Cistanche za zdravljenje vnetij in bolezni ledvic: kaj je vzrok za patogeno vlogo vnetja pri prizadetosti ledvic pri cistinopatiji?

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Interakcija med galektinom-3 in cistinozinom razkriva patogeno vlogo vnetja pri prizadetosti ledvic zaradi cistinoze

Tatjana Lobry^1,2 et al

Vnetjeje vpleten v patogenezo številnih bolezni. Vendar so osnovni mehanizmi pogosto neznani. Tukaj testiramo, alicistinoza, beljakovine, ki sodelujejo pricistinoza, je kritičen regulator galektina^-3, član družine proteinov, ki vežejo b-galaktozidazo, medvnetje. cistinozaje lizosomska motnja shranjevanja in kljub vseprisotnemu izražanju cistinoze,ledvicaje primarni organ, ki ga bolezen prizadene.cistinozaUgotovljeno je bilo, da povečuje lizosomsko lokalizacijo in razgradnjo galektina-3. V Ctns^–/–miši, model miškecistinoza, je galektin-3 čezmerno izražen vledvica. Odsotnost galektina-3 pri cistinotičnih miših izboljša patološko delovanje in strukturo ledvic ter zmanjša infiltracijo makrofagov/monocitov v ledvicah Ctns^–/–Gal3^–/–miši v primerjavi s Ctns^–/– miši. Ti podatki močno kažejo, da posreduje galektin-3vnetjevpleten vledvicanapredovanje bolezni pri cistinozi. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da galektin-3 medsebojno deluje s pro-vnetnim citokinom MonocyteChemoattractant Protein-1, ki stimulira rekrutiranje monocitov/makrofagov, in se je izkazalo, da se znatno poveča v serumu Ctns–/– miši in tudi bolniki zcistinoza. Tako naše ugotovitve poudarjajo novo vlogo cistinoze in interakcije galektina-3 pri vnetju in zagotavljajo dodatno mehanistično razlago zaledvicabolezen cistinoze. To lahko privede do odložitve identifikacije novih ciljnih zdravilcistinozanapredovanje.

KLJUČNE BESEDE:kronična ledvična bolezen; cistinoza; galektin-3;vnetje; monocitni kemoatraktantni protein–1

cistanche lahko zdravi kronično ledvično bolezen in cistinozo

Osnovni vzrok vnetja je, da lahko dušikov oksid povzroči nastanek vnetnih celic.Cistancheje dragoceno kitajsko zeliščno zdravilo. Njegove učinkovine lahko zavirajo izločanje dušikovega oksida in igrajo vlogo pri preprečevanju in zdravljenju vnetja in bolezni ledvic.

Prevajalska izjava

Kljub zdravljenju bolniki še vedno napredujejo do končne odpovedi ledvic. V tej raziskavi smo pokazali, da odsotnostcistinozapovzroči oslabljeno lizosomsko razgradnjo galektina-3 (Gal-3), kar povzročivnetjein napredovanjekronična ledvična bolezenvcistinoza. Te ugotovitve odpirajo nove poglede na možne terapevtske cilje, ki bi lahko omejili ali odložili degeneracijo ledvic pri bolnikih zcistinoza. Kot taka lahko protivnetna zdravila in zaviralci Gal-3, kot so nesteroidna protivnetna zdravila ali indometacin, izboljšajo ledvično patogenezo pri cistinozi.

Vnetjeje normalen akutni odziv organizma na poškodbo ali okužbo,¹ampak kroničnovnetjeje povezana s poškodbo tkiva. V primeru kroničnih bolezni, kot je sladkorna bolezen, poškodovana tkiva aktivirajo imunski sistem, kar vodi do neprekinjenega vnetnega odziva in sčasoma do degeneracije tkiva.² Citokini so ključni modulatorjivnetjein so sposobni aktivirati ali razrešitivnetjeprocesu.3 Pri bolnikih zkronična ledvična bolezen(CKD), zvišane plazemske koncentracije citokinov (interlevkina [IL]-6 in faktorja tumorske nekroze-a) invnetjemarkerji (C-reaktivni protein, IL-6, hialuronan in neopterin) so povezani z napredovanjem v končno ledvično odpoved.4 Razumevanje specifičnih mediatorjev, ki sprožijo vnetne odzive, olajša odkrivanje ustreznih tarč zdravil za preprečevanje degenerativnih poškodb .

cistinozaje avtosomno-recesivna presnovna bolezen, ki spada v družino lizosomskih motenj shranjevanja in je značilno kopičenje cistina v vseh organih.⁵ Gen okvarjen vcistinoza, CTNS, kodira lizosomski kotransporter cistina/protona, cistinozo.^6,7 Čeprav je CTNS povsod izražen, jeledvicaje prvi prizadeti organ pri osebah zcistinoza. Bolniki se v prvem letu življenja običajno pojavijo s Fanconijevim sindromom, za katerega so značilne hude motnje tekočine in elektrolitov, slaba rast in rahitis.⁸Nato se razvije kronična ledvična bolezen, ki napreduje v končno odpoved ledvic in zahtevaledvicapresaditev. Kopičenje cistina v vseh tkivih sčasoma vodi do večorganske disfunkcije; bolniki doživljajo fotofobijo in slepoto, hipotiroidizem, hipogonadizem, sladkorno bolezen, miopatijo in poslabšanje centralnega živčnega sistema.⁹ V ozadju C57BL/6 model miške z izpadom (Ctns^–/–) 10 posnema fenotip ledvic bolnikov s cistinozo,¹¹ kot tudi odlaganje cistinskih kristalov v roženici¹²in disfunkcijo ščitnice.¹³

