Kako polisaharid Cistanche zmanjša melanogenezo in zmanjša oksidativni stres?
Mar 14, 2022
Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com
Polisaharid Cistanche deserticola inducira melanogenezo v melanocitih in zmanjša oksidativni stres
1 Oddelek za dermatologijo, tretja bolnišnica Xiangya, Central South University, Changsha, Kitajska
2 Oddelek za urologijo, tretja bolnišnica Xiangya, Central South University, Changsha, Kitajska
3Medicine Experimental Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Kitajska
Cistanchedeserticolaima veliko učinkov, kliknite tukaj, če želite izvedeti več
Povzetek: Kot glavni del motenj pigmentacije so bolezni depigmentacije kože, kot sta vitiligo in ahromični nevus, zelo pogoste in jim zdaj namenjamo več pozornosti. Patogeneza depigmentacije vključuje disfunkcijo in izgubo melanocitov, ki sta verjetno posledica dednosti, avtoimunosti in oksidativnega stresa. Med njimi,oksidativni stresigra ključno vlogo; vendar le malo kliničnih zdravljenj lahko obravnava oksidativni stres. Kot poročajo,Cistanchedeserticola polisaharid(CDP) je učinkovit antioksidant; na podlagi tega smo ovrednotili njegovo vlogo v melanocitih in nadalje razkrili mehanizme. V tej študiji smo ugotovili, da lahko CDP spodbuja melanogenezo v človeških epidermalnih melanocitih (HEM) in celicah mišjega melanoma B16F10, inducira tudi pigmentacijo pri cebricah. Poleg tega bi lahko CDP aktiviral signalno pot protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK), nato pa navzgor reguliral ekspresijo transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo (MITF), in genov TYR, TRP1, TRP2 in RAB27A. V nasprotnem primeru smo ugotovili, da lahko CDP zmanjša citotoksičnost in apoptozo v melanocitih, ki jo povzroči H2O2-. Nadaljnji dokazi so pokazali, da bi CDP lahko izboljšal antioksidativno pot NRF2/HO-1 in odstranil znotrajcelični ROS. Če povzamemo, lahko CDP spodbuja melanogenezo in prepreči melanocite pred poškodbami zaradi oksidativnega stresa, kar kaže na to, da CDP pomaga ohranjati normalen status melanocitov. Tako je lahko CDP novo zdravilo za zdravljenje depigmentacijskih bolezni.
KLJUČNE BESEDE:
Cistanche deserticola polisaharid, depigmentacijska bolezen, melanociti, melanogeneza, NRF2,oksidativni stres
1. UVOD
Za bolezni depigmentacije kože, kot sta vitiligo in ahromični nevus, je značilna neenakomerna ali obsežna depigmentacija kože.1 Čeprav kožne lezije redko povzročijo resne telesne poškodbe, vplivajo na videz bolnika in povzročajo hudo psihično obremenitev, celo motnje duševnega zdravja.2 Glavne patološke spremembe pri depigmentaciji vključujejo disfunkcijo in izgubo melanocitov, kar močno vpliva na sintezo in transport melanina3, kar vodi do nezadostnega kopičenja melanina v koži.
Mehanizmi, ki sodelujejo pri depigmentaciji, trenutno niso znani, vendar so študije odkrile nekatere povezane dejavnike. Po eni strani je delovanje melanocitov delno odvisno od transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo (MITF), ki je dobro znan po spodbujanju izražanja genov, povezanih z melanogenezo, vključno s tirozinazo (TYR), s tirozinazo povezanim proteinom 1 (TRP1), s tirozinazo povezanim protein 2 (TRP2), z ras sorodni protein Rab-27a (RAB27A) in protein za povezovanje aktina fascina 1 (FSCN1).4 Med temi geni ima TYR ključno vlogo pri sintezi melanina prek oksidacije l-dope v dopakinon.5 Po drugi strani pa študije kažejo na kombinacijo več dejavnikov, ki so lahko odgovorni za izgubo melanocitov, vključno z dednostjo, okoljem, avtoimunostjo in oksidativnim stresom.6-9 Med temi dejavniki velja, da je oksidativni stres najpomembnejši .
Mehanizmi zaoksidativni streski povzročajo depigmentacijo so delno razkriti; preobremenitev z reaktivnimi kisikovimi vrstami (ROS) je eden od ključnih dejavnikov.10 Preobremenitev z ROS pri depigmentaciji vključuje neravnovesje med pro- in antioksidativnimi sistemi.11 Eden od elementov, ki sodelujejo pri tem neravnovesju, je povezan z jedrskim faktorjem eritroidno 2- faktor 2/element odziva antioksidanta (NRF2/ARE) oslabitev antioksidativne poti.12 Pot sestavljajo NRF2 in antioksidativni encimi, kot je hem oksigenaza-1 (HMOX-1, HO-1) , katalaze (CAT), glutation peroksidaze 1 (GPX1) in NAD(P)H kinon dehidrogenaze 1 (NQO1).13 Ko so melanociti izpostavljeni prekomernemu ROS, se lahko NRF2 translocira v jedro in se veže na ohranjeno ARE, nato spodbuja izražanje antioksidativnih encimov. Vendar pa pri nekaterih depigmentacijskih boleznih, kot je vitiligo, oslabljena antioksidativna pot NRF2/ARE ne more učinkovito odstraniti ROS.14 Klinične terapije, ki se običajno uporabljajo pri depigmentaciji, vključujejo lokalne ali sistemske kortikosteroide, zaviralce kalcinevrina, ozkopasovno ultravijolično B (NBUVB; 311 nm) , 308-nm excimer svetloba, avtologna epidermalna presaditev in terapija tradicionalne kitajske medicine (TCM). Kortikosteroidi in zaviralci kalcinevrina lahko zmanjšajo nenormalno imunsko aktivacijo,15 medtem ko se fototerapije uporabljajo kot zdravljenje prve izbire; zlasti NBUVB stimulira proliferacijo melanocitov in uničenje T-celic,16 medtem ko 308-nm ekscimerna svetloba inducira apoptozo T-celic.17 Poleg tega so učinki terapij TKM povezani s spodbujanjem melanogeneze.18 Do določene mere so te metode so v pomoč pri izboljšanju depigmentacije, vendar je nadzor nad napredovanjem bolezni še vedno izziv. Potreben je razvoj novih terapij, predvsem za oksidativni stres, ki je bil prej zanemarjen.
