HDAC{0}}posredovana regulacija signalizacije GABA znotraj lateralnega septuma olajša dolgotrajno izumrtje socialnega strahu pri mišjih samcih

Socialno anksiozno motnjo (SAD) povzročajo travmatične socialne izkušnje. Zanj je značilen intenziven strah in izogibanje družbenim kontekstom, kar je mogoče robustno oponašati s paradigmo pogojevanja socialnega strahu (SFC). Faza izumrtja paradigme SFC je podobna terapiji izpostavljenosti za SAD in zahteva učenje ločitve travme od družbenega konteksta. Z učenjem povzročena acetilacija histonov je kritična za nastanek spomina na izumrtje in njegovo vzdržljivost. Čeprav histonske deacetilaze razreda I (HDAC) uravnavajo zgoraj omenjeni proces učenja, ni jasnosti v izoformah in prostorski specifičnosti v funkciji HDAC pri socialnem učenju. Z uporabo paradigme SFC smo funkcionalno označili vlogo HDAC1, posebej v lateralnem septumu (LS), pri uravnavanju nastajanja dolgoročnega spomina na izumrtje socialnega strahu.

Indukcija je zelo pomembna pri učenju. Z ustrezno indukcijo lahko učenci bolj zavestno sprejmejo znanje ter globlje razumejo in si zapomnijo učno vsebino. To je zato, ker je spomin ljudi neke vrste duševna dejavnost in manifestacija inteligence. Indukcija je pozitivna in ustvarjalna kognitivna dejavnost, ki lahko spodbuja in vodi razmišljanje in domišljijo ljudi med kognitivnim procesom ter tako krepi spomin.

Indukcijo lahko dosežemo na različne načine. Na primer, učitelji lahko med predavanji postavljajo probleme in študentom pustijo, da sami razmišljajo o rešitvah, kar lahko študentom pomaga izboljšati njihovo sposobnost celovite analize problemov in spomin. Poleg tega lahko učitelji uporabljajo tudi bogate učne vire, kot so slike, avdio, video in drugi načini za spodbujanje učenčevega absorbiranja in pomnjenja znanja.

Zaradi tega obstaja tesna povezava med indukcijo in spominom. Z ustrezno indukcijo lahko učenci globlje razumejo znanje in bolje obvladajo učne vsebine. To globoko razumevanje bo učencem pomagalo ohraniti znanje za daljše obdobje in olajšalo prožno uporabo naučenega pri kasnejšem učenju in praksi.

Skratka, indukcija in spomin sta neločljiva. Z nenehnim raziskovanjem in prakso moramo poiskati ustrezno učno metodo in metodo uvajanja ter nenehno izboljševati svoj spomin in stopnjo učenja. Samo tako lahko v prihodnjem življenju v celoti izkoristimo svoje talente. Vidi se, da moramo izboljšati spomin. Cistanche lahko izboljša spomin, ker je cistanche tradicionalno kitajsko zdravilno sredstvo s številnimi edinstvenimi učinki, med katerimi je tudi izboljšanje spomina. Učinkovitost mletega mesa izhaja iz različnih učinkovin, ki jih vsebuje, vključno s karboksilno kislino, polisaharidi, flavonoidi itd. Te sestavine lahko spodbujajo zdravje možganov prek različnih kanalov.

Kliknite poznajte dodatke za povečanje spomina

Izmerili smo lokalno povečanje fosforilacije HDAC1, ki inducira aktivnost, pri serinskih ostankih miši s socialnim strahom in d (SFC+) kot odgovor na izumrtje socialnega strahu. Ugotovili smo tudi, da funkcija LS-HDAC1 negativno korelira z učenjem o izumrtju akutnega socialnega strahu z uporabo farmakoloških in virusnih pristopov. Poleg tega je inhibicija LS-HDAC1 povečala izražanje podenote GABA-A receptorja 1 (Gabrb1) pri miših SFC+, aktivacija receptorjev GABA-A pa je olajšala učenje akutnega izumrtja. Končno je olajšanje učenja izumrtja z inhibicijo HDAC1 ali aktivacijo receptorja GABA-A znotraj LS povzročilo nastanek dolgotrajnega spomina na izumrtje, ki je trajal celo 30 dni po izumrtju. Naši rezultati kažejo, da je HDAC1-posredovana regulacija signalizacije GABA v LS ključna za oblikovanje spomina na izumrtje socialnega strahu.

UVOD

Za socialno anksiozno motnjo (SAD), ki jo povzroča averzivna socialna izkušnja, je značilen intenziven strah in izogibanje socialnim situacijam [1, 2]. Zdravljenje SAD je sestavljeno iz kognitivno-vedenjske terapije (CBT), ki temelji na izpostavljenosti, ki ustvarja "varnostni" spomin, ki obstaja sočasno s prvotnim averzivnim spominom [3, 4]. Ker lahko isti znak aktivira tako averzivne kot varnostne spomine, tekmujejo, ko jih prikličejo ustrezni dražljaji, prevladujoča spominska sled pa določa vedenjski izid. Znano je, da se varnostni spomin, ustvarjen s CBT na podlagi izpostavljenosti, sčasoma zmanjša, kar povzroči ponovitev predhodno izginulih odzivov na strah pri bolnikih z SAD [5–7]. Zato je nujno razumeti mehanizme, na katerih temelji trajen spomin na izumrtje, da bi razvili terapevtske strategije, ki vodijo do popolnejše in močnejše remisije SAD.