V tej študiji razkrivamo novo vlogo zacistinozavvnetjeprek interakcije z Galom-3. Gal-3 je član družine proteinov, ki vežejo lektin in b-galaktozid ²¹ in je vključen v številne biološke funkcije, vključno zvnetje.²²V kontekstuledvicabolezni, je bilo dokazano, da inhibicija Gal-3 zmanjša izražanje vnetnih markerjev in ledvično fibrozo ter prepreči upad hitrosti glomerularne filtracije pri hiperaldosteronizmu, hipertenziji ali modelih debelosti.^23–26Tukaj ponujamo dokaze, da vcistinoza, odsotnostcistinozavodi v prekomerno izražanje Gal-3 vledvice, kar povečuje infiltracijo makrofagov in napredovanje kronične ledvične bolezni. Poleg tega identificiramo monocitni kemoatraktantni protein–1 (MCP-1) kot potencialnega mediatorja, ki razkriva nove genske tarče za zdravljenje z zdravili. REZULTATI Gal-3 sodeluje s cistinozo prek svoje domene za prepoznavanje ogljikovih hidratov. Za identifikacijo specifične interakcije partnerji z uporabo kvantitativne masne spektrometrije, pasje Madin-Darbyledvica(MDCK) celice so bile transducirane z lentivirusnim konstruktom za stabilno izražanje fuzijskega proteina cistinoze-zelenega FL fluorescentnega proteina (GFP). Poleg 9 podenot vakuolnega tipa Hþ adenozin trifosfataze, objavljenih prej,¹⁹Gal-3 je bil identificiran kot eden od proteinov, ki medsebojno delujejo zcistinoza(Slika 1a). Ta interakcija je bila dodatno potrjena s soimunoprecipitacijo, ki ji je sledilo Western blotiranje (slika 1b in c). Poleg tega smo pokazali, da je interakcija med Gal-3 incistinozaje posredovala Gal-3 domena za prepoznavanje ogljikovih hidratov (CRD), lokalizirana na C-terminalnem repu proteina. Interakcija je bila zavirana s tiodigalaktozidom, močnim zaviralcem interakcij galektina in ogljikovih hidratov (slika 1d). Kot vsi galektini ima Gal-3 afiniteto za glikozilirane proteine,21 zato je verjetno, da do interakcije z Gal-3 pride prek glikoziliranega dela cistinoze, ki se nahaja v intralizosomalnem N-terminalnem repu proteina.²⁷

Cistinozin poveča lizosomsko lokalizacijo in razgradnjo Gal-3

Za preverjanje morebitne lizosomske lokalizacije Gal-3 pri interakciji zcistinozasmo pokazali, da je bil Gal-3, tako kot katepsin D (intralizosomska proteaza), zaščiten pred prebavo s proteinazo K, medtem ko sta bila oba proteina prebavljena, ko so bili lizosomi permeabilizirani s Tritonom X- 100 (slika 2a in dodatna slika Slika S1). Podobni podatki so bili pridobljeni v lizosomih, izoliranih iz mišjih jeter, kar potrjuje lizosomsko lokalizacijo Gal-3 in vivo (sliki 2b in c). Zaradi odsotnosti zanesljivega protitelesa za odkrivanjecistinoza, je bilo opravljeno imunsko barvanjecistinoza-GFP–celične linije MDCK s protitelesom proti Gal-3. Potrdilo je prisotnost Gal-3 v lumnu lizosomov, medtem ko so cistinozo-GFP in Lamp-2 (lizosomski transmembranski protein) našli samo na membrani veziklov (slika 2d).

Raziskati, čecistinozinje bil udeležen v prometu Gal-3, smo analizirali dinamiko obehcistinozain Gal-3–pozitivni vezikli z uporabo dvobarvne živecelične fluorescenčne mikroskopije s popolnim notranjim odbojem FL v fibroblastih mišjih zarodkov (MEF) iz divjega tipa (WT) in Ctns^–/–miši, ki izražajo tako CTNS-DsRed kot Gal-3-GFP. Naša analiza je to potrdilacistinozain Gal-3 sta podvržena pravi kolokalizaciji v Ctns–/– MEF, kar potrjuje podobna prostorsko-časovna porazdelitev teh molekul v območju fluorescenčne mikroskopije FL s popolnim notranjim odbojem (slika 2e). Podatki v WT MEF so bili podobni (podatki niso prikazani). Poleg tega, ko so analizirali MEF-je, transficirane samo z Gal- 3-GFP, so v citoplazmi našli Gal-3-GFP in niso opazili izrazite vezikularne strukture, v nasprotju s sotransfekcijo s CTNS-DsRed ( podatki niso prikazani).

Ti podatki so bili potrjeni v celicah 293T, v katerih so opazili močan signal GFP v citoplazmi v celicah, ki izražajo samo Gal-3–GFP, medtem ko v celicah, ki izražajo tako Gal-3–GFP kotcistinozin-DsRed, Gal-3–GFP je bil večinoma lokaliziran znotraj lizosomov, ki izražajo cistinozo-DsRed (slika 3a). Poleg tega kvantifikacija ekspresije proteina Gal-3 v celicah, transficiranih samo z Gal-3–GFP ali Gal- 3–GFP in CTNS-DsRed ter Gal-3–GFP in DsRed kot kontrolo, so pokazale znatno manj beljakovin Gal-3-GFP v celicah, sotransficiranih s CTNS-DsRed, v primerjavi s celicami, transficiranimi samo z Gal-3-GFP ali sotransficiranimi z DsRed (slika 3b). Ti rezultati skupaj kažejo na tocistinozinizboljša lizosomsko lokalizacijo in razgradnjo Gal-3. Pokazalo se je, da je cistinozin vpleten v CMA.28 Protein toplotnega šoka 70 kDa (Hsc70) sodeluje pri CMA tako, da pomaga pri odvijanju in translokaciji substratnih proteinov preko membrane v lizosomski lumen na način, ki je odvisen od LAMP2A.29,30 Ker Gal{ Predlagano je bilo, da se {8}} razgradi s CMA,31 raziskali smo lokalizacijo Gal-3 glede na Hsc70 v cistinotičnih MEF. Konfokalna mikroskopska analiza je potrdila kolokalizacijo Gal-3–GFP pri pozitivnih strukturah Hsc70- tako v WT (podatki niso prikazani) kot v Ctns^–/–celicah (slika 3c), kar podpira soprenos Gal-3 s Hsc70 in kaže, da je lizosomska internalizacija, ne pa tudi prepoznavanje Gal-3 s strani spremljevalca, pomanjkljiva vcistinoza.