Cistanche deserticolaznan kot 'puščavski ginseng'.19 Njegove sestavine so uporabne pri poškodbah jeter, ki jih povzroča etanol, in črevesni vnetni hiperplaziji; lahko se uporablja tudi kot reagent proti utrujenosti, vnetjem in tumorjem.20-22 Nedavno so Guo et al poročali, daCistanche deserticola polisaharid(CDP), ena njegovih glavnih sestavin, je imela antioksidativno in hepatoprotektivno delovanje20; drugi dve študiji sta ugotovili njegovo vlogo pri zaščiti celic pred poškodbami pri pomanjkanju kisika/glukoze/reperfuziji in osteoporozi. 23, 24 Vendar pa vloga CDP pri boleznih depigmentacije ni bila pojasnjena. Tukaj smo želeli potrditi, ali je CDP coksidativni stresvplivalo na melanogenezo in zaščitilo melanocite pred oksidativnim stresom.
2.|MATERIAL IN METODE
2.1|Kemikalije in protitelesa
Cistanche deserticolapolisaharid(CDP) in l-dopa sta bila kupljena pri Yuanye Biotec (čistost večja ali enaka 98 odstotkom; Šanghaj, Kitajska). Vodikov peroksid (H2O2), dimetil sulfoksid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolijev bromid ( MTT) in komplet za odkrivanje apoptoze Annexin V-FITC smo kupili pri Sigma-Aldrich. 4-odstotni nevtralni paraformaldehid je bil kupljen pri Biosharp (Hefei, Kitajska); in komplet za imunofluorescenčno barvanje (Alexa Fluor 488) in 2,7-diklorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) sta bila kupljena pri Beyotime Biotec (Šanghaj, Kitajska). Komplet za barvanje Fontana-Masson in komplet za ekstrakcijo nukleoplazmatskega proteina sta bila kupljena pri Sloarbio (Peking, Kitajska). Dodatek za rast človeških melanocitov (HMGS), Dulbeccov modificiran medij Eagle (DMEM) in medij 254 so bili kupljeni pri Gibcu. Fetalni goveji serum (FBS) je bil kupljen pri BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izrael). Primarna protitelesa za -aktin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,
p38, p-p38, NRF2 in HO-1 so bili kupljeni pri Cell Signaling Technology, primarno protitelo za MITF je bilo kupljeno pri St John's Laboratory, primarno protitelo za p-MITF je bilo kupljeno pri Affinity Biosciences, primarno protitelo za GAPDH je bilo kupljeno pri Bioworld, primarno protitelo za TRP1 pa je bilo kupljeno pri EMD Millipore.
2.2| Kultura in zdravljenje celic
Celice mišjega melanoma B16F10 smo gojili v mediju DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS in 1 odstotkom mešanice antibiotikov penicilin-streptomicin. Človeški epidermalni melanociti (HEM) so bili ločeni od človeške kožice (glej našo prejšnjo študijo 25) in gojeni v gojišču 254, dopolnjenem s HMGS, 5 odstotki FBS in 1 odstotkom mešanice antibiotikov penicilin-streptomicin. Vse celice so bile gojene v mokrem inkubatorju pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2. CDP smo raztopili v DMSO in razredčili
z medijem pred uporabo je bila končna koncentracija DMSO nižja od 0,1 odstotka. H2O2 smo pred uporabo razredčili z medijem.
2,3|Gojenje in zdravljenje cebric
Zarodki in medij cebrice so bili kupljeni pri EzeRinka Biotech. Eksperimentalni protokol je odobril Odbor za etiko Univerze Central South. Cebrice so bile gojene v 12-ploščah z jamicami pri 37 stopinjah stran od svetlobe in obdelane z različnimi koncentracijami CDP. Z invertnim mikroskopom so dnevno opazovali in beležili melanine v glavah in repih cebric. Po opazovanju smo zamenjali medij in ponovno dodali CDP. Gostota melanina v repih cebric je bila izmerjena s sliko J, vrednosti pa so predstavljene kot integrirane optične gostote (IOD).