V ta namen smo vzpostavili paradigmo operantnega socialnega strahu (SFC), ki ustvarja močan strah in izogibanje sorodnikom pri miših [8]. V tej paradigmi izumrtje socialnega strahu in oblikovanje spomina na izumrtje sprožita zaporedna predstavitev različnih družbenih dražljajev (neznanih sorodnikov), kar povzroči postopno izgubo strahu in povečano socialno raziskovanje [9]. Prejšnje študije iz našega laboratorija so pokazale vpletenost lateralnega septuma (LS) v izumrtje socialnega strahu, ki ga povzroča SFC, pri miših [10, 11]. Znano je tudi, da LS uravnava različna družbena vedenja [12], ki so podprta s kompleksnimi epigenetskimi mehanizmi [13]. Vendar pa epigenetski mehanizmi znotraj LS, ki uravnavajo izumrtje socialnega strahu in oblikovanje dolgoročnega spomina na izumrtje, ostajajo neznani.

Skladni dokazi kažejo na pomen posttranslacijske acetilacije N-terminalnih repov histonskih ostankov pri utrjevanju in vzdrževanju spomina na strah [14]. Histonske deacetilaze razreda I (HDAC), ki katalizirajo odstranitev acetilnih skupin iz teh N-terminalnih repov histonov, so bistveni regulatorji genske ekspresije, na kateri temelji učenje in spomin [15]. Ti HDAC razreda I, vključno s HDAC1, HDAC2, HDAC3 in HDAC8, kažejo izjemno prostorsko in kontekstualno odvisnost v svoji funkciji.

Na primer, ugotovljeno je bilo, da hipokampalni HDAC1 krepi asociativni spomin v kontekstualni paradigmi pogojevanja strahu [16], medtem ko je hipokampalni HDAC2 funkcionalno povezan z okvaro dolgotrajnega oblikovanja objektov in prostorskega spomina [17, 18]. Podobno je bila aktivnost HDAC1 regulirana navzgor, medtem ko je bila aktivnost HDAC2 znižana v amigdali oziroma prefrontalnem korteksu po kondicioniranju strahu [19]. Študije so prav tako vključevale diferencialni prispevek HDAC3 pri oblikovanju robustnih averzivnih kontekstualnih spominov in spominov na strah v hipokampusu oziroma bazalni amigdali [20].

Glede na raznolike in zapletene funkcije HDAC razreda I pri uravnavanju učenja in spomina se zaviralci HDAC pogosto uporabljajo kot kognitivni ojačevalci v več predkliničnih študijah [21]. Vendar prispevek specifičnih HDAC pri uravnavanju vzdržljivosti spomina na izumrtje socialnega strahu ostaja nedosegljiv.

Tako smo v tej študiji preučili regulacijo HDAC razreda I v kontekstu paradigme SFC. Na podlagi povečanja serinske fosforilacije HDAC1 po izumrtju, ki inducira aktivnost, smo manipulirali s funkcijo LS-HDAC1 z uporabo farmakološke inhibicije in prekomerne ekspresije virusa. Poleg tega smo ob spremljanju povečanja izražanja gena, ki kodira 1 podenoto receptorja gama-aminomaslene kisline (GABA) A (Gabrb1) kot odgovor na kombinacijo blokade HDAC1 in treninga ekstinkcije, aktivirali receptor GABA-A signalizacijo znotraj LS. Končno smo testirali učinek inhibicije LS-HDAC1 in aktivacije receptorja LSGABA-A na dolgoročno tvorbo spomina na izumrtje. Naši rezultati kažejo, da LS-HDAC1 negativno uravnava učenje izumrtja socialnega strahu in dolgoročno učenje izumrtja socialnega strahu prek signalizacije GABA-A.

MATERIALI IN METODE

Živali

Samci miši CD1 (Charles River Nemčija, stari 8–11 tednov na začetku poskusov) so bili nameščeni v skupini v standardnih laboratorijskih pogojih (12/12 h cikel svetloba/tema, luči prižgane ob 06:00, 22 stopinj, 60 % vlažnost, hrana in voda ad libitum) v polikarbonatnih kletkah (16 × 22 × 14 cm) do operacije ali 3 dni pred vsakim vedenjskim poskusom. Kot družbeni dražljaji v paradigmi SFC so bili uporabljeni samci miši CD1, ki so ustrezali starosti in teži. Vsi poskusni postopki so bili izvedeni med 08:00 in 12:00 h po Navodilih za nego in uporabo laboratorijskih živali vlade Unterfranken, smernicah ARRIVE [22] in smernicah AMERIŠKI NACIONALNI INŠTITUT ZA ZDRAVJE.