Gal-3 je vpleten v vnetje ledvic pri Ctns^–/–miši

Preučiti vlogo Gal-3 vcistinozain vivo smo ustvarili model miške z dvojnim izločanjem, ki je bil pomanjkljiv v obehcistinozinin Gal-3 (Ctns^–/–punca-3^–/–miši). WT, Ctns^–/–in Gal-3^–/–miši so bile uporabljene kot kontrolni subjekti. V C57BL/6 Ctns^–/–pri miših se ledvične anomalije pojavijo pri starosti okoli 10 mesecev.11 Zato so bile študije izvedene pri 8 do 9 mesecih, koledvicaanomalije se začnejo odkrivati ​​in pri 12 do 15 mesecih, ko anomalije ledvic napredujejo. Ker je bilo ugotovljeno, da je vsebnost cistina različna pri moških in ženskah Ctns^–/– ledvice, so bili analizirani ločeno. Če vsebnost cistina narašča s starostjo pri obeh genotipih, niso opazili pomembne razlike v ledvicah samcev in samic med Ctns–/– Gal-3–/– mišmi in Ctns^–/– miši v starosti od 8 do 9 mesecev in od 12 do 15 mesecev (slika 4a).

Ledvično delovanje so ocenili v serumu in urinu in niso opazili pomembne razlike med WT in Ctns^–/–miših pri 8 do 9 mesecih (podatki niso prikazani), pri 12 do 15 mesecih pa Ctns^–/–miši so pokazale bistveno višje ravni serumskega kreatinina in sečnine v primerjavi z mišmi WT. Zanimivo, Ctns^–/–punca-3^–/–miši so pokazale izboljšano delovanje ledvic v primerjavi s Ctns^–/–miši pri 12 do 15 mesecih z nižjim serumskim kreatininom (P <{2}}.05) in sečnino (P <0,05; tabela 1).

Histološke študije miši, starih od 8- do 9- mesecev in od 12- do 15- mesecevledvicaodseki so pokazali prisotnost hudih anomalij v Ctns^–/– ledvicevključno s tubularno atrofijo, umaknjenimi glomeruli in mononuklearnimi infiltrati. Slepa analiza odsekov ledvic je razpon obsega kortikalne poškodbe od 1 (ohranjena struktura tkiva) do 6. Povprečna ocena za Ctns^–/–miših je bilo 2.64 - 0.36 pri starosti 9 mesecev (n=7) in 4,12 0.37 pri starosti od 12 do 15 mesecev (n=16). V ledvicah Ctns^–/–punca-3^–/–pri miših iste starosti so bile te anomalije bistveno manj obsežne: 1.62 - 0.11 pri 9 mesecih (n=21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" in="" 3.04="" -="" 0.22="" pri="" 12="" do="" 15="" mesecih="" (n="33;" p="">< 0,05,="" mann-whitneyjev="" t-test)="" (slika="" 4b="" in="" dodatna="" slika="" s2).="" poleg="" tega="" je="" bil="" vsakemu="" tkivu="" dodeljen="" odstotek="" tubularne="" atrofije="" in="" povprečje="" za="">^–/–miši in Ctns^–/–punca-3^–/–miših je bilo 66 odstotkov oziroma 42 odstotkov pri 12 do 15 mesecih (P=0.01). Poleg tega je presenetljiva razlika med Ctns^–/–in Ctns^–/– punca-3^–/– ledvicaodsekih je bila prisotnost nekaj mononuklearnih infiltratov v Ctns^–/–punca-3^–/–odsekih, medtem ko so bili močni infiltrati dosledno opaženi v Ctns^–/– ledvica(Slika 4b).

Označili smo mononuklearne infiltrate, opažene s histološkim pregledom pri 8- do 9--mesečnih Ctns^–/– ledvicekot makrofagi/monociti s sočasnim imunskim barvanjem s CD68 in CD45 ter s CD68 in glavnim histokompatibilnim razredom II (dodatna slika S3), vendar ne s CD68 in CD163, kar nakazuje, da imajo ti makrofagi proinflamatorni profil, podoben M1-.32 ,33 Kvantifikacija CD68- pozitivnih celic je pokazala bistveno manj makrofagov/monocitov v WT, Gal-3^–/–, in Ctns^–/–punca-3^–/– ledvicev primerjavi s Ctns^–/– ledvice(Slika 4c), kar potrjuje histološke podatke (Slika 4b).

Te ugotovitve skupaj kažejo, da je Gal-3 vpleten v rekrutiranje makrofagov/monocitov v cistinotikuledvicein da njegova odsotnost izboljša ledvično bolezen pri Ctns^–/–miši. Zato nakazuje, davnetjeje vsaj delno odgovoren za poslabšanje delovanja ledvic pri Ctns^–/– miši.