2.4| Viabilnost celic
Preživetje celic je bilo izmerjeno z uporabo MTT testa. Da bi raziskali citotoksičnost CDP, so celice HEM in B16F10 implantirali v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 2 × 1{{30}}3 celic/vdolbinico in jih gojili do celice so bile pritrjene na plošče. Celice smo nato obdelali z različnimi koncentracijami (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 in 320 ug/mL) CDP 24, 48 ali 72 ur. Pred meritvijo smo v vsako vdolbino dodali 20 μL MTT in plošče inkubirali pri 37 stopinjah 4 ure. Po tem smo zavrgli supernatant in v vsako vdolbinico dodali 160 μL DMSO, da smo raztopili kristale formazana. Vrednost absorbance pri 490 nm je bila izmerjena z večmodnim bralnikom plošč (PerkinElmer). Da bi raziskali učinek CDP v stanju citotoksičnosti, povzročene s H2O2-, so celice HEM in B16F10 nasadili v 96-plošče z vdolbinicami pri gostoti 4 × 103 celic/vdolbinico. Celice smo 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami CDP (0, 20, 40 ali 80 ug/mL), nato pa smo v vsako vdolbinico dodali H2O2 (končne koncentracije: 500 μm za HEM in 1,0 mm za celice B16F10). in celice inkubirali še 24 ur. Vzpostavili smo skupine, zdravljene s CDP, in skupine z negativno kontrolo (NC). Koraki odkrivanja so bili enaki kot prej opisani.
2,5|NaOH analiza vsebnosti melanina
Celice so bile kultivirane v {{0}} mm petrijevkah in obdelane s CDP pri različnih koncentracijah (0, 20, 40 in 80 ug/ml) 48 ur, nato prebavljene s tripsinom in zbrane v 1. 5-mL epruvete. Celice smo dvakrat sprali z dvojno destilirano vodo, jih resuspendirali v 1 ml etanola in vrtinčili, da smo sprostili melanin. Nato smo mešanico centrifugirali (200 g, 5 minut) in zavrgli supernatant, v vsako epruveto dodali 1 mL 10-odstotnega DMSO (razredčenega z 1 mm raztopino NaOH) in suspendirali usedlino. Suspenzijo smo inkubirali v vodni kopeli pri 80 stopinjah 1 uro, da se je melanin raztopil. Nazadnje smo 200 μL tekočine prenesli na 96-ploščo z vdolbinicami in uporabili večmodni bralnik plošč za merjenje vrednosti absorbance pri 470 nm.
2,6|Meritve aktivnosti tirozinaze
Celice smo gojili v {{0}} mm petrijevkah in jih pred meritvijo obdelali s CDP, prebavili s tripsinom in zbrali v 1.5- ml epruvete ter dvakrat sprali s fosfatno pufrano slanico (PBS). ). Premaknili smo 106 celic iz vsakega vzorca v novo epruveto in zavrgli supernatant po centrifugiranju, nato dodali 1 ml 0.5 odstotkov Tritona X-100 celični peleti in shranili mešanico pri 0 stopinjah 15 minut. Nato smo dodali 1 mL l-dope (1 mm, razredčeno z 0.1 M fosfatnim pufrom) kot substrat in premešali raztopino, premaknili 200 μL zmesi na 96-ploščo z vdolbinicami takoj in izmeril vrednost absorbance (A0) pri 475 nm z uporabo večmodnega bralnika plošč in ponovil meritev po 10 minutah (A10). Aktivnost tirozinaze je bila izračunana z (A10-A0)/105, rezultati pa so izraženi v odstotkih (odstotki) v primerjavi z negativno kontrolo.
2,7| Fontana-Massonovo barvanje z melaninom
Celice so gojili v 12-ploščah z vdolbinicami, dokler niso dosegli 50-odstotne gostote. Po obdelavi smo celice 30 minut fiksirali s 4-odstotnim nevtralnim paraformaldehidom in jih sprali z destilirano vodo. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 500 μL raztopine amoniaka in srebra Fontana in plošče shranili v temi za 16 ur, da smo obarvali melanin. Nato smo celice petkrat sprali z destilirano vodo (vsakič 1 minuto) in jih za 5 minut namočili v 500 μL hiposulfita; na koncu smo odstranili hiposulfit in celice ponovno spirali z destilirano vodo 1 minuto. Nato smo z invertnim mikroskopom opazovali in posneli melanine.
2,8|Ekstrakcija RNA in kvantitativna reverzna transkripcija-verižna reakcija s polimerazo
Celice so bile gojene v 6-ploščah z vdolbinicami. Po obdelavi smo celice razgradili s tripsinom in zbrali v 1.5-mL epruvete. Celice smo dvakrat sprali s PBS, nato dodali 1 mL liznega pufra, mešanico vrtinčili in epruvete za 5 minut postavili na led, da smo celice popolnoma lizirali. RNA je bila ekstrahirana s kompletom Total RNA (Omega Bio-Tek) in reverzno prepisana (RT) z uporabo ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitativno reverzno transkripcijo-verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo izvedli z uporabo KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Reakcijski volumen mešanice RT je bil 20 μL, medtem ko je bil reakcijski volumen zmesi PCR 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, dodajte DEPC H2O do 20 μL ). Poskusi so bili izvedeni v skladu s protokoli. Zaporedja primerjev so navedena v tabeli S1.