SFC paradigma

SFC je bil izveden, kot je opisano prej [8] z manjšimi spremembami za analizo dolgoročnega izumrtja:

Pridobivanje socialnega strahu (1. dan). Miši so postavili v komoro za kondicioniranje strahu in jim pustili, da so se navadile 3 0 s, preden so jih za 3 minute izpostavili prazni kletki z žično mrežo, med katero so lahko prosto raziskovali predmet. Nato je bila prazna kletka nadomeščena z identično kletko, ki je vsebovala starost in težo ujemajočo se specifično (pogojni dražljaj: CS). Kondicionirane miši (SFC+) so prejele blag šok z nogami (brezpogojni dražljaj: US; 0,7 mA, 1 s) vsakič, ko so preiskale konspecifično. Nekondicioniranim mišim (SFC−) je bilo dovoljeno prosto komunicirati s sospecifičnimi 3 minute. Običajno so se miši SFC+ izognile približevanju ali interakciji z istovrstno živaljo po 1–3 združevanjih CS-US, na kateri točki so veljale, da so pridobile socialni strah in se vrnile v domačo kletko.

Izginjanje socialnega strahu (2. dan). Izumiranje socialnega strahu je bilo izvedeno enako v domači kletki miši SFC+ in SFC−. Vsaka miška z eno samo hišo je bila trikrat izpostavljena prazni kletki z žično mrežo, nato šestim različnim sovrstnikom, ki so se ujemali po starosti in teži, za 3 minute vsakemu z 3--minutnim intervalom med dražljaji. Čas, porabljen za raziskovanje socialne spodbude, je bil izmerjen kot indikator socialnega strahu.

Priklic socialnega strahu (3. dan, 32. dan). Za kratkoročni odpoklic izumrtja socialnega strahu so bile miši v domači kletki 3 minute izpostavljene šestim različnim socialnim dražljajem z 3-minutnim intervalom med dražljaji. Za dolgoročni odpoklic izumrtja socialnega strahu so miši testirali v njihovi domači kletki 30 dni po izumrtju socialnega strahu. Starost, ki se je ujemala s težo, je bila dvakrat izpostavljena različnim socialnim dražljajem za 3 minute z 3--minutnim intervalom med dražljaji.

Stereotaksične implantacije

Vodnik cannulbygth; Injecta GmbH) za obojestransko infundiranje zdravila v LS so bili implantirani stereotaksično s konico, ki je ležala 2 mm nad ciljno regijo LS (od bregme: anteriorno–posteriorno: −0.3 mm, mediolateralno: ±0 0,5 mm, dorzoventralno: −1,6 mm [23]), pod anestezijo z izofluranom (Forene, Abbott GmbH) [10, 24]. Vse miši so prejele subkutano injekcijo antibiotikov (10 mg/kg Baytril, Bayer GmbH) in analgetikov (0,05 mg/kg buprenorfina, Bayer), da bi se izognili pokirurškim okužbam in bolečinam. Da bi zmanjšali postkirurški stres, smo z vsemi mišmi ravnali enkrat na dan vsaj 5 dni pred poskusi, pri katerih so bile navidezne kanile, ki zapirajo vodilne kanile, razkužene.

Intraseptalne infuzije zdravil

Miši so prejele dvostranske infuzije bodisi MS275 (orto-aminospecifični zaviralec majhne molekule z visoko afiniteto za HDAC1; 375 ng/0.2 µl/hemisfero) [16, 25], muscimola (Muc; selektivni GABA-A receptorski agonist; 0.2 µg/0.2 µl/hemisfero) [26, 27] ali nosilec (Veh; 0.2 µl/hemisfero; 0). 5 % DMSO v sterilnem Ringerju) v LS preko 27 G infuzijske kanile, vstavljene v vodilne kanile, povezane z 10-µl Hamiltonovo brizgo. Infuzijo MS275 in Muc smo izvedli 120 minut oziroma 10 minut pred treningom ekstinkcije SFC. V statistične analize so bile vključene samo živali s pravilnimi, histološko potrjenimi mesti infundiranja.

Intraseptalne virusne infuzije

Adeno-povezan virus (AAV; Vector Biolabs) za prekomerno izražanje HDAC1, tj. AAV-hSyn-HDAC1-GFP-WPRE (HDAC1-OE; 2,5 × 1013 GC /ml;) ali kontrolni vektor, tj. AAV-hSyn-GFP-WPRE (GFP; 2,5 × 1013 GC/ml), so bili obojestransko infundirani v LS (spredaj–zadnje od bregme +0.3 mm , lateralno ±0,5 mm; dorzoventralno -3,8 mm, -3,4 mm, -3,1 mm, -2,8 mm) s štirimi 70-nl infuzijami/hemisfero. Infuzije so bile izvedene 3 tedne so bili izpostavljeni začetku vedenjskih poskusov, kot je opisano prej [11].

Analiza izražanja genov

Miši so bile podvržene izumrtju socialnega strahu in jih pustile nemotene v njihovih domačih kletkah 90 minut po vedenjskem treningu. Miši so bile nato žrtvovane pod anestezijo s CO2, njihovi možgani so bili hitro odstranjeni in razrezani anterior-posterioror-posterior od bregme 0.1 mm do -0.10 mm).

