelka. Razlog, zakaj niti v videu niti v prejšnjem videu niso bili opaženi učinki kot posledica poskusa hranjenja s CPC, si zasluži nadaljnje eksperimentalne preiskave, zlasti glede interakcije medprehranski polifenoliin črevesno mikrobioto piščanca, na katero vpliva pomemben del možnih biokemičnih učinkov fenolov [9,10].

3. Materiali in metode 3.1. Eksperimentalni objekti

Preskus je bil izveden v perutninski hiši poskusne farme Univerze v Padovi (Legnaro, Padova, Italija) po 6 mesecih izpada. Perutninska hiša je bila opremljena s hladilnim sistemom, prisilnim prezračevanjem, sevalnim ogrevanjem in sistemi nadzorovane svetlobe. Skupno je bilo uporabljenih 12 boksov z žično mrežo (2,5×2,4 m; 6 m2), vsak opremljen s petimi nastavki (razdalja: 20 cm) in krožnim podajalnikom (premer: 30 cm) za ročno razdeljevanje krme. Vsak boks je imel betonska tla, prekrita s steljo iz lesenih ostružkov (globina 5 cm, 2,5 kg/m).

Svetloba je bila zagotovljena 24 ur na dan prva 2 dni po prihodu piščancev v kokošnjak. Nato se je število ur svetlobe postopoma zmanjševalo, dokler ni bila dosežena fotoperioda 18L:6D, ki se je nato vzdrževala od 12. dni starosti dalje.

Cistanche lahko izboljša imuniteto

3.2. Živali, poskusne skupine in posnetki in vivo

Študijo je odobril Etični odbor za poskuse na živalih (Organismo per la Protezione del Benessere Animale; OPBA) Univerze v Padovi (projekt 17/2016; št. 154392 z dne 10. maja 2016). Z vsemi živalmi so ravnali v skladu z načeli Direktive 2010/63/EU[50] o zaščiti živali, ki se uporabljajo v poskusne in druge znanstvene namene. Raziskovalci, vključeni v ravnanje z živalmi, so bili bodisi strokovnjaki za živali (doktorat ali magisterij iz zootehnike) in/ali veterinarji.

Skupaj 144 1-dnevnih piščancev (Ross 308) je komercialni tovornjak v skladu z Uredbo Sveta (ES) št. 1/2005 [51] dostavil v poskusne prostore univerze. Vsi piščanci so bili v valilnici cepljeni proti Marekovi bolezni, infekcijskemu bronhitisu in atipični kokošji kugi. Piščanci so bili posamično stehtani na dan prihoda, označeni z oznako noge, naključno razporejeni med 12 ograd (12 ptic na ogrado in 10 ptic/m²).）,in nato stehtali enkrat na teden, da bi izmerili njihovo živo težo do komercialnega zakola. Porabo krme v peresnici so med preskušanjem merili dnevno. Med preskušanjem (Martini SpA Longiano, Forli-Cesena, Italija) so dajali tri komercialne diete v obliki drobtin: dieto P1 od 0 do 23 dni, dieto P2 od 24 do 37 dni in dieto P3 od 38 dni do zakol pri 48 dneh (glej dopolnilno gradivo za analitične podatke, tabela S1). Surovi fenolni koncentrat (CPC) je bil pridobljen, kot je opisano v [12], na kratko, OVW smo obdelali z uporabo encimov s pektinazo in hemiceluloznimi aktivnostmi ter jih nato podvrgli mikrofiltraciji, ultrafiltraciji in reverzni osmozi. CPC je bil dodan dietam na naslednji način:( i)L0 Kontrolna prehrana (P3), (ii)L1 Kontrolna prehrana plus CPC (220 mg/kg krme kot teoretični skupni fenoli), (i) L2 Kontrolna prehrana plus CPC (440 mg/kg krme kot teoretično skupni fenoli). Dejanska vsebnost posameznih fenolnih spojin CPC in diet je bila navedena v tabeli S2. Vsaka dieta je bila ponovljena v štirih boksih (homogenih za začetno živo težo in variabilnost). CPC je bil dobavljen od starosti 24 dni (d) do komercialnega zakola pri 48 d (glejte Dodatni material za fenolno sestavo CPC). Vse živali so bile ves čas preskušanja hranjene ad libitum, dopolnjene diete pa so bile pripravljene tedensko.