2,9|Ekstrakcija beljakovin in Western blotting/imunofluorescenca
Celice smo gojili v 100- mm petrijevkah. Po obdelavi smo celice razgradili s tripsinom in zbrali v 1.5-mL epruvete. Celice smo dvakrat sprali s PBS, nato dodali 500 μL liznega pufra RIPA (Thermo Fisher), dopolnjenega z 1 mm fenilmetilsulfonil fluoridom (Thermo Fisher) in 1:100 razredčenim koktajlom inhibitorja fosfataze (Roche). Jedrski in citoplazmatski protein je bil ekstrahiran z uporabo kompleta za ekstrakcijo nukleoplazmatskega proteina v skladu s protokolom proizvajalca. Epruvete smo za 30 minut postavili na led in jih vsakih 5 minut vrtinčili, da smo celice popolnoma lizirali. Celice smo centrifugirali (200 g, 4 stopinje, 15 minut), premaknili supernatant v novo epruveto in izmerili koncentracijo skupnih beljakovin s kompletom za analizo beljakovin BCA (KeyGEN Biotec). Beljakovine smo kuhali s 5 × nakladalnim pufrom (Beyotime Biotec, Kitajska) pri 100 stopinjah 10 minut, nato pa smo jih shranili pri –80 stopinjah. Metoda elektroforeze v poliakrilamidnem gelu (PAGE) je bila uporabljena pri Western blottingu in 20 ug beljakovin vsake skupine je bilo ločenih in prenesenih na membrano iz poliviniliden fluorida. Po blokiranju antigena smo membrano inkubirali v 1:1000 razredčenem primarnem protitelesu 16 ur pri 4 stopinjah, nato smo membrano sprali s PBST in jo inkubirali v 1:10 000 razredčenih fluorescenčnih sekundarnih protitelesih 1 uro pri 37 stopinjah . Intenzivnost fluorescence je bila zaznana z Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Imunofluorescenco smo izvedli s kompletom za imunofluorescenčno barvanje (Alexa Fluor
488) z razredčino primarnega protitelesa 1:100.
2.10|Merjenje celične apoptoze
Celice smo gojili v {{0}} mm petrijevkah in jih 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami (0, 20, 40 in 80 ug/mL) CDP in dodali H2O2 ( končne koncentracije: 500 μm za HEM, 1,0 mm za celice B16F10) v vsako vdolbino in inkubiramo nadaljnjih 24 ur. Vzpostavili smo tudi CDP-tretirane in NC skupine. Po obdelavi smo celice prebavili s tripsinom brez EDTA in jih zbrali v epruvete, nato celice dvakrat sprali s PBS in jih resuspendirali v 100 μL PBS. Celice smo obarvali s kompletom za odkrivanje apoptoze Annexin V-FITC v skladu s protokolom in odkrili s pretočno citometrijo (FCM). Za analizo stopnje apoptoze je bila uporabljena programska oprema FlowJo.
2.11| Znotrajcelično merjenje ROS
Celice smo gojili v {{0}}ploščah z jamicami in jih 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami (0, 20, 40 in 80 ug/mL) CDP, ki smo jim dodali H2O2 (končne koncentracije: 500 μm za HEM,
10 mm za celice B16F10) v vsako vdolbino, jih inkubirali za drugo
24 ur in nastavite skupine, obdelane s CDP, in skupine NC. Po obdelavi smo celice dvakrat sprali s PBS, da smo odstranili ves medij in FBS, nato pa sondo DCFH-DA razredčili na 1:1000 z medijem in jo dodali v vsako vdolbinico. Celice smo inkubirali pri 37 stopinjah 30 minut in jih trikrat sprali z medijem brez seruma. Uporabili smo an
invertni fluorescenčni mikroskop za opazovanje in snemanje fluorescence, nato pa uporabil ImageJ za merjenje intenzivnosti fluorescence.
2,12|Statistika in analiza
Podatki v tem delu so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD), statistična analiza pa je bila izvedena z uporabo programa GraphPad Prism (različica 7.0) ali SPSS (različica 22.0) in Student's t-test ali enosmerna analiza variance (ANOVA) je bil uporabljen za primerjave več skupin. Siva vrednost beljakovinskih pasov WB je bila standardizirana z GAPDH ali -aktinom. Vrednosti P <.05 so="" veljale="" za="" pomembne.="" vsi="" poskusi="" so="" bili="" ponovljeni="" vsaj="">
3|REZULTATI
3.1|CDP je povzročil melanogenezo v celicah HEM in B16F10
Preden smo začeli, smo uporabili test MTT za raziskovanje potencialne citotoksičnosti CDP na HEM in celicah mišjega melanoma B16F10. Celice smo obdelali s CDP v različnih koncentracijah 24, 48 ali 72 ur. Preskušanje viabilnosti HEM je pokazalo, da CDP ni vplival na viabilnost celic, ko so bile koncentracije nižje od 320 ug/mL; vendar se je sposobnost preživetja znatno zmanjšala, ko je koncentracija dosegla 320 ug/mL po 24, 48 in 72 urah (P < 0,05;="" slika="" 1a).="" sposobnost="" preživetja="" celic="" b16f10="" se="" je="" zmanjšala="" tudi="" po="" 48="" in="" 72="" urah,="" ko="" je="" cdp="" dosegel="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01),="" vendar="" pri="" nižjih="" koncentracijah="" niso="" opazili="" nobene="" spremembe="" (slika="" 1b).="" nato="" smo="" predhodno="" raziskali="" vlogo="" cdp="" v="" melanogenezi="" in="" primerjali="" njegove="" učinke="" z="" učinki="" -melanocite="" stimulirajočega="" hormona="" (-msh;="" koncentracije:="" 20,="" 100="" in="" 400="" nm)="" in="" dmso="" (0,1="" odstotka)="" v="" hem.="" rezultati="" obarvanja="" melanina,="" aktivnosti="" tirozinaze="" in="" testov="" vsebnosti="" melanina="" so="" pokazali,="" da="" je="" bil="" cdp="" primerljiv="" z="" -msh="" glede="" spodbujanja="" melanogeneze,="" medtem="" ko="" zdravljenje="" z="" 0,1-odstotnim="" dmso="" ni="" imelo="" nobene="" razlike="" (slika="">