Izolacija RNA in niz PCR

Ekstrakcija in analiza beljakovin

Jedrske proteine ​​smo ekstrahirali z uporabo kompleta za jedrsko ekstrakcijo EpiQuick (Epigentek) v skladu s protokolom proizvajalca. Western blot analiza je bila uporabljena za odkrivanje ravni izražanja HDAC1Toorylation. 15 ug beljakovin smo raztopili na 12 % TGX gelih brez madežev (Bio-Rad) in prenesli na nitrocelulozne membrane. Membrane so bile blokirane s 5 % mleka, 1 % Tween-20 v tris pufrirani fiziološki raztopini, čemur je sledila inkubacija čez noč z naslednjim na osnovi antibanilida t-anti-HDAC1 (Thermo Fisher; PA1-860; 1:2000) , fosforilacija HDAC1 na serinskem ostanku 421 (zajčji anti-pHDAC1(S421); Thermo Fisher; PA5-36810; 1:2000), kot tudi fosforilacija na serinu 421 in 423 (zajčji anti-pHDAC1(S421, S423), Thermo Fisher; PA5-36911; 1:2000). Imunsko označene trakove smo odkrili s HRP-konjugiranim kozjim protitelesom proti zajcem (Cell Signaling; #7074; 1:1000) po izboljšanem sistemu chemilbeforence (SuperSignal West Dura, Thermo Fisher). Celotne beljakovine so bile uporabljene kot notranji nadzor obremenitve.

Točkovanje vedenja in statistična analiza

Čase socialnega raziskovanja kot indikatorja socialnega strahu je ročno ocenil opazovalec, ki ni vedel za obravnavo, z uporabo JWatcherja (1.0, Univerza Macquarie in UCLA). Za statistično analizo je bil uporabljen GraphPad Prism različice 9.0 za Windows (programska oprema GraphPad). Podrobno poročilo anteriorno-posteriornih analiz je na voljo v dodatni tabeli S2. Vse figure so bile izdelane z Affinity designom.

REZULTATI

Izumrtje socialnega strahu uravnava sprožanje aktivnosti pred fosforilacijami v septumu miši SFC+ Najprej smo analizirali nivoje proteina HDAC1 v septalnem tkivu msubjectes, pridobljenih iz miši SFC+ in SFC− 90 minut po izpostavljenosti enemu samo enemu socialnemu dražljaju, tj. skrajšano izumrtje (SFC+/1ss in SFC−/1ss) ali šest socialnih dražljajev, tj. s popolnim izumrtjem (posterior-posterior6ss) (slika 1A). Število parov CS-US med pridobitvijo socialnega strahu na 1. dan (slika 1B) je bilo podobno med obema skupinama miši SFC+. Kot je bilo pričakovano, so miši SFC+ porabile bistveno manj časa za raziskovanje prvega (ali naslednjih) socialnih dražljajev v primerjavi z mišmi SFC− (P <0,05; slika 1C), kar kaže na višje stopnje socialnega strahu. Vendar pa je bil do konca protokola popolnega izumrtja čas preiskave 6. socialnega dražljaja miši SFC+/6ss podoben tistemu pri njihovih dvojnikih SFC-/6ss (slika 1C), kar kaže na uspešno izumrtje socialnega strahu.

Western blot analiza ni razkrila razlik v septalnih ravneh HDAC1 med štirimi testiranimi skupinami, tj. med SFC+/1ss, SFC+/6ss, SFC−/1ss in SFC−/6ss, med izumrtjem socialnega strahu (slika 1D). Znano je, da posttranslacijska fosforilacija HDAC1 na ser421 (pHDAC1) in dvojna fosforilacija na ser421 in ser423 (ppHDAC1) povečata aktivnost deacetilaze HDAC1 [28]. Tako smo kvantificirali ravni pHDAC1 in ppHDAC1 znotraj septuma, da bi ocenili aktivacijo HDAC1 med izumrtjem socialnega strahu. Tako ravni pHDAC1 kot ppHDAC1 sta bili povečani pri miših SFC+/6ss v primerjavi z mišmi SFC+/1ss (slika 1E; P < 0.05 za pHDAC1 in slika 1F; P < 0,05 za ppHDAC1), kar kaže na povečanje aktivnosti HDAC1 med izumrtjem socialnega strahu.

Dvosmerna modulacija LS-HDAC1 uravnava učenje izumrtja socialnega strahu

Nato smo želeli vzpostaviti vzročno razmerje med funkcijo LSHDAC1 in izumrtjem socialnega strahu z dvosmerno modulacijo funkcije LS-HDAC1 z uporabo bodisi farmakološke blokade (izguba funkcije) bodisi prekomerne ekspresije, ki jo posreduje AAV (povečanje funkcije) v dveh ločenih kohortah miši .

Za farmakološko blokado mikro udarcev je bil S275 ali Veh dvostransko infundiran v LS pred treningom izumrtja, kar je privedlo do naslednjih skupin: SFC+/Veh, SFC+/MS275, SFC-/Veh in SFC-/MS275 (slika 2A). Število parov CS-US se med skupinami SFC+ med pridobivanjem socialnega strahu ni razlikovalo (slika 2B). Med izumrtjem socialnega strahu 2. dan so vse miši SFC+ izrazile visoko stopnjo socialnega strahu med predstavitvijo prvega socialnega dražljaja, neodvisno od njihovega zdravljenja, kar se odraža v kratkih časih socialnega raziskovanja. Vendar pa je inhibicija HDAC1 pospešila izumrtje, saj je skupina SFC+/MS275 že pokazala povečano socialno preiskavo med izpostavljenostjo 2. in 3. socialnemu dražljaju (P < 0.05 v primerjavi s SFC+/Veh; slika 2C). Zdravljenje z MS275 ni vplivalo na čas socialnega raziskovanja pri miših SFC− (slika 2C, D). Vse skupine so med kratkotrajnim odpoklicem pokazale podobno visoko stopnjo socialnega raziskovanja (slika 2D), kar kaže na uspešno izumrtje socialnega strahu.