Ledvice s pomanjkanjem Ctns kažejo prekomerno izražanje Gal-3

Z analizo Western blot smo ugotovili, da se je izražanje Gal-3 znatno povečaloledviceod 12-mesečnih Ctn^s–/–miših v primerjavi z mišmi WT (slika 5a in b). Raziskati, ali je to povečano izražanje Gal-3 specifično za Ctns^–/– ledvicesmo kvantificirali izražanje Gal-3 na ravni transkripta in beljakovin vledviceod miši s kronično ledvično boleznijo, povzročeno s standardno vmesno 2-stopenjsko operacijo nefrektomije, in od živali, ki so bile podvržene navidezni operaciji. WT in Ctns^–/–miši so bile uporabljene kot kontrolni subjekti. Transkripti Gal-3 so bili znatno povečani pri Ctns–/– in lažnih ledvicah, vendar močno povečani pri kronični ledvični bolezniledvicev primerjavi z mišmi WT (slika 5c). Nasprotno pa je bil na ravni beljakovin Gal-3 odkrit samo v Ctns^–/–ledvice, kar močno nakazuje, da samo Ctns^–/–ledvice niso mogle razgraditi beljakovine Gal-3 (slika 5d). Imunofluorescentno barvanje Gal-3 v muriniledvicapri 8 do 9 mesecih prav tako pokazala prekomerno izražanje Gal-3 v Ctns^–/– ledvicev primerjavi z WTledvice(Slika 5e). Poleg tega so Gal-3 izražali makrofagi CD68þ, pa tudi ledvične celice v Ctns^–/– ledvicepri 8 do 9 mesecih (dodatna slika S4). Skupaj so ti podatki skladni z zmanjšano razgradnjo Gal-3 v odsotnosticistinozakot je prikazano in vitro (sliki 3a in b), kar vodi do kopičenja proteina Gal-3 v Ctns^–/– ledvice.

Odsotnost cistinozina povzroči povečan serumski MCP-1 prek regulacije Gal-3

Gal-3 urejavnetjeprek različnih mehanizmov.34 Tako, da bi pridobili nadaljnji vpogled v mehanizem vcistinozasmo raziskali izražanje različnih protivnetnih ali protivnetnih citokinov v serumu 12- do 15-mesečnih WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, in Ctns^–/–punca- 3^–/–miši. Šest ravni citokinov so izmerili z nizom mišjih citometričnih kroglic, MCP-1, interferonom-g, faktorjem tumorske nekroze ter IL-10, IL-6 in IL-12p70. Samo izražanje MCP-1 je bilo znatno povečano v serumu miši Ctns–/– v primerjavi z mišmi WT in Gal-3–/– ter tudi s Ctns^–/–punca-3^–/–miši, katerih serumske ravni MCP-1 so bile primerljive z mišmi WT (slika 6a). MCP-1 proizvajajo različni tipi celic, pri čemer so glavni vir MCP-1 makrofagi in monociti,35 in deluje kot kemoatraktant za monocite in makrofage ter uravnava njihovo migracijo in infiltracijo. Nasprotno pa je bilo pri isti starosti ugotovljeno, da je izražanje Gal-3 podobno v serumu miši Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n=5) in miši WT (40.{{12} }.41 ng/ml; n=7).

Razmerje med Gal-3 in MCP-1 je bilo nadalje raziskano s soimunoprecipitacijo z uporabo Gal-3–GFP in MCP-1–DsRed– ali Gal-3– GFP in CTNS-DsRed– (kot pozitivna kontrola), ki izražata celice 293T. Opazili so interakcijo med Gal-3 in MCP-1 (slika 6b), kar kaže na neposredno indukcijo MCP-1 s strani Gal-3. Inkubacija z N-acetil-D-laktozaminom (LacNAc), zaviralcem Gal-3 CRD, je pokazala, da v nasprotju zcistinozininterakciji, CRD ni vključen v interakcijo med Gal-3 in MCP-1 (slika 6c).

Da bi ocenili, ali je ta ugotovitev pomembna pri ljudeh, smo izmerili ravni Gal-3 in MCP-1 pri bolnikih zcistinozaki niso prejemali imunosupresivnega zdravljenja ali jemali protivnetnih zdravil. Čeprav je bilo ugotovljeno, da je bila raven Gal-3 v serumu bolnikov s cistinozo nekoliko povečana v primerjavi z zdravimi darovalci, razlika ni bila pomembna (slika 6e), kar potrjuje naše rezultate, pridobljene v Ctns^–/–miši. Le 2 bolnika sta imela visoko raven Gal-3 (25,34 in 39,54 ng/ml); veljali so za izstopajoče in zato niso bili vključeni v sliko 6e. Nasprotno pa so z uporabo encimsko vezanega imunskega testa, usmerjenega proti človeškemu MCP-1 (slika 6d), ugotovili, da so serumske ravni MCP-1 pri bolnikih zcistinoza(252.1 - 18.4 pg/ml; n=19; starostni razpon 1–23 let) kljub zdravljenju s cisteaminom v primerjavi z zdravimi kontrolnimi osebami (166.9 -13.5 pg/ml; n=1). 0; starostni razpon 8–63 let) (P < 0,001).="" med="" starostjo="" in="" ravnjo="" mcp-="" 1="" pri="" obeh="" bolnikih="">cistinozain zdravi darovalci (podatki niso prikazani).

Cistancheimaprotivnetnolastnosti

DISKUSIJA

Kljub temu, da se cistin kopiči v vseh tkivih pri bolnikih zcistinoza, so ledvice organi, ki so najbolj ranljivi za poškodbe. Zato verjamemo, da kopičenje cistina ni izključno odgovorno za degeneracijo ledvic. Tukaj opisujemo novo vlogo zacistinozinv uredbi ovnetjesodeluje pri napredovanju kronične ledvične boleznicistinoza. Ta študija lahko pojasni, zakaj bolniki kljub zdravljenju s cisteaminom razvijejo končno odpoved ledvic.