Temu primerno smo dodatno izpopolnili svoje raziskovanje. HEM smo obdelali s CDP v različnih koncentracijah (20, 40 in 80 ug/mL) 48 ur; opravljeni so bili testi obarvanja melanina, vsebnosti melanina in aktivnosti tirozinaze, vsi pa so pokazali znatno povečanje po zdravljenju s CDP na način, odvisen od koncentracije, ki je doseglo vrh v skupini z 80 ug/mL (P < 0,05,="" slika="" 2a-c)="" .="" nato="" smo="" izmerili="" raven="" mrna="" in="" beljakovin="" genov,="" povezanih="" z="" melanogenezo="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" in="" fscn1).="" cdp="" je="" znatno="" povečal="" ravni="" mrna="" teh="" genov="" v="" hem="" (p=""><.05; slika="" s2a).="" poleg="" tega="" so="" se="" ravni="" proteinov="" mitf,="" tyr,="" trp1="" in="" rab27a="" povečale,="" prav="" tako="" razmerje="" med="" fosforiliranim="" mitf="" in="" skupnim="" mitf="" (p=""><.05), medtem="" ko="" trp2="" in="" fscn1="" nista="" pokazala="" razlike="" (slika="" 2d,="" e).="" rezultati="" so="" pokazali,="" da="" lahko="" cdp="" spodbuja="" melanogenezo="" in="" poveča="" izražanje="" z="" melanogenezo="" povezanih="" genov="" v="" človeških="">
Poleg tega smo ponovno preverili učinke CDP s celicami B16F10 in ugotovili, da se je vsebnost melanina v celicah B16F10 znatno povečala (P <.01; slika="" s2b).="" poleg="" tega="" cdp="">
3.2|CDP je spodbujal melanogenezo pri cebricah
Raziskati, ali bi CDP lahko promoviralmelanogenezain vivo smo uporabili zarodke cebrice. Zarodke cebrice so razdelili v štiri skupine in jih nenehno zdravili s samim medijem (NC) ali CDP v različnih koncentracijah (20, 40 in 80 ug/mL); vsak dan so opazovali in beležili gostoto in porazdelitev zrnc melanina. Ko so zarodki cebric rasli, smo ugotovili, da se gostota melanina v glavah in repih postopoma povečuje. Tretji dan so bile razlike med skupinami vidne in razlika se je še povečevala, dokler nismo zaključili poskusa 6. dan (slika 3A). Uporabili smo sliko J za merjenje gostote melanina v repih cebric; gostota melanina v skupinah, zdravljenih s CDP, je bila znatno višja kot v kontrolni skupini (P <.05; slika="">
3.3|CDP aktivirana signalna pot MAPK v celicah HEM in B16F10
Razkriti mehanizme, s katerimi je CDP promoviralmelanogeneza, smo obdelali HEM s CDP v različnih koncentracijah (20, 40 in
80 ug/mL) 48 ur in nato raziskali fosforilirane in skupne ravni proteinov ERK, JNK in p38 v signalni poti MAPK. Kot je bilo izmerjeno z Western blotom, so bile ravni p-ERK, p-JNK in p-p38 po zdravljenju s CDP povečane (P <.05), medtem="" ko="" se="" njihove="" skupne="" ravni="" niso="" spremenile="" (slika="" 4a,="" b).="" poskuse="" so="" ponovili="" s="" celicami="" b16f10="" in="" povečali="" so="" fosforilirane="" ravni="" proteinov="" erk,="" jnk="" in="" p38="" (p="">< 0,05),="" vendar="" se="" skupne="" ravni="" mapk="" niso="" spremenile="" (slika="" 4c,="" d),="" kar="" je="" skladno="" z="" rezultati="" v="" hem="">
3,4|CDP oslabljen H2O2-induciran
citotoksičnost in apoptoza v celicah HEM in B16F10
Za simulacijo smo uporabili H2O2oksidativni stresokolje in nadalje raziskal vlogo CDP v melanocitih podoksidativni stres. Končna koncentracija H2O2, uporabljena v HEM, je bila 500 μm, medtem ko je bila v celicah B16F10 1,0 mm. Da bi raziskali učinek CDP na citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2-, smo celice HEM in B16F10 predhodno obdelali s CDP v različnih koncentracijah (20, 40 in 80 ug/mL) 24 ur, nato dodali H2O2 in nadaljevali z obdelavo 24 ur pred izvedbo opazovanja in testa MTT.
H2O2 je povzročil očitno mehurjenje membrane in krčenje celic v HEM, v skupinah, ki so bile predhodno obdelane s CDP, se je stanje ublažilo. Samo zdravljenje s CDP ni imelo učinka (slika 5A). Preskus MTT je pokazal podoben rezultat, saj je zdravljenje s H2O2 zmanjšalo sposobnost preživetja HEM, medtem ko je CDP ta škodljivi učinek bistveno izboljšal.
3,5|CDP počisti H2O2-intracelularne ROS v celicah HEM in B16F10
Da bi raziskali mehanizme CDP za zmanjšanje citotoksičnosti in apoptoze, ki jo povzroča H2O2-, smo dodatno zaznali znotrajcelični ROS v celicah HEM in B16F10 s fluorescenco DCFH-DA
4|RAZPRAVA IN SKLEPI
V tej študiji smo raziskali vlogo CDP v celicah HEM in B16F10. Prvič smo ugotovili, da lahko CDP promoviramelanogenezav melanocitih in spodbujajo pigmentacijo pri cebricah. Kasnejši poskus je pokazal, da se je signalna pot MAPK aktivirala pri zdravljenju s CDP. Nadalje smo raziskali njegovo vlogo prioksidativni stresin ugotovil, da lahko CDP zmanjša citotoksičnost in apoptozo v melanocitih, ki jo povzroči H2O2-; medtem pa bi lahko CDP aktiviral antioksidantno pot NRF2/HO-1 in očistil intracelularne ROS podoksidativni strespogoji.