Za določitev sestave črevesne mikrobne skupnosti so bili zbrani kloakalni brisi (4 živali/ogradi) pri starosti 23, 34 in 44 dni za skupno 12 živali (4 na vsaki dieti), ki so bile testirane trikrat (36 brisov skupno zbranih vzorcev).

3.3. Komercialni zakol ter beleženje kakovosti trupov in mesa

Pri starosti 48 dni so bili vsi piščanci po odvzemu krme in vode (7 oziroma 2 uri) zaklani v komercialni klavnici. Piščanci so bili posamezno stehtani pred dajanjem v zaboj. Vsi piščanci iz obore so bili naloženi v transportno kletko (višina 62,5 cm × 160 cm × 25,0 cm; površina tal, 1 m²）. Nakladanje in transport iz poskusnih prostorov v komercialno klavnico in začasno namestitev pred zakolom je trajalo približno 3 ure. Piščanci so bili zaklani v skladu s standardno prakso komercialne klavnice. Trupi so bili pridobljeni po 2 urah hlajenja pri 2 stopinjah in posamezno stehtani, da bi izmerili odstotek zakolnega premaza [52].

Štiriindvajset ur po zakolu so bila trupa razrezana, da so bile velike prsne mišice ločene od prsi [53].

Med poskusom je bila zabeležena izguba 17,4 odstotka (25 piščancev) zaradi pogina. Od 119 trupel je bilo 72 dodeljenih mikrobiološkim analizam med rokom uporabnosti (razdelek 2.4 pojasnjuje ugotavljanje sestave mikrobiote dojk z metodami, odvisnimi od kulture in neodvisnimi), medtem ko je bilo preostalih 47 zamrznjenih (-40 stopnje ) in se nato uporabi za oceno približne sestave in stopnje oksidacije lipidov surovega in kuhanega mesa (odstavek 3.5).

3.4. Ocena roka uporabnosti

3.4.1. Priprava pakiranih piščančjih prsi

P major mišice so bile posamično pakirane v polietilenske pladnje nizke gostote, zavite v 12 μm debelo PVC folijo（Weigel,KOEX412,Gruppo Fabbri,Vignola,Modena,Italija) in shranjen pri 4±1 stopinji v hladilni omari (Majolo" Plus 100 Seasoning Controller, Majolo, Cadoneghe, Padova, Italija). Izpostavljenost svetlobi je bila določena od 8:00 do 20:00 z uporabo 36 W fluorescenčne sijalke [54]. Nastavitve shranjevanja so bile zasnovane z namenom, da posnemajo pogoje hlajenja med prodajo. Paketi so bili naključno vzorčeni po 24, 72, 120, 180, 216 in 264 urah od datum zakola

3.4.2. Senzorična analiza

Senzorično ocenjevanje svežih prsi je bilo izvedeno v skladu z [37] z uporabo slabega 3-točkovnega sistema (1=nesprejemljivo,2=sprejemljivo, 3=dobra kakovost). Sintetični senzorični indeks (SI) je bil izračunan kot [(2 × rezultat vonja plus 2 × rezultat barve plus 1 × rezultat teksture)/5], pri čemer je rezultat 1,8 deloval kot prag za opredelitev pokvarjenih vzorcev. Senzorično analizo je izvajalo osem usposobljenih panelistov.