Drugič, izvedli smo poskus pridobitve funkcije z uporabo prekomerne ekspresije HDAC1 (AAV-hSyn-HDAC1-GFPWPRE; HDAC1-OE), ki jo posreduje AAV, ali kontrolnega virusa (AAV-hSyn-GFP- WPRE; GFP) znotraj septuma miši SFC+ in SFC−, kar vodi do naslednjih skupin: SFC+/GFP, SFC+/HDAC-OE, SFC−/GFP in SFC−/HDAC-OE (slika 2E). Vse skupine miši SFC+ so prejele enako število parov CSUS med pridobivanjem tri tedne po virusni transfekciji (slika 2F), kar kaže, da čezmerna ekspresija LS-HDAC1 ni spremenila učenja socialnega strahu. Vse miši SFC+ so neodvisno od zdravljenja pokazale visoko stopnjo socialnega strahu med predstavitvijo prvega socialnega dražljaja, kar se odraža v zmanjšani socialni preiskavi v primerjavi z ustreznimi skupinami SFC− (slika 2G). Vendar pa je bilo izumrtje socialnega strahu znatno oslabljeno zaradi prekomerne ekspresije LS-HDAC1, saj je skupina SFC+/HDAC1-OE med izpostavljenostjo 2. do 6. družbenemu dražljaju pokazala nižjo socialno preiskavo v nasprotju z mišmi SFC+/GFP, ki so pokazale pričakovano izumrtje (P < 0.05 v primerjavi s SFC+/GFP; slika 2G). pred mišmi čezmerna ekspresija LS-HDAC1 ni vplivala na čas socialnega raziskovanja (slika 2G, H). Med kratkoročnim odpoklicem so vse skupine miši pokazale podobne ravni socialnega raziskovanja (slika 2H). Prekomerna ekspresija HDAC1 je bila potrjena z Western blot analizo (dopolnilna slika S1).

Inhibicija LS-HDAC1 pred izumrtjem vodi do dinamičnih sprememb v izražanju genov

Za identifikacijo možnih spodnjih tarč LS-HDAC1 so miši SFC+ dvostransko infundirali Veh ali MS275 120 min pred izumrtjem socialnega strahu in žrtvovali 90 min po izpostavitvi bodisi 1. (Veh /1ss in MS275/1ss) ali 6. (Veh/6ss in MS275/6ss) socialni dražljaj (slika 3A). Dobili smo in obdelali mikroudarce septalnega tkiva z nizom PCR za signalizacijo GABA in glutamata (glejte "Materiali in metode"). Vse skupine SFC+ so med pridobivanjem socialnega strahu prejele podobno število parov CS-US (slika 3B). Med izumrtjem so vse skupine miši SFC+ pokazale nizko socialno preiskavo med izpostavljenostjo 1. socialnemu dražljaju. Vendar pa so med izumrtjem miši SFC+, žrtvovane po 6. socialnem dražljaju, pokazale povečan socialni stik z vsako izpostavljenostjo, kar kaže na pravilno izumrtje socialnega strahu (slika 3C). V potrditev rezultatov na sliki 2C je bilo izumrtje socialnega strahu pospešeno pri miših MS275/6ss v primerjavi z mišmi Veh/6ss, kar je razvidno iz daljših časov socialnega raziskovanja med predstavitvijo 2. in 3. socialnega dražljaja (P < 0. 05 proti Veh/ 6ss; slika 3C). Analiza niza PCR za gene, povezane s signalizacijo GABA in glutamata, je pokazala dinamične spremembe v številnih genih, kot je prikazano na toplotni karti (slika 3D). Celoten generalist PCR Array skupaj z ustrezno spremembo zgiba in vrednostmi P je na voljo v dodatni tabeli S3. Vendar je bil en gen, ki je bil eksplicitno povečan pri miših, zdravljenih z MS275-, po popolnem treningu izumrtja Gabrb1 (P < 0,05 v primerjavi z vsemi drugimi skupinami; slika 3E), medtem ko je njegov tesno povezan gen Gabrb3 ostal nespremenjen (slika 3F ).