Študija molekularnih partnerjev cistinoze je pokazala neposredno interakcijo z Gal-3, ki jo lahko zavirajo zaviralci Gal-3 CRD. Nedavne študije so pokazale, da lahko Gal-3 medsebojno deluje z glikani, ki se nahajajo v lizosomskem lumnu po lizosomski poškodbi, kot je kopičenje kristalov.36 V naši študiji je interakcija med Gal-3 incistinozinproučevali v zdravih celicah, ki izražajocistinozinin zato ne kopičijo cisteina ali cistinskih kristalov. Poleg tega je čezmerna ekspresija Gal-3 in cistinozina v zdravih celicah spremenila subcelično lokalizacijo Gal-3, ki je bila nato lokalizirana na lizosome, v primerjavi s čezmerno ekspresijo samo Gal-3, ki nahajal v citoplazmi. Ti rezultati močno kažejo, da interakcija med Gal-3 in cistinozinom poteka neodvisno od lizosomske poškodbe in da je cistinozin aktivno odgovoren za lizosomsko lokalizacijo Gal-3. Prej je bilo dokazano, da se Gal-3 razgradi z lizosomsko odvisno proteolizo v odsotnosti Abl in Arg, 2 tirozin kinaz.³¹

Poleg tega smo pokazali, dacistinozain Gal-3 se lokalizirata pri dinamičnih vezikularnih strukturah in sta skupaj mobilizirana na prostorsko-časovni način.Cistinozinprej povezovali z mehanizmi trgovanja lizosomskega LAMP2A, edinega znanega receptorja CMA, ki je napačno lokaliziran vcistinoza.²⁸Prej je bilo dokazano, da razgradnjo Gal-3 posreduje CMA.³¹Konfokalna mikroskopska analiza je potrdila kolokalizacijo Gal-3 pri Hsc70-pozitivnih strukturah v obeh Ctns^–/– in celice WT, ki podpirajo soprenos Gal-3 s Hsc70 za predstavitev na lizosomu in razgradnjo s CMA, saj Hsc70 pomaga pri translokaciji substratnih proteinov preko membrane v lumen lizosoma.^29,30Možna interpretacija naših rezultatov jecistinozinuravnava promet in dostavo Gal-3 v CMA-aktivne lizosome za razgradnjo.

Ta nova potcistinozin-odvisna Gal-3 lizosomska lokalizacija in razgradnja sta podprti in vivo, saj imajo miši s pomanjkanjem Ctns prekomerno izražanje Gal-3 znotrajledvica. Poleg tega je bila povečana mRNA Gal-3 omejena v Ctns^–/–ledvicah v primerjavi z drugim modelom kronične ledvične bolezni je bila velika količina proteina Gal-3 odkrita samo v Ctns^–/– ledvice. Ti podatki močno podpirajo sklep, dacistinozinsodeluje pri razgradnji proteina Gal-3, ki lahko nadzoruje prekomerno izražanje mRNA Gal-3 v stresnih stanjih, kot je KLB.

Gal-3 ima več bioloških vlog, vključno z vlogami pri akutnem in kroničnemvnetjes privabljanjem monocitov in makrofagov.^37,38V Ctns^–/– miših smo opazili močne mononuklearne infiltrate predvsem vledvicakot je opisano prej,^11,39ki so bili označeni kot monociti/makrofagi. Nasprotno pa ledvice iz dvojnega knockout Ctns^–/–punca-3^–/–miši so pokazale zelo malo infiltratov monocitov/makrofagov, kar močno nakazuje, da je Gal-3 vpleten vvnetjev ledvicah Ctns^–/–miši. V kontekstu ponavljajoče se poškodbe tkiva lahko Gal-3 sproži prehod v kroničnovnetjein fibrozo.³⁴V skladu s temi ugotovitvami naši podatki kažejo na vpletenost Gal-3 v napredovanje KLB pricistinoza. Dejansko je dvojni izpad Ctns^–/– punca-3^–/–miši so se bolje izkazaleledvicafunkcijo in strukturo v primerjavi s Ctns^–/–miši. Podobno imajo miši s pomanjkanjem Gal-3 manj ledvične fibroze vledvicav primerjavi z mišmi WT po enostranski obstrukciji sečnice,⁴⁰ in Gal-3 knockout miši, ki so bile podvržene ishemično-reperfuzijski poškodbi, so imele boljšo ledvično funkcijo v primerjavi z mišmi WT, ki so bile izpostavljene ishemično-reperfuzijski poškodbi.⁴¹

Čeprav je bila ugotovljena korelacija med ravnmi Gal-3 v plazmi in razvojem kronične ledvične bolezni,42 niso opazili nobene razlike v izražanju Gal-3 v serumu miši in ljudi, ki jih je prizadelacistinozain zdravi kontrolni subjekti. Z merjenjem različnih ravni citokinov v serumu smo ugotovili znatno povečanje MCP-1 v Ctns^–/–miši, medtem ko Ctns^–/–punca-3^–/–miši so imele ravni, primerljive s tistimi pri miših WT. MCP-1 je citokin, ki se lahko sprosti v serumu in tvori gradient za privabljanje monocitov in makrofagov na mesto poškodbe.35 Povečanje MCP-1 v serumih Ctns^–/–miši v primerjavi s Ctns^–/–punca-3^–/–miši je bila neodvisna od kopičenja cistina, kerledvicaVsebnost cistina je bila pri obeh genotipih podobna. Poleg tega je bilo kljub zdravljenju s cisteaminom, ki je omogočilo izstop cistina iz lizosomov, MCP-1 znatno povečan v serumih bolnikov zcistinozav primerjavi z zdravimi darovalci. Ti podatki močno kažejo na to, da odsotnostcistinozin, namesto kopičenja cistina, je odgovoren za povečanje MCP-1 v serumu. Poleg tega smo pokazali neposredno interakcijo med Gal-3 in MCP-1, ki so jo nedavno predlagali Gordon-Alonso et al.43, vendar je niso dodatno preučevali. Mehanizem Gal-3-posredovane aktivacije MCP-1 tukaj ni bil proučen. Hipoteza je prisotnost signalnega peptida v človeškem MCP-1, ki se lahko razcepi, da se poveča njegovo izločanje.44 Poleg tega lahko plazmin cepi C-konec MCP-1, kar poveča njegov kemoatraktant moč.45 Poleg tega je v korelaciji z našimi podatki zaviranje MCP-1 v mišjem modelu diabetične nefropatije preprečilo infiltracijo ledvičnih makrofagov in izboljšalo delovanje ledvic.46,47cistinoza, naši podatki močno kažejo, da odsotnostcistinozinvodi do povečanja Gal-3, kar aktivira MCP-1 mobilizacijo krvi, kar poveča delovanje ledvicvnetjein napredovanjekronična ledvična bolezen.