3.4.3. Mikrobiološka analiza prsnega mesa v obdobju uporabnosti

Mikrobiološke analize so bile izvedene v skladu s postopki, ki jih opisuje [38]. Velike prsne mišice (približno 2 cm dolge × 1 cm globoke × 2 cm široke) so aseptično izrezali vzdolž vsake dojke, da smo dobili reprezentativen vzorec 25 na dojko. Vzorci so bili zmešani v želodčni vrečki z 225 ml pufrirane peptonske vode in analizirani po ustreznih razredčitvah. Za ekstrakcijo DNK smo 1 ml vsakega homogenata zbrali v 2 ml Eppendorfove epruvete in centrifugirali pri 13.500 × g 1 minuto (centrifuga Eppendorf 5425, Hamburg, Nemčija). Nato smo supernatant zavrgli in peleto zamrznili na -80 stopinj. Več mikrobnih tarč je bilo raziskanih, da bi opisali dinamiko mikrobne populacije v obdobju uporabnosti, kot sledi: Skupno število živih organov (TVC) in skupno psihotrofno število (TPC) sta bila ovrednotena na ploščastem agarju (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francija) , plošče pa smo inkubirali pri 30 stopinjah 72 ur ali pri 4 stopinjah 10 dni. Enterobacteriaceae smo popisali z vijolično rdečim žolčnim glukoznim agarjem (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francija) pri 37 stopinjah 24 ur. Mlečnokislinske bakterije (LAB) so bile analizirane na agarju De Man, Rogosa in Sharpe (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francija) v anaerobnih pogojih pri 30 stopinjah 48 ur. Pseudomonas spp. štetje je bilo ocenjeno na bazi agarja Pseudomonas, dopolnjenem s cetrimidom, fucidinom in cefaloridinom pri 25 stopinjah 48 ur (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK). Štetje bakterij, ki proizvajajo H2S (domnevna Shewanella spp.), je bilo izvedeno na železovem agarju (Lyngby, Laboratorios Conda, Torrejon de Ardoz, Španija) pri 25 stopinjah 48 ur. Rezultati so navedeni kot log10 CFU/g mesa.

3.4.4.pH in izguba kapljanja

pH meter (Portamess 910, Knick, Berlin, Nemčija), opremljen s posebno elektrodo (Mettler Toledo, Milano, Italija), je bil uporabljen za merjenje pH vrednosti z vstavitvijo v velike prsne mišice v treh izvodih na njihovi ventralni strani. Izguba kapljanja je bila ocenjena v skladu z metodo, ki jo je predstavil [55] z uporabo metode vrečk. Približno 2,5 cm dolge rezine, odrezane s površine dorzalnih prsi, smo vstavili v polietilenske vrečke in suspendirali čez noč pri 2±1 stopinji C. Izguba kapljanja (v odstotkih) je bila izračunana z naslednjo enačbo: [(začetna teža – končna teža)/začetna teža ].

3.4.5. Koncentracija fenola v prehrani in v prsni mišici

Ekstrakcija fenolov je bila izvedena na 5 g mletega dietnega vzorca, pomešanega s 50 mL metanola/vode (80/20(o/o)raztopina, ki vsebuje 20 mg/L butiliranega hidroksi-toluena (BHT), zmes homogenizirali s pomočjo paličastega razpršilca ​​(IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Nemčija) 1 minuto pri 7000 obratih na minuto, centrifugirali pri 9327×g 10 minut in pridobili supernatant.Postopek smo dvakrat ponovili in zbrani ekstrakt nato koncentriramo z rotacijskim uparjalnikom (Buchi Rotavapor, R-210, Švica), dokler ne dosežemo končne prostornine 20 mL. Kartuše SPE Bond Elut Jr-C18, 1 g (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA) ), ki je bil predhodno aktiviran z 10 ml metanola in 10 ml vode, je bil napolnjen z 1 ml vodnega ekstrakta, elucija je bila izvedena s 50 ml metanola. Po odstranitvi topila v vakuumu je bil fenolni ekstrakt solubiliziran v 1 ml raztopine sestavljen iz metanola/vode (50:50 v/v) in filtriran skozi poliviniliden fluorid (PVDF) filter za brizgo (0,2 mm). kvalitativno in kvantitativno analizo fenolnih spojin ekstrakta je izvedla v skladu z [31]

HPLC (Mod. 1100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA), opremljen s kolono C18 (Spherisorb ODS-1(250 mm × 4,6 mm) velikost delcev 5 um, dobavitelj Waters SpA (Milano, Italija) Fenolne spojine so bile odkrite z uporabo DAD, nastavljenega na 280 nm. Kvantifikacija polifenolov je bila določena z uporabo posameznih umeritvenih krivulj za vsako spojino, rezultati pa so izraženi kot mg kg-1. Hidroksitirozol (3,{{ 10}}DHPEA) je bil pridobljen pri Cabru SpA (Milano, Italija), tirosol p-HPEA je bil kupljen pri Merck Life Science Srl (Milano, Italija), verbaskozid pa je bil vzet pri Extrasynthese (Genay, Francija). de-karboksimetil oleuropein aglikon (3,4-DHPEA-EDA) smo ekstrahirali iz deviškega oljčnega olja po postopku, opisanem v [56].