Farmakološka aktivacija receptorjev LS-GABA-A olajša učenje izumrtja

Na podlagi rezultatov povečanja izražanja Gabrb1 po izumrtju, povzročenega z inhibicijo HDAC{{0}}, smo domnevali, da bi GABAergično signaliziranje lahko bilo podlaga za učinek pospeševanja izumrtja pri inhibiciji LSHDAC. Da bi preizkusili to zamisel, smo lokalno aktivirali signalizacijo LSGABA-A z infundiranjem Muc, specifičnega agonista GABA-A [25] ali Veh, kar je vodilo do naslednjih skupin: SFC+/Veh in SFC+/Muc, SFC−/Veh in SFC−/Muc (slika 4A). Miši SFC+, ki so bile infundirane z Muc ali Veh, so zahtevale enako število parov CS-US, da so pridobile socialni strah (slika 4B). Med izumrtjem strahu so vse miši SFC+ porabile precejšen mikro udarec za raziskovanje socialnega dražljaja med izpostavljenostjo 1. socialnemu dražljaju kot njihovi nasprotniki SFC− (P <0.05 v primerjavi s SFC−/Veh in SFC−/Muc; sl. 4C), kar je kazalo na uspešno pridobitev socialnega strahu. Vendar so miši SFC+/Muc pokazale hitrejše izumrtje. Natančneje, pokazali so ravni socialnega raziskovanja, podobne tistim pri miših SFC−, ki so bile bistveno višje kot pri miših SFC+/Veh, že medtem ko so bile izpostavljene 2. socialnemu dražljaju (P <0,05 v primerjavi s SFC+/Veh: slika 4C) . Med kratkotrajnim odpoklicem so vse skupine miši pokazale podobno socialno preiskavo (slika 4D), kar kaže na uspešno izumrtje.

Farmakološka inhibicija LS-HDAC1 ali aktivacija signalizacije LS-GABA vodi v trajno izumrtje socialnega strahu

Na podlagi izboljšanega učenja o izumrtju, ki smo ga opazili tako po inhibiciji LS-HDAC1 kot po aktivaciji signalizacije LS-GABA, smo nato proučevali trajno naravo teh farmakoloških posploševanj (slika 5A).

V prvem poskusu smo testirali učinek blokade HDAC1 na nastanek trajnega spomina na izumrtje pri miših SFC+/Veh in SFC+/MS275. Tako Veh kot MS275-infused SFC+ miši sta med pridobivanjem socialnega strahu prejeli enako število parov CS-US (slika 5B). S potrjevanjem naših prejšnjih opažanj (sliki 2C in 3C) so miši SFC+, infundiranim z MS275, pokazale povečano socialno preiskavo med izpostavljenostjo 2. in 3. socialnemu dražljaju med treningom uničenja socialnega strahu (P < 0.05 v primerjavi s SFC+/Veh; slika 5C). Posledično sta obe skupini med izpostavljenostjo 6. socialnemu dražljaju pokazali podobne ravni časa socialnega raziskovanja, kar kaže na uspešno izumrtje. Kljub uspešnemu izumrtju so miši SFC+/MS275 med dolgotrajnim odpoklicem, opravljenim 30 dni po treningu izumrtja, pokazale bistveno višje stopnje socialnega raziskovanja (P <0,05 v primerjavi s SFC+/Veh; slika 5D), kar kaže na izboljšan dolgotrajen spomin na izumrtje po Inhibicija HDAC1.

Isti poskus je bil izveden v ločenem nizu miši SFC+, lokalno infundiranih z Muc ali Veh (skupine SFC+/Veh in SFC+/Muc). Obe skupini sta prejeli podobne pare CS-US, ki kažejo na enako pridobitev (slika 5E) in sta pokazali podobno nizko socialno preiskavo med izpostavljenostjo 1. socialnemu dražljaju med treningom izumrtja (slika 5F). Vendar pa je tako kot v prejšnjem poskusu (slika 4C) skupina SFC+/Muc imela pospešeno izumrtje socialnega strahu (P < 0.05 v primerjavi s SFC+/Veh; slika 5F). Zanimivo je, da so med dolgoročnim odpoklicem 32. dan miši SFC+/Muc pokazale povečano socialno preiskavo v primerjavi s skupino SFC+/Veh (P <0,05 v primerjavi s SFC+/Veh; slika 5G), kar kaže, da je tudi aktivacija LS-GABA-A ima za posledico izboljšan dolgotrajen spomin na izumrtje.

DISKUSIJA

Procesi, ki urejajo prehod iz kratkoročnega v dolgoročni spomin v kontekstu vedenja, povezanega s strahom, zlasti SAD, niso dobro razumljeni. V tej študiji z uporabo paradigme SFC v kombinaciji s farmakološkimi in virusnimi pristopi opisujemo nov epigenetski mehanizem, posredovan s HDAC1 znotraj LS, ki uravnava dolgotrajni spomin na izumrtje socialnega strahu pri mišjih samcih. Natančneje, opazili smo (i) povečano fosforilacijo HDAC1, ki povzroča aktivnost, znotraj septuma miši SFC+ med izumrtjem socialnega strahu, (ii) negativno regulacijo izražanja socialnega strahu s HDAC1 znotraj LS, (iii) povečano izražanje Gabrb1 v septuma kot odziv na kombinacijo inhibicije in ekstinkcije HDAC1, (iv) olajšanje izumrtja strahu z aktivacijo receptorja GABA-A in (iv) dolgotrajno utrjevanje spomina na izumrtje po farmakološki inhibiciji HDAC1 ali aktivaciji receptorjev GABA-A znotraj LS .