Proteinska kinaza, aktivirana z mitogenom, je vitalna pot, vključena v regulacijo MITF, ključnega transkripcijskega faktorja, ki spodbuja izražanjemelanogenezain posledično vpliva na sintezo in transport melanina.26,27 V naši študiji se je aktivacija ERK, JNK in p38 v melanocitih znatno povečala po zdravljenju s CDP; medtem pa izrazi MITF/p-MITF in TYR, TRP1, TRP2 in RAB27A, ki jih poganja MITF
so bile ustrezno regulirane. Zato predlagamo, da lahko CDP
promoviratimelanogenezaz aktiviranjem poti MAPK, vendar ostaja neznanka, kako CDP aktivira MAPK. Po nedavnih študijah je toll-like receptor 4 (TLR4) močno izražen v melanocitih in sodeluje pri melanogenezi.28,29 TLR4 je pomemben transmembranski protein, ki lahko specifično veže lipopolisaharid (LPS)30; študije so poročale, da lahko LPS inducira melanogenezo.29 Zanimivo je, da večpolisaharidiekstrahiran iz rastlin ali gob, ki domnevno aktivira TLR in nižje signalne poti, kot sta MAPK in jedrski faktor kapa beta (NF-κB). ling poti in spodbujamelanogeneza. Poleg tega je znano, da nukleotidom vezavni oligomerizacijski domeni podobni receptorji (NLR) prepoznajo intracelularne ligande in poganjajo aktivacijo signalnih poti MAPK in NF-κB. 33,34 Kot poročajo, lahko polisaharidi, ekstrahirani iz Ganoderme lucidum in Astragalusa, vstopijo v celice in vplivajo na NLR.35,36 Tako je možno, da lahko CDP vstopi v melanocite in uravnava signalno pot MAPK prek NLR. Vendar so za potrditev te hipoteze potrebne nadaljnje študije.
Nekatere dosedanje študije so poročale o uporabi zeliščpolisaharidiv melanogenezi za zaviranje proizvodnje melanina.37,38 Vendar je v tej študiji CDP spodbujal melanogenezo v
melanocitov, ta učinek pa je bil dodatno potrjen po primerjavi z -MSH. CDP je tudi neke vrstepolisaharidekstrahiran iz zelišč, sumimo, da je lahko nasprotni učinek CDP povezan s strukturnimi razlikami med CDP in drugimipolisaharidi. Polisaharidi nastanejo s polimerizacijo monosaharidov, vendar se razlikujejo glede na vrsto monosaharida, sestavo monosaharida, glikozidno vez, strukturo stranske verige in molekulsko maso39,40; ti dejavniki naj bi določali njihove biološke funkcije.41 Obstoječe študije so predlagale strukturo CDP in predlagale, da struktura CDP posledično vpliva na njegovo delovanje.42 Zato je potrebnih več dokazov za popolno razumevanje CDP in potrditev naše hipoteze.
Melanogeneza je pomemben zaščitni mehanizem odpornosti
ultravijolične poškodbe in vzdrževanje telesne homeostaze43; hkrati
melanociti so zlahka izpostavljeni neugodnim okoljem, kot je preobremenitev ROS.11 Znano je, da ROS sodelujejo pri spodbujanjumelanogeneza, je eden od mehanizmov aktiviranje MAPK.44 Toda študije so tudi pokazale, da ta učinek obstaja samo znotraj določene ravni ROS, medtem ko preobremenitev z ROS znatno poslabša melanogenezo.45 Razmerje med ROS, MAPK in melanogenezo je spremenljivo v različnih pogojih, torej ravnovesje med pro- in antioksidativnimi sistemi je očitno pomembno. Pri depigmentacijskih boleznih, kot je vitiligo, bosta neuravnotežen antioksidativni sistem in nenadzorovana preobremenitev z ROS poškodovala melanocite in zmanjšala viabilnost celic.11,46 V tej študiji smo uporabili različne koncentracije H2O2 za simulacijo preobremenitve z ROS v celicah in HEM so pokazali slabšo toleranco H2O2 kot celice B16F10. Ko so bili melanociti izpostavljeni obdelavi s H2O2, sta se njihova viabilnost in stopnja apoptoze poslabšali, vendar
Predobdelava CDP bi lahko delno obrnila trend. Istočasno so ROS očistili. Kot poročajo, je aktivacija antioksidacijske poti NRF2/ARE glavna metoda odstranjevanja ROS v kožnih celicah.14 V naših poskusih so bile ravni beljakovin NRF2 in HO-1 v melanocitih po zdravljenju s H2O2 brez CDP povečane; to pomeni, da povzroča H2O2-oksidativni streslahko aktivira pot NRF2/HO-1, vendar je nezadostna za vzdrževanje redoks ravnovesja in zaščito celice pred poškodbami. Vendar je predobdelava s CDP izboljšala antioksidacijsko pot NRF2/HO-1 in ponovno vzpostavila ravnovesje. Zato predlagamo, da lahko CDP zaščiti melanocite pred poškodbami zaradi oksidativnega stresa z aktiviranjem antioksidacijske poti NRF2/HO -1 in čiščenjem ROS.