Skupno 10 gramov mesa smo zmešali s 50 ml metanola in vode（80/20,o/ø）ki vsebuje mravljično kislino {{0}}.2 odstotka in 20 mg/L BHT. Raztopino smo homogenizirali s paličastim dispergatorjem (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Nemčija) 1 minuto pri 7000 obratih na minuto, centrifugirali pri 4146 × g 10 minut in pridobili supernatant. Postopek smo ponovili dvakrat in zbrali dva alikvota ekstrakta ter odstranili metanol z rotacijskim uparjalnikom (Buchi Rotavapor, R-210, Švica). Dvajset ml vodnega ekstrakta smo naložili v kartuše SPE Bond Elut HF Mega BE-C18,5g (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA), predhodno aktivirane z 20 ml metanola in 20 ml vode; elucijo smo izvedli s 50 ml metanola. Po odstranitvi topila pod vakuumom smo fenolni ekstrakt obnovili z 0,5 ml raztopine, sestavljene iz metanola/vode.（50∶50 o/ø）in filtriramo skozi poliviniliden fluorid（PVDF）filter za brizgo (0,2 mm). HPLC analize fenolnih ekstraktov so bile izvedene v skladu z [56] z isto opremo, kot je navedeno zgoraj. Hidroksitirozol smo zaznali z uporabo fluorescenčnega detektorja (FLD), ki je deloval pri valovni dolžini vzbujanja 280 nm in emisiji 313 nm. Kvantifikacija hidroksitirozola je bila izvedena z uporabo umeritvene krivulje, rezultati pa so izraženi kot ug/kg.

3.5. Približna sestava, izguba pri kuhanju in analiza maščobnih kislin

Približna sestava, profil maščobnih kislin in oksidativna stabilnost so bili ovrednoteni na surovih (desna stran P. major) in kuhanih (leva stran P. maijor) vzorcih. Po odtajanju je bila izguba pri kuhanju ovrednotena v skladu z [53] z naslednjimi spremembami: Leva polovica vsake prsi je bila stehtana, vakuumsko zapakirana in kuhana v vodni kopeli pri 8 0 stopinj 45 minut. Po tem so prsi ohladili na 4 stopinje in jih hranili v hladilniku (4 stopinje) 72 ur, preden so jih razpakirali in ponovno stehtali, da bi izračunali izgubo pri kuhanju kot [(teža surovega mesa-teža kuhanega mesa)/teža surovega mesa ]×100). Mišica, tako surova kot kuhana, je bila fino zmleta (dvakrat 2500 vrt/min × 10 s, Retsch, Dusseldorf, Nemčija) in podvržena analizi vlage, surovih beljakovin in pepela [57], medtem ko je bila vsebnost surove maščobe določena s predstavljeno metodo avtor [58]. Na kratko, 200 ml mešanice diklorometana/metanola 1:1 smo dodali k 5 g vzorca, homogenizirali pri 11 000/min 1 minuto (Ultraturrax T25 Basic, Ika Werke. Staufen, Nemčija) in inkubirali pri 60 C v pečici (PID sistem, M120-VF, MPN instruments, Bernaggio, MB, Italija) 20 min. Nato dodamo še 100 mL diklorometana in po homogenizaciji (11,000/min 1 min) vzorec filtriramo (hitri filter papir) in permeatu dodamo 100 mL KCl 1 M. Po centrifugiranju (AvantiJ-E, Beckman Coulter, Brea, CA, ZDA) pri 1000 × g 30 m pri 4 stopinjah smo supernatant izpraznili in organski ekstrakt filtrirali skozi brezvodni natrijev sulfat. Alikvot (približno 10 g) smo uporabili za gravimetrično določitev odstotka maščobe, preostanek smo destilirali (Rotavapor"R-210, Büchi, Essen, Nemčija), brezvodno maščobo pa uporabili za nadaljnjo analizo. Maščobna kislina metilne estre (FAME) smo pripravili s stehtanjem 0,015 g brezvodne maščobe v stekleno epruveto z navojno zaporko [39], ki smo jo raztopili z 1 ml 3 M metanolne HCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in inkubirali 2 uri pri 60 stopinjah. Nato smo dodali 1 ml deionizirane vode in,po mešanju,FAME smo pridobili v 1 ml n-heksana. FAME（1 μL）so bili analizirani s plinskim kromatografom (Shimadzu Italia Srl, model 2014, Milano, Italija), opremljenim s plamensko ionizacijskim detektorjem (nastavljenim na 250 stopinj) in injektorjem split-splitless (nastavljenim na 280 stopinj). Toplotna komora, v kateri je bila kapilarna kolona (Supelco SP -2560; 100 m × 0, 25 mm × 0, 2 um), je bila 8 minut pri 60 stopinjah. Temperaturo smo nato povečali na 120 stopinj za 1 minuto s hitrostjo 10 stopinj/min in nato s 120 na 240 stopinj s hitrostjo 2,5 stopinje C/min. Končno izotermo smo vzdrževali pri 240 stopinjah 20 minut. Maščobne kisline so bile identificirane z zunanjo standardno mešanico (37 Component FAME Mix, Supelco, Nemčija). Analize so bile narejene v dvojniku.