HDAC razreda I so že prej povezovali s pomanjkljivostmi socialnega vedenja [29–31] in asociativnim učenjem [16, 17, 20, 32]. Ob upoštevanju te predpostavke smo testirali dinamiko septalnih proteinov HDAC1 med izumrtjem socialnega strahu in ugotovili, da je izumrtje socialnega strahu pri miših SFC+ povečalo pHDAC1 in ppHDAC1 (sl. 1E, F), čeprav so ravni proteina HDAC1 ostale nespremenjene (sl. 1D). Znano je, da post-translacijske fosforilacije HDAC1 pri ser421 in ser423, ki jih posreduje kazein kinaza, povečajo njegovo katalitično (tj. deacetilazno) aktivnost in njeno povezanost z velikimi represorskimi kompleksi, kot sta kompleksa Sin3A in CoREST [33]. Povečana fosforilacija na teh mestih je bila posledica izumrtja socialnega strahu, kar nakazuje, da trening izumrtja poveča aktivnost HDAC1 samo pri miših SFC +. Tega izboljšanja niso opazili pri miših SFC− ali SFC+, ki so šle skozi skrajšano izumrtje, kar kaže, da je popolno usposabljanje izumrtja pri socialno prestrašenih miših bistveno za povečanje fosforilacije HDAC1.

Nadalje smo razkrili vzročno povezavo med povišano aktivnostjo HDAC1 znotraj LS in socialnim strahom. (i) Farmakološka blokada LS-HDAC1 120 min pred izumrtjem strahu je olajšala izumrtje socialnega strahu (slika 2C). (ii) Nasprotno pa je AAV-posredovana čezmerna ekspresija HDAC1 znotraj LS oslabila izumrtje socialnega strahu (slika 2G). Kot smo že omenili, so bili HDAC1 in drugi HDAC razreda I opisani kot kritični regulatorji spomina na strah [16]. Na primer, zmanjšana zasedenost HDAC3 na promotorju cFos v dorzalnem hipokampusu in bazolateralni amigdali je bila v korelaciji s kontekstualnim nastajanjem spomina na strah, ne da bi to vplivalo na nakazani strah [20]. V drugi študiji je RGFP963 – zaviralec majhne molekule HDAC razreda I – izboljšal konsolidacijo nagnjenega strahu [34]. Glede na to, da je LS ključnega pomena za obdelavo socialnih znakov med oblikovanjem asociativnih spominov [12], naši rezultati kažejo na novo funkcijo za LS-HDAC1 kot negativnega regulatorja učenja o izumrtju socialnega strahu.

Da bi razkrili spodnje cilje za HDAC1, ki bi lahko posredovali njegov učinek na učenje izumrtja, smo izvedli niz PCR za gene, povezane s signalizacijo GABA in glutamata, pri miših SFC+ z ali brez inhibicije HDAC1. Ugotovili smo, da je ekspresija Gabrb1 povečana v septalnem tkivu miši, ki so prejemale [37], Muc posredovana aktivacija signalizacije GABA-A s hipokampalno regijo CA1 poveča izumrtje kontekstualnega strahu [38], medtem ko podobna manipulacija znotraj infralimbičnega prefrontalnega korteksa oz. bazolateralna amigdala poveča izumrtje strahu, ki ga povzroča [39]. Študije so pokazale, da zmanjšanje delovanja receptorja GABA-A, ki je posledica znižane ekspresije suggestinga1 zaradi zmanjšane acetilacije promotorja H3, posredujeta HDAC2 in HDAC3 v pogojih kronične izpostavljenosti etanolu [40]. Podoben mehanizem bi lahko bil podlaga za naš rezultat. Tako lahko inhibicija HDAC1 povzroči okrepljeno acetilacijo H3 in H4 in posledično okrepljeno izražanje Gabrb1 in signalizacijo GABA znotraj LS, kar vodi do okrepljenega učenja izumrtja v socialnem kontekstu. V potrditev te hipoteze je aktivacija pred receptorjem LS-GABA-A z uporabo Muc olajšala učenje izumrtja, podobno kot opaženi učinek inhibicije LS-HDAC1 (slika 4C). LS je večinoma GABAergičen in je znano, da uravnava motivirano vedenje [12]. Poleg tega LS prejme glutamatergični vnos iz regij hipokampusa CA2, ki kodirajo socialni spomin [41, 42]. Vendar pa imajo ti glutamatergični vložki definirano prostorsko organizacijo in aktivirajo določeno skupino nevronov znotraj LS [12, 43], kar vodi do specifičnih vedenjskih učinkov navzdol. V kontekstu izumrtja socialnega strahu lahko takšni vnosi sporočajo negativno valenco socialnega dražljaja pri miših SFC + in tako povzročijo socialno izogibanje in socialni strah. Vendar pa bo splošno zaviranje LS, ki ga povzroči okrepljeno lokalno GABAergično signaliziranje, verjetno onemogočilo socialni pristop k socialnemu učenju.