Ugotovili smo, da samo zdravljenje s CDP nima vpliva na ROS ali NRF2/HO-1 v melanocitih. Ta rezultat nakazuje, da lahko CDP vpliva na redoks ravnotežje pod oksidativnim stresom, ne pa tudi v normalnih pogojih. Poleg tega naj bi antioksidacijsko pot NRF2/HO-1 urejale signalne poti PI3K, NF-κB in MAPK.47,48 V naši študiji je CDP uspel aktivirati signalno pot MAPK. Možno je, da lahko CDP aktivira pot NRF2/HO-1 prek navzgor reguliranih MAPK. Kot je poročal Slominski, so melanociti senzorji stresa, vključeni v regulativno mrežo, in njihove funkcije se lahko hitro spremenijo kot odziv na okolje.49 Predlagamo, da na vlogo CDP vpliva status melanocitov, lahko spodbuja melanogenezo, ne da bi vplival na antioksidant sistem v normalnih pogojih, vendar obnoviti redoks ravnovesje podoksidativni strespogoji. Zato lahko delovanje in preživetje melanocitov vzdržuje CDP na dva različna načina. CDP pomaga melanocitom vzdrževati homeostazo, kar je tudi pomembna funkcija melanogeneze.50,51
Skratka, CDP lahko spodbujamelanogenezamelanocitov
z aktiviranjem signalne poti MAPK. CDP lahko izboljša preživetje melanocitov z aktiviranjem antioksidativne poti NRF2/HO-1 in čiščenjem znotrajceličnega ROS v pogojih oksidativnega stresa. Naše ugotovitve so pomembne, ker dokazujejo, da lahko CDP spodbuja obojemelanogenezain ščiti melanocite predoksidativni strespoškodba, ki je verjetno odgovorna za disfunkcijo in izgubo melanocitov. Ugotovitve te študije kažejo, da bi bil CDP lahko novo zdravilo pri zdravljenju depigmentacijskih bolezni.
ZAHVALA
To delo so podprli Kitajska nacionalna naravoslovna fundacija (št. 81703101), projekti novih talentov Xiangya tretje bolnišnice Xiangya Univerze Central South (št. JY201623 in št. 20170301), naravoslovna fundacija province Hunan ( št. 2018JJ3788 in št. 2018JJ3793) in projekt zdravstvene komisije Hunan (št. C2019173). Dr. Yibo Hu je opravil glavni del študije in napisal rokopis; Profesor Jing Chen in Qinghai Zeng sta zasnovala študijo in vodila pisanje rokopisa; Profesor Jinhua Huang, Lihua Huang in Hong Xiang so zagotovili tehnično podporo in analizirali podatke; Dr. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang in Xiaojiao Zhao so prispevali k delu poskusov.
NASPROTJE INTERESOV
Avtorji potrjujejo, da ni konflikta interesov.
IZJAVA O RAZPOLOŽLJIVOSTI PODATKOV
Podatki, ki podpirajo ugotovitve te študije, so na voljo pri ustreznem avtorju na razumno zahtevo.
REFERENCE
1. Bleuel R, Eberlein B. Terapevtsko zdravljenje vitiliga. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.
2. Taieb A, Meurant JM. Ali bi morali dati prednost psihološkim posegom pri obvladovanju vitiliga? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.
3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, et al. Vitiligo. Primeri Nat Rev Dis. 2015; 1: 15011.
4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentacija melanina v koži sesalcev in njena hormonska regulacija. Physiol Rev. 2004; 84: 1155-1228.
5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tirozin in L-dihidroksifenilalanin kot hormonom podobna regulatorja funkcij melanocitov. Melanom pigmentnih celic Res. 2012;25:14-27.
6. Spritz RA. Skupni genetski odnosi, na katerih temelji generalizirani vitiligo in avtoimunska bolezen ščitnice. Ščitnica. 2010;20:745-754.
7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Otroški vitiligo na Kitajskem: klinični profili in imunološke ugotovitve v 620 primerih. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.
8. Boehncke WH, Brembilla NC. Avtoreaktivni T-limfociti pri vnetnih kožnih boleznih. Front Immunol. 2019;10:1198.
9. Iannella G, Greco A, Didona D, et al. Vitiligo: Patogeneza, klinične različice in pristopi k zdravljenju. Autoimmun Rev. 2016; 15: 335-343.
10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, et al. Reaktivne kisikove vrste pri presnovni in vnetni signalizaciji. Circ Res. 2018;122:877-902.
11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Melanociti kot pobudniki in žrtve oksidativnega stresa. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.
12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oksidativni stres in vitiligo: Nrf2-ARE
signalizacijski priključek. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.
13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Regulativno omrežje Nrf2 zagotavlja vmesnik med redoks in vmesnim metabolizmom. Trendi Biochem Sci. 2014;39:199-218.
14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Pomen Nrf2
pot pri (foto)-oksidativnem stresnem odzivu v melanocitih in keratinocitih človeške povrhnjice. Melanom pigmentnih celic Res. 2008;21:79-88.
15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, et al. In vivo model indukcije in terapije vitiliga: dvojno slepo, randomizirano klinično preskušanje. Melanom pigmentnih celic Res. 2012;25:57-65.
16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Ozkopasovna ultravijolična B fototerapija in 308-nm excimer laser pri zdravljenju vitiliga: pregled. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.
17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, et al. Ksenon kloridni ultravijolični B laser
je učinkovitejši pri zdravljenju psoriaze in induciranju apoptoze celic T kot ozkopasovni ultravijolični B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.
18. Xu P, Su S, Tan C, et al. Učinki vodnih izvlečkov Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparatorja in Rehmanniae radix preparatorja na melanogenezo in migracijo človeških melanocitov. J Etnofarmakol. 2017;195:89-95.