3.6. Oksidacija lipidov

Primarne oksidacijske spojine so bile določene kot konjugirani dieni s spektrofotometrično analizo v ultravijoličnem polju z uporabo spremenjene različice metode, navedene v prilogi uredbe Sveta EU/2015/1833 [59]. Na kratko, 0.01 ± 0,001 g brezvodne maščobe smo natehtali v 10 ml merilno bučko in raztopili v cikloheksanu spektrofotometrične stopnje do oznake. UV/Vis spektrofotometer (Mod. 7800 Jasco UV/VIS, Oklahoma City, OK, ZDA) je bil uporabljen za določitev specifičnih vrednosti ekstinkcije pri 232 (konjugirani dieni) in 270 nm (konjugirani trieni) z uporabo istega topila kot referenca. Sekundarne produkte oksidacije lipidov smo določali po metodi, ki jo je predstavil [60] z modifikacijami, in sicer: v centrifugirno epruveto 8 mL vodne raztopine 5-odstotne (m/v) trikloroocetne kisline in 5 mL n-heksana. smo dodali približno 2 g homogeniziranega vzorca. Po homogenizaciji z Ultraturraxom 30 s pri visoki hitrosti. vzorec smo centrifugirali 3 minute pri 3000 × g pri 4 °C (Eppendorf 5810R; Eppendorf, Hamburg, Nemčija) in odstranili supernatant. Vzorec smo filtrirali skozi hitri papirnati filter in 2,5 ml filtrata dodali k 2,5 ml vodne raztopine 0,02 M tiobarbiturne kisline in inkubirali 35 minut pri 95 stopinjah C v termostatirani kopeli (labor ED{{31} }; Seelbach, Baden-Württemberg, Nemčija). Po ohlajanju smo izmerili absorbanco s spektrofotometrom, nastavljenim na valovno dolžino 532 nm. Podatki so izraženi v miligramih malondialdehida na kilogram mesa. Meritve so bile izvedene v dvojniku na kuhanih in surovih piščančjih prsih.