Te ugotovitve odpirajo nove poglede na možne terapevtske cilje, ki bi lahko omejili ali odložili degeneracijo ledvic pri bolnikih zcistinoza. Ugotovljeno je bilo, da nesteroidna protivnetna zdravila, kot sta aspirin in indometacin, zavirajo izražanje Gal-3 z zaviranjem njegove transkripcije.48 Indometacin se dejansko uporablja za uravnavanje poliurije in polidipsije pricistinoza49 in nedavna študija 307 evropskih bolnikov s cistinozo je pokazala izboljšan ledvični izid pri bolnikih, zdravljenih z indometacinom.50 V luči naše študije je uporaba indometacina ali nesteroidnih protivnetnih zdravil zacistinozabolniki se lahko ponovno razmislijo.

METODE

Poskusi na živalih

C57BL/6 Ctns^–/–miši je zagotovil dr. Antignac (Inserm U1163, Pariz, Francija). C57BL/6 galektin-3 nič (Gal-3^–/–) miši sta zagotovila dr. Fu-Tong Liu (Univerza v Kaliforniji, Davis) in dr. Jerrold M. Olefsky (Univerza v Kaliforniji, San Diego). Strategija vzreje za ustvarjanje WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, Ctns–/– in Gal- 3^–/–miši je opisano v dopolnilnih metodah.

Celične linije

nered je nastal iz biopsij kože novorojenčkov WT in Ctns^–/–miši. Celične linije MEF, 293T in MDCK tipa II (ATCC, Manassas, VA) so bile gojene v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle, ki je vseboval 10 % fetalnega telečjega seruma ali fetalnega govejega seruma, 100 enot/ml penicilina, 0,1 mg/ml streptomicina in 2 mM L-glutamina.

Analiza ko-imunoprecipitacije in masne spektrometrije

Za preučevanje interakcij protein-protein so bile celice MDCK transducirane z uporabo lentivirusnega vektorskega ogrodja pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE za stabilno izražanjecistinozin-GFP.⁵¹Ko-imunoprecipitacija je bila izvedena, kot je opisano v dopolnilnih metodah. Soimunoprecipitirane proteine ​​smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in analizirali z masno spektrometrijo, LTQ Orbitrap, kot je že opisano.¹⁹

Celice 293T, ki izražajo Gal-3–GFP in MCP-1–DsRed ali Gal-3–GFP in CTNS-DsRed, so bile uporabljene za soimunoprecipitacijo, kot je opisano v dopolnilnih metodah. Soimunoprecipitirane proteine ​​smo ločili s SDS-PAGE in MCP-1, ki veže Gal-3, smo odkrili z uporabo protitelesa proti DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

Subcelično frakcioniranje

Osem jeter smo pridobili iz miši C57BL/6 in jih pripravili, kot je opisano prej.52 Pogoji gradienta so bili v bistvu enaki, kot je opisano v izvirni publikaciji,52 le da je bil namesto metrizamida uporabljen Nycodenz.

Zdravljenje z zaviralci Gal-3 in proteinazo K

Lizati izcistinozin-GFP MDCK celice in 293T, ki izražajo Gal-3–GFP in CTNS-DsRed ali Gal-3–GFP in MCP-1–DsRed, so bile inkubirane s 5 mM tiodigalaktozida ali 5 mM N ali brez njih. -Acetil-D-laktozamin, 2 zaviralca Gal-3 CRD. Po 30 minutah inkubacije pri 4 - C s stalnim stresanjem smo lizate inkubirali s 50 ml anti-GFP mikrokroglic in izvedli imunoprecipitacijo, kot je bilo omenjeno prej. Oborjene proteine ​​smo ločili s SDS-PAGE na 10-odstotnem gelu.

Lizati izcistinozin-GFP MDCK celice in frakcije, obogatene z lizosomi mišjih jeter, so bile inkubirane z ali brez 2 odstotkov Triton X-100 10 minut pri 4 - C in nato inkubirane 30 minut z ali brez 2,5 mg/ml in 25 mg /ml proteinaze K oz. Po inaktivaciji encima z 1 mM fenilmetilsulfonil fluoridom 5 minut pri 4 - C smo proteine ​​ločili s SDS-PAGE na 10-odstotnem gelu.

Imunofluorescenčna analiza

Fiksne celice MDCK so bile inkubirane s protitelesi proti Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) in protitelesom proti Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) 2 uri pri sobni temperaturi, čemur je sledila Alexa Fluor 555 sekundarno protitelo (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1 uro pri sobni temperaturi. Konfokalne slike so bile posnete z mikroskopom Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Nemčija).

293T celice, ki začasno izražajo samo Gal-3–GFP, Gal-3–GFP in DsRed ali Gal-3–GFP incistinozin-DsRed so gojili na pokrovnem stekelcu, preden so jih namestili na objektno stekelce. Celice smo slikali z instrumentom Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japonska).

Popravljenoledvicaodseke smo čez noč inkubirali pri 4 - C s protitelesom proti CD68 (BioLegend, San Diego, CA) ali protitelesom proti Gal-3 (BioLegend), čemur je sledilo sekundarno protitelo Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 uro pri sobni temperaturi. Slike so bile pridobljene z instrumentom Keyence BZ-X700. Kvantifikacija izražanja CD68 je opisana v dopolnilnih metodah.