19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": pregled. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.
20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, et al. Predhodne karakteristike, antioksidativno in hepatoprotektivno delovanjepolisaharidodCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.
21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, et al. Delovanje proti utrujenosti izvlečka, bogatega s feniletanoidiCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.
22. Zhang H, Xiang Z, Duan X, et al. Protitumorski in protivnetni učinki oligosaharidov izCistanche deserticolaizvleček o poškodbi hrbtenjače. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.
23. Liu Y, Wang H, Yang M, et al.Cistanche deserticola polisaharidizaščititi celice PC12 pred poškodbami, ki jih povzroči OGD/RP. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.
24. Song D, Cao Z, Liu Z, et al.Cistanche deserticola polisaharidoslabi osteoklastogenezo in resorpcijo kosti z zaviranjem signalizacije RANKL in proizvodnje reaktivnih kisikovih vrst. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.
25. Fu C, Chen J, Lu J, et al. Znižana regulacija TUG1 spodbuja melanogenezo in melanogenezo, ki jo povzroča UVB. Exp Dermatol. 2019;28:730-733.
26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Program melanocitne linije daje odpornost na inhibicijo poti kinaze MAP. Narava. 2013;504:138-142.
27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Transkripcijska fiziologija" tvorbe pigmenta v melanocitih: osrednja vloga MITF. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.
28. Yu N, Zhang S, Zuo F, et al. Gojeni človeški melanociti izražajo funkcionalne tollu podobne receptorje 2–4, 7 in 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.
29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Človeški melanociti izražajo funkcionalni Tollu podoben receptor 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.
30. Reed SG, Carter D, Casper C, et al. Korelati dejavnosti adjuvansov družine GLA. Semin Immunol. 2018;39:22-29.
31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, et al. Romanpolisaharidpridobljen iz Craterellus cornucopioides, poveča imunomodulatorno aktivnost v imunosupresivnih mišjih modelih z regulacijo poti TLR4-NF-kappaB. Prehranska funkcija. 2019;10(8):4792-4801.
32. Wei W, Xiao HT, Bao WR, et al. TLR-4 lahko posreduje v signalnih poteh astragalusapolisaharidRAP je povzročil ekspresijo citokinov celic RAW264.7. J Etnofarmakol. 2016;179:243-252.
33. Chen H, Yang D, Han F, et al. Bakterijski T6SS efektor EvpP preprečuje vnetno aktivacijo NLRP3 z zaviranjem Ca(2 plus )-odvisne MAPK-Jnk poti. Mikrob celičnega gostitelja. 2017;21:47-58.
34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: večplastni imunski senzor v Nateu. Trendi Immunol. 2017;38:248-260.
35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Protivnetni in hepatoprotektivni učinki Ganoderme lucidumpolisaharidiproti poškodbi jeter, ki jo povzroča ogljikov tetraklorid pri miših Kunming. Farmakologija. 2019;103:143-150.
36. Tian Z, Liu Y, Yang B, et al. Astragaluspolisaharidublaži mišji kolitis z zaviranjem vnetja NLRP3. Planta Med. 2017;83:70-77.
37. Jiang L, Huang J, Lu J, et al. Ganoderma lucidumpolisaharidzmanjša melanogenezo z zaviranjem parakrinih učinkov keratinocitov in fibroblastov preko poti IL-6/STAT3/FGF2. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.
38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, et al. UčinekpolisaharidFMP-1 iz Morchella esculenta na melanogenezo v celicah B16F10 in cebrici. Prehranska funkcija. 2018;9:5007-5015.
39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, et al. Molekularne lastnosti in bioaktivnostpolisaharidiiz lucerne (Medicago sativa L.). Hranila. 2019;11:1181.
40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, et al. Prisotnost komponent v sledovih bistveno razširi molekularni odziv Aspergillus niger na guar gumi. Nova biotehnologija. 2019;51:57-66.
41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, et al. Karakterizacija rastlinepolisaharidiiz Dendrobium officinale z več kromatografskimi in masnimi spektrometričnimi tehnikami. J Chromatogr A. 2018; 1547: 29-36.
42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Strukturna karakterizacija in imunološka aktivnost dveh ekstrahiranih s hladno vodopolisaharidiodCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.
43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Kako se UV svetloba dotakne možganov in endokrinega sistema skozi kožo in zakaj. Endokrinologija. 2018;159:1992-2007.
44. Schalke S. Novi podatki o hiperpigmentacijskih motnjah. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(dodatek 5):18-21.
45. Glassman SJ. Vitiligo, reaktivne kisikove vrste in T-celice. Clin Sci. 2011;120:99-120.
46. Ristow M. Razkrivanje resnice o antioksidantih: mitohormeza pojasnjuje zdravstvene koristi, ki jih povzroča ROS. Nat Med. 2014;20:709-711.
47. Balogun E, Hoque M, Gong P, et al. Kurkumin aktivira gen hemoksigenaze-1 z uravnavanjem Nrf2 in elementa, ki se odziva na antioksidante. Biochem J. 2003;371:887-895.
48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signalizacija za
hem oksigenazo-1 in njen protivnetni terapevtski potencial.
Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.
49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanociti kot "senzorične" in regulatorne celice v povrhnjici. J Theor Biol. 1993;164:103-120.
50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Vloga pigmenta melanina pri melanomu. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.
51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, et al. Vloga melanogeneze pri uravnavanju vedenja melanoma: melanogeneza vodi do stimulacije izražanja HIF-1alfa in od HIF odvisnih spremljajočih poti. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.