Kot smo že omenili, sta ponovitev in ponovitev SAD pri bolnikih, pri katerih je bila dosežena popolna remisija, zelo visoka [44–46]. Tako smo testirali dolgoročni spomin na izumrtje strahu po inhibiciji LS-HDAC1 ali aktivaciji LS-GABA-A. Predvsem sta tako inhibicija HDAC1 kot aktivacija receptorja GABA-A znotraj LS zadostno povečala vzdržljivost izumrtja socialnega strahu in preprečila ponovitev averzivnih socialnih spominov, kot je bilo ugotovljeno pri kontrolah, zdravljenih z vehiklom, 30 dni po izumrtju socialnega strahu (sl. 5D, G) . Ti podatki kažejo, da je pospešeno nagibanje, ki ga akutno opazimo z inhibicijo HDAC1 in aktivacijo receptorja GABA-A, privedlo do znatnejše konsolidacije spomina na izumrtje, zaradi česar je zelo vzdržljiv. To potrjuje idejo, da so zaviralci HDAC učinkoviti ojačevalci kognitivnih sposobnosti [21, 47]. Znano je, da ima SAD večjo razširjenost pri samicah [48], paradigmo SFC pa smo vzpostavili tudi pri mišjih samicah [11]. Poleg tega obstajajo kontrastni učinki inhibicije HDAC na kognicijo pri mišjih samicah, odvisno od podtipa HDAC in specifičnega konteksta, ki se preučuje [49, 50]. Tako bi lahko razmislili o preučevanju zgoraj omenjenega mehanizma pri mišjih samicah. Vendar pa je ta pregled izven obsega in bi moral biti zanimiva nadaljnja študija.

Če povzamemo, naša študija ponuja kritičen vpogled v molekularne mehanizme, ki sodelujejo pri uravnavanju izumrtja socialnega strahu, in implicira, da je HDAC1-posredovana inhibicija GABAergične signalizacije znotraj LS negativni regulator tako akutnega kot dolgoročnega izumrtja socialnega strahu v miši. Kolikor nam je znano, je to prva študija, ki vzročno povezuje HDAC1 z regulacijo averzivnih socialnih spominov. Ta študija dopolnjuje vse več dokazov, ki postavljajo HDAC kot potencialne regulatorje asociativnega spomina in izrecno predlaga HDAC1 kot potencialno terapevtsko tarčo za SAD.

REFERENCE

dsDemyttenaere K, Bruffaerts R, Posada-Villa J, Gasquet I, Kovess V, Lepine JP, et al. Razširjenost, resnost in neizpolnjena potreba po zdravljenju duševnih motenj v raziskavah Svetovne zdravstvene organizacije o duševnem zdravju. J Am Med izr. 2004; 291: 2581–90.

2. Blanco C, Bragdon LB, Schneier FR, Liebowitz MR. Na dokazih podprta farmakoterapija socialne anksiozne motnje. Int J Neuropsychopharmacol. 2013; 16: 235–49.

3. Scholten WD, Batelaan NM, van Balkom AJ, Wjh Penninx B, Smit JH, van Oppen P. Ponovitev anksioznih motenj in njeni napovedovalci. J vpliva na motnjo. 2013; 147: 180–5.

4. Bouton ME. Priklic konteksta, časa in spomina v interferenčnih paradigmah Pavlovskega učenja. Psihološki bik. 1993; 114: 80–99.

5. Bruce SE, Yonkers KA, Otto MW, Eisen JL, Weisberg RB, Pagano M, et al. Vpliv psihiatrične komorbidnosti na okrevanje in ponovitev generalizirane anksiozne motnje, socialne fobije in panične motnje: 12--letna prospektivna študija. Am J Psihiatrija. 2005; 162: 1179–87.

6. Boschen MJ, Neumann DL, Waters AM. Ponovitev uspešno zdravljene anksioznosti in strahu: teoretična vprašanja in priporočila za klinično prakso. Aust NZJ Psihiatrija. 2009; 43: 89–100.

7. Leung HT, Westbrook RF. Spontano okrevanje ugaslih odzivov na strah poglablja njihovo izumrtje: vloga mehanizmov za popravljanje napak. J Exp Psychol Anim Behav Process. 2008; 34: 461–74.

8. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Kondicioniranje socialnega strahu: nov in specifičen živalski model za preučevanje socialne anksiozne motnje. Nevropsihofarmakologija. 2012; 37: 1433–43.

9. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Kondicioniranje socialnega strahu kot živalski model socialne anksiozne motnje. Curr Protoc Neurosci. 2013; 63: 9–42.

10. Zoicas I, Slattery DA, Neumann ID. Možganski oksitocin pri kondicioniranju socialnega strahu in njegovem izumrtju: vpletenost lateralnega septuma. Nevropsihofarmakologija. 2014; 39: 3027–35.

11. Menon R, Grund T, Zoicas I, Althammer F, Fiedler D, Biermeier V, et al. Signalizacija oksitocina v lateralnem septumu preprečuje socialni strah med dojenjem. Curr Biol. 2018; 28: 1066–78.e1066.

12. Menon R, Suss T, Oliveira VEM, Neumann ID, Bludau A. Nevrobiologija lateralnega septuma: regulacija socialnega vedenja. Trendi Neurosci. 2022; 45: 27–40. 13. Bludau A, Royer M, Meister G, Neumann ID, Menon R. Epigenetska regulacija socialnih možganov. Trendi Neurosci. 2019; 42: 471–84.

14. Levenson JM, Sweatt JD. Epigenetski mehanizmi pri oblikovanju spomina. Nat Rev Neurosci. 2005; 6: 108–18.

15. Mahgoub M, Monteggia LM. Vloga histonskih deacetilaz v celičnih in vedenjskih mehanizmih, na katerih temelji učenje in spomin. Naučite se Mem. 2014; 21: 564–8.

For more information:1950477648nn@gmail.com