MEF-ji, ki izražajo Gal-3-GFP, so bili obarvani s protitelesom proti Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) in slikani, kot je opisano prej.⁵³

Fluorescenčna mikroskopija s popolnim notranjim odbojem FL

WT in Ctns^–/–MEF, ki izraža Gal-3–GFP, in CTNS-DsRed sta bila posejana na posodo s 4-komoro 35- mm borosilikatnega dna (Cellvis, Mountain View, CA). Po 2 dneh v kulturi smo MEF analizirali s fluorescenčno mikroskopijo s popolnim notranjim odbojem FL, kot je opisano prej⁵⁴in v Dopolnilnih metodah. Slike so bile analizirane s programsko opremo ImageJ.

Analiza izraza Gal-3

293T celice, ki izražajo Gal-3–GFP, Gal-3–GFP in DsRed ali Gal-3–GFP in CTNS-DsRed in eksplantiraneledviceso bili lizirani v pufru za radioimunoprecipitacijski test, ki je vseboval mešanico inhibitorjev proteinaze. Beljakovine so bile ločene na 4- do 15-odstotnem gelu in razkrite s protitelesom proti Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) ali protitelesom proti gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazi (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). .

Ledvicesmo homogenizirali v RLT pufru, ki je vseboval b-merkaptoetanol z uporabo Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francija). Izolirali smo RNA in izvedli Gal-3-specifično kapljično digitalno polimerazno verižno reakcijo, kot je opisano v dopolnilnih metodah. Ekspresija transkripta Gal-3 je bila izražena kot razmerje v primerjavi z endogeno kontrolo 18S. Za odkrivanje ravni Gal-3 v mišjih in človeških serumih smo v skladu z navodili proizvajalca uporabili encimsko imunosorbentni test (Abcam).

Ledvična funkcija

Ravni fosfatov v serumu in urinu, serumskega kreatinina in sečnine so bile ocenjene s kompletom QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit in QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Ravni beljakovin v urinu so bile izmerjene s kompletom Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).

Histologija

V času, ko so bile miši pokončane,ledviceso bili zbrani, fiksirani v formalinu in vdelani v parafin. Odseke, obarvane s hematoksilinom in eozinom, je na slep način pregledala dr. Marie Claire Gubler, kot je opisano v dopolnilnih metodah.

Merjenje vsebnosti cistina

Merjenje tkivnega cistina je bilo izvedeno z masno spektrometrijo (LC-ESI-MS/MS), kot je opisano prej.³⁹

Standardna nefrektomija in navidezna operacija

Miši CKD je bila inducirana s standardno vmesno 2-stopenjsko nefrektomijo, kot je opisano prej.^55,56Navidezna skupina miši je bila podvržena istemu postopku, vendar brez rezanjaledvicatkivo.

Raven citokinov v serumu

Za merjenje ravni citokinov v mišjem serumu, mišvnetjeniz citometričnih kroglic (BD Biosciences, San Jose, CA) je bil izveden v skladu z navodili proizvajalca. Koncentracija MCP-1 v človeškem serumu je bila določena z uporabo encimsko vezanega imunskega testa, usmerjenega proti MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) v skladu z navodili proizvajalca.

Statistična analiza

Vrednosti so izražene kot povprečje - SEM. Pomembnost rezultata je bila ocenjena z neparnim 2-t-testom z repom ali neparnim 2-t-testom z repom z Welchovim popravkom. Skupinske primerjave 3 pogojev ali več so bile narejene s parametrično analizo variance, čemur je sledil Tukeyjev test večkratnih primerjav za primerjave po parih. Histološke rezultate smo primerjali s testom Mann-Whitney. Analize so bile izvedene s programsko opremo Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). P-vrednost, manjša od 0,05, je veljala za pomembno.

Odobritev študije

Poskusi na miših so bili izvedeni v skladu s protokoli Institucionalnega odbora za uporabo živali. Uporabo človeškega tkiva v tej študiji je odobril Univerza v Kaliforniji, San Diego, HumanResearch Protections Program.

RAZKRITJE

SC je član znanstvenega odbora in član upravnega odboracistinozaRaziskovalna fundacija. SC je soustanovitelj, delničar in član znanstvenega odbora in upravnega odbora GenStem TherapeuticsInc. Pogoje tega dogovora je pregledala in odobrila kalifornijska univerza v San Diegu v skladu s svojo politiko navzkrižja interesov. Vsi drugi avtorji so izjavili, da nimajo konkurenčnih interesov.

zagotavljanje Gal-3^–/–miši. Zahvaljujemo se Louju Devanneauxu in NicholeFlerchingerju za njuno tehnično pomoč ter Elizabeth Souter za pregled rokopisa. Zahvaljujemo se Christopherju Alfonsu iz BDBioscience za zagotavljanje miškevnetjeniz citometričnih kroglic in za njegovo pomoč pri interpretaciji rezultatov. To delo je bilo podprto s subvencijami Nacionalnega inštituta za zdravje RO1-DK090058 in R01-DK110162,cistinozaResearch Foundation in Kalifornijski inštitut za regenerativno medicino (CIRM, CLIN-09230). TL podpira podiplomska štipendija Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB in JZ sta podprta s štipendijocistinozaRaziskovalna fundacija. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility je financiral štipendija Nacionalnega inštituta za nevrološke motnje in možgansko kap (NINDS) P30-NS047101.

REFERENCE

1. Medzhitov R. Izvor in fiziološke vlogevnetje. Narava. 2008; 454: 428–435.

2. Donath MY. Ciljanjevnetjepri zdravljenju sladkorne bolezni tipa 2. Diabetes Obes Metab. 2013; 15 (dodatek 3): 193–196.

3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Citokini v sindromu sistemskega vnetnega odziva: pregled. HSR Proc Intensive Caria Cardiovasc Anestezija. 2010; 2: 161–175.

4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Povezave med krožečimi vnetnimi označevalci in ostankom ledvične funkcije pri bolnikih s kronično odpovedjo ledvic. Sem JLedvicaDis. 2003; 41: 1212–1218.

5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.cistinoza. N Engl J Med. 2002; 347: 111–121.