3.7. Ekstrakcija DNK in priprava knjižnice NGS

DNK smo ekstrahirali z DNeasy PowerSoil DNA Isolation Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija). Pelete homogenata prsnega mesa smo odmrznili s 600 uL liznega pufra, ki je bil priložen kompletu. Kloakalne brise smo odrezali s sterilnimi škarjami, dali v mikrocev, ki je vsebovala 600 uL liznega pufra in 6 uL 2-merkaptoetanola (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Epruvete smo dobro premešali z vrtinčenjem 5 minut in brise odstranili. Tako za vzorce kloake kot za pelete prsnega mesa je bilo dodanih skupno 100 mg sterilnih 0,1 mm kroglic (BioSpec, Bartlesville, OK, ZDA) in uporabljen mlin za kroglice (TissueLyser, Qiagen, Hilden, Nemčija) za prekinitev hitri koraki stresanja (2×30 s pri 30 Hz). Dodali smo skupno 40 uL proteinaze K (Qiagen, Hilden, Nemčija) in inkubirali pri 56 stopinjah 90 minut. Po tem koraku so sledili navodilom proizvajalca DNeasy PowerSoil9DNA Isolation Kit. Koncentracijo in čistost DNA smo analizirali s spektrofotometrom (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA).

Za izdelavo knjižnice 16S DNA je bil uporabljen dvostopenjski pristop pomnoževanja. Vzorci so bili pomnoženi v 20-μL reakcijah,vsak je sestavljen iz 5 μL razredčene DNA,{{0}}.4 uM vsakega primerja (Tabela 1), 0,25 mM deoksinukleotida (dNTP), 1 × Phusion HF pufra in 1 U Phusion High-Fidelity DNA polimeraze (New England BioLabs, Inc., Ipswich , MA, ZDA). PCR je bil izveden v 2720 Thermal Cyclerju (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) s 25 cikli 95 stopinj za 30 s, 60 stopinj ali 49 stopinj C za 30 s, 72 stopinj C za 45 s in končno podaljšanje 7 minut pri 72 stopinjah. Na vzorec smo izvedli tri ponovitve PCR.

Produkti so bili prečiščeni s kompletom za čiščenje SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, ZDA) in po čiščenju kroglic je bil ciljni pas potrjen z uporabo 1,8-odstotnega agaroznega gela. Črtne kode so bile uvedene z drugo analizo PCR s primerji, ki vsebujejo črtno kodo, značilno za platformo. Vsaka 50-uL reakcija PCR je vsebovala produkt PCR, 0.2 μMof vsakega primerja（Tabela 1）,0.3 mMdNTP,1×Phusion HFbuffer,and1UPhusion DNA polimeraza visoke ločljivosti. Izvedenih je bilo deset ciklov zgoraj opisanega profila PCR.

Produkte PCR smo očistili s kompletom za čiščenje SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, ZDA). Po končnem čiščenju je bil vsak vzorec kvantificiran z uporabo fluorometra Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies, Monza, Italija). Kakovost knjižnice pomnožev je bila testirana z uporabo bioanalizatorja Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, ZDA). Knjižnice so bile sekvencirane z uporabo platforme Illumina MiSeq s parnim koncem 300-cikla (Macrogen Inc., Seul, Koreja).

4. Sklepi

Obogatitev prehrane piščancev s fenoli, pridobljenimi s filtracijo in koncentracijo vegetacijske vode oljarn za 24 dni, ni bila povezana z razlikami v rasti živali, stopnji pretvorbe krme ali pridelku trupov. Študija črevesne mikrobiote je pokazala pomemben vpliv časa hranjenja, ne pa prehrane same po sebi na menjavo mikrobnih skupin. Po drugi strani pa je sestava mikrobiote mesa v obdobju trajanja pokazala večjo rast Pseudomonas v vzorcih piščancev, ki so uživali krmo, obogateno s fenoli. Nazadnje, med dietami niso opazili razlik glede analitičnih markerjev (TBAR in konjugiranih dienov) procesa oksidacije lipidov. Namesto tega je bil hidroksitirozol identificiran v mišičnem tkivu vzorcev piščancev, ki so jedli krmo z dodanimi fenoli, kar kaže črevesno absorpcijo, odvisno od odmerka. Ker se oksidativni proces pojavlja predvsem v strukturi membrane mišičnih celic, so potrebne nadaljnje študije za boljše razumevanje porazdelitve HT v celičnih in zunajceličnih predelih.

Ta članek je izvleček iz Molecules 2021, 26, 4307. https://doi.org/10.3390/molecules26144307 https://www.mdpi.com/journal/molecules