6.Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Usmerjanjecistinozinna lizosomsko membrano potrebuje signal na osnovi tirozina in nov motiv razvrščanja. J Biol Chem. 2001; 276: 13314–13321.

7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cistinozin, beljakovina v okvaricistinoza, je lizosomski transporter cistina, ki ga poganja H( ). EMBO J. 2001; 20: 5940–5949.

8. Cherqui S, Courtoy PJ. Ledvični Fanconijev sindrom pricistinoza: patogenetski vpogledi in terapevtske perspektive. Nat Rev Nephrol. 2017; 13: 115–131.

9. Nesterova G, Gahl W. Nefropatskicistinoza: pozni zapleti multisistemske bolezni. Pediater Nephrol. 2008;23:863–878.

10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Pomanjkanje intralizosomskega kopičenja cistina pri mišihcistinozin, beljakovina v okvaricistinoza. Mol Cell Biol. 2002; 22: 7622–7632.

11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Ledvični fenotipcistinozamišji model je odvisen od genetskega ozadja. Presaditev Nephrol Dial. 2010; 25: 1059–1066.

12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. Očesne anomalije pri acistinozaživalski model posnema patogenezo bolezni. Pediatr Res. 2007; 62: 156–162.

13. Vodnik Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Mišji model nakazuje dva mehanizma za spremembe ščitnice pri dojenčkihcistinoza: zmanjšana sinteza tiroglobulina zaradi stresa endoplazmatskega retikuluma/nezvitega proteinskega odziva in oslabljenega lizosomskega procesiranja. Endokrinologija. 2015; 156: 2349–2362.

14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Zdravljenje s cisteaminom upočasni napredovanje nefropatijecistinozapri poznih mladostnikih in odraslih.LedvicaInt. 2012; 81: 179–189.

15. Cherqui S. Terapija s cisteaminom: zdravljenjecistinoza, ne zdravilo.LedvicaInt. 2012; 81: 127–129.

16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nefropatskicistinozapri odraslih: naravna zgodovina in učinki peroralnega zdravljenja s cisteaminom. Ann Intern Med. 2007; 147: 242–250.

17. Cherqui S, Courtoy PJ. Ledvični Fanconijev sindrom pricistinoza: patogenetski vpogledi in terapevtske perspektive. Nat Rev Nephrol. 2017; 13: 115–131.

18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Oslabitev avtofagije, posredovane s šaperonom, vodi do selektivnih okvar lizosomske razgradnje pri lizosomski bolezni shranjevanjacistinoza. EMBO Mol Med. 2015; 7: 158–174.

19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cistinozinje komponenta vakuolarnega kompleksa H -ATPaza-regulator-rag, ki nadzoruje tarčo signalizacije rapamicinskega kompleksa 1 pri sesalcih. J Am Soc Nephrol. 2016; 27: 1678–1688.

20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Aktivacija transkripcijskega faktorja EB reši lizosomske nepravilnosti pri cistinotičnihledvicacelice.LedvicaInt. 2016;89:862–873.

21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: an open-ended story. Biochim Biophys Acta. 2006; 1760: 616–635.

22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galektin-3: ena molekula za abecedo bolezni, od A do Ž. Int J Mol Sci. 2018; 19 (2).

23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. Vpliv zaviranja galektina-3 na z aldosteronom povzročene srčne in ledvične poškodbe. Srčno popuščanje JACC. 2015; 3: 59–67.

24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Farmakološka inhibicija galektina-3 ščiti pred hipertenzivno nefropatijo. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 308: F500–F509.

25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Modificiran pektin citrusov zmanjša izražanje galektina-3 in resnost bolezni pri eksperimentalnem akutnemledvicapoškodba. PloS One. 2011;6:e18683.

26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Blokada galektina-3 zmanjša ledvično fibrozo v dveh normotenzivnih eksperimentalnih modelih poškodbe ledvic. PloS One. 2016; 11: e0166272.

27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Vpliv nacistinozaglikozilacija na stabilnost beljakovin z diferencialnim dinamičnim označevanjem stabilnih izotopov z aminokislinami v celični kulturi (SILAC). Proteomika celic Mol. 2017; 16: 457–468.

28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Oslabitev avtofagije, posredovane s šaperonom, vodi do selektivnih okvar lizosomske razgradnje pri lizosomski bolezni shranjevanjacistinoza. EMBO Mol Med. 2015; 7: 158–174.

29. Majeski AE, Dice JF. Mehanizmi avtofagije, posredovane s šaperonom. Int J Biochem Cell Biol. 2004; 36: 2435–2444.

30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. avtofagija, posredovana s šaperonom, preprečuje apoptozo z razgradnjo BBC3/PUMA. Avtofagija. 2015; 11: 1623–1635.

31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. tirozin kinaze c-Abl in Arg uravnavajo lizosomsko razgradnjo onkoproteina galektina-3. Celična smrt se razlikuje. 2010; 17: 1277–1287.

32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Prevlada M2-polariziranih makrofagov pri raku mehurja vpliva na angiogenezo, stopnjo tumorja in invazivnost. Oncol Lett. 2016; 11: 3403–3408.

33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Veliko bolj kot makrofagi M1 in M2 obstajajo tudi makrofagi CD169( ) in TCR( ). Front Immunol. 2015; 6: 263.

34. Henderson NC, Sethi T. Regulacijavnetjeavtor galectin-3. Imunološka rev. 2009; 230: 160–171.

35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocitni kemoatraktivni protein-1 (MCP-1): pregled. J Interferon Cytokine Res. 2009; 29: 313–326.

36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Sproženo pridobivanje strojev ESCRT spodbuja endolizosomsko popravilo. Znanost. 2018;360(6384).

37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulacija alternativne aktivacije makrofagov z galektinom-3. J Immunol. 2008; 180: 2650–2658.

38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Človeški galektin-3 je nov kemoatraktant za monocite in makrofage. J Immunol. 2000; 165: 2156–2164.