Analiza sestave in imunološke dejavnosti Oligosaharidi izolirani iz Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Abstrakten.Oligosaharid (CDOS) je bil pridobljen izCistanche deserticolaz ekstrakcijo alkalij (pH=10), padavinami etanola in frakcijo v dve prečiščeni frakciji (npr. CDOS-1 in CDOS-2)s kromatografijo filtracije sephadex G-100 in Sephadex G-25. Monosaharidna sestava CDOS je bila ocenjena z visokozmogljivostno tekočo kromatografijo (HPLC). Ugotovili so, da je bil CDOS-1 sestavljen samo izharoze in CDOS-2 je bil sestavljen predvsem izharoze, rhamnose in manitola, z mol razmerjem 1:0,73:3,61. Imunološki testi so kazali, da je CDOS predstavljal znaten učinek na indeks vranice miške, povečanje aktivnosti phagocytosis makrofagov in spodbujanje proliferacije celic, ki proizvajajo protitelesa. Upamo, da bo CDOS razvit v funkcionalno hrano ali zdravilo.

Ključne besede:Cistanchedeserticola, oligosaharid, čiščenje, sestava, imunološke dejavnosti.

Cistanche deserticola imajo veliko učinkov, kliknite tukaj, da veste več

1. Uvod

Cistanchedeserticola Y.C.Ma. (Družina Orobanchaceae) je kratka parazitska rastlina na severozahodu Kitajske. Celotna posušena rastlina (brez rož ) je znana kot tonik in se imenuje "Rou Congrong". V orientalski medicini je razvrščena kot sladka in slana po okusu, topla v naravi in pripisana ledvičnih in velikih črevesnih kanalov, s funkcijoPoživljajoča2010.ledvicain dopolnjevanje bistvo, vlažilno črevo in sproščujoče črevesje [1]-[3]. Sodobna farmakološko študija je pokazala, da lahko spodbudi sintezo DNK in odloži proces senilnosti, poveča antioksidant [4] , prepreči in zdravi bolezni srca in ožilja [3]. Poleg tega lahko povzroči tudi analgeziko inAnti-Vnetne[5], poveča učenje in spomin s spodbujanjem dejavnikov rasti živcev [6]. Nekatere študije so pokazale, da bi lahko ekstrakti C. deserticola aktiviraliphagocytic funkcijo makrofaga v trebuhu pri miših [7]-[9] inizboljšatinega telesa"simunost[10]. V skladu s prejšnjimi študijami ta rastlina vsebuje več aktivnih sestavin, ki vključujejo fenilethanoidne glikozide, iridoide, lignane, saharide, alkaloide itd. [11] Kot C.deserticolafenilethanoidGlikozidiin polisaharidi so priznani kot glavne aktivne sestavine, številne študije so se v zadnjih desetletjih osredotočile na svoje strukture in bioaktivnosti [12]-[17]. Kar zadeva dragocene oligosaharide vC. deserticola, so poročila precej omejena. Oligosaharidi, kratko verižni saharid, ki vsebuje homo- ali hetero-sladkorje, so znani po blagodejnih učinkih na človeško življenje in so bili dolgo časa obsežno izkoriščeni [18]. Funkcionalni oligosaharidi, ki imajo fiziološko funkcijo, kot so nizka kariogenost in rastni faktor bifidobaktej [19], izboljšujejo zdravje ljudi in živali. Izkoriščene so bile kot živilska sestavina. Nedavno so poročali o novih funkcijah oligosaharidov, ki imajo sposobnost modulacije imunskega sistema pri ljudeh, živalih in ribah [20]. V tem članku poročamo o prvem delu rezultatov raziskovalnega programa, frakciji skupnih oligosaharidov, pridobljenih iz alkalnega izvlečka C. deserticola s kombinacijo ultrafiltracije in gelske prežemajoče kromatografije, ter analizo sestave le-teh z visokozmogljivostno tekočo kromatografijo (HPLC). Poleg tega predstavljamo tudi imunološke dejavnosti C. deserticola oligosaccharides. Po naših spoznanjih je o študijah imunostimulativnih dejavnosti, ki jih jeC. deserticolaoligosaharidi.

2. Eksperimentalno

2.1. Materiali

C. deserticola so gojili in zbirali iz Alxa League (Notranja Mongolija, Kitajska). Kunming miši (RazredI, star šest tednov) so bili kupljeni v Farmakološkem eksperimentalnem centru notranje mongolske univerze. Sephadex G-100,Sephadex G-25, trifluoroacetska kislina (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolon(PMP), D-glukoza, D-galaktoza, D-fruktoza, D-ksiloza, D-manoza, D-galakturonska kislina, D- glukuronska kislina, suharoza, rhamnose, manitol, fukoza, rhamnose, kupljene su od Sigme (St. Louis, MO, USA). Medium RPMI-1640 je bil kupljen pri Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, ZDA). Vse druge kemikalije so bile analitičnega razreda.

2.2 Ekstrakcija oligosaharidov

Posušena telesa C. deserticola so bila razrezana na manjše kose, dodatno zmlete v prah z mlinom pa so bile izvlečene z brezvodnim etanolom (3×5000 ml) pri 70° za 3 h pod atmosferskim tlakom. Kondenzator refluksa je bil pritrjeni za odstranjevanje lipidov. Preostali ostanki so nato 3-krat (2h) 3-krat (2h) izvlekli z alkalnim (pH=10) pri 60 °C. Po centrifugacijah (2000 g za 15 min, pri 20°) je bil supernatant koncentriran na eno desetino volumna v rotacijski izhlapevanju pod znižanim tlakom pri 50 °C in filtriran. Nato je bil filtrat deproteiniziran z reagentom Sevag [21] in okrašen z aktiviranim ogljikom.

2.3. Izolacija in čiščenje oligosaharidov

Zamrznjene surove oligosaharide so raztopila v destilirano vodo, centrifugirana, nato pa je bil supernatant očiščen s kolono Sephadex G-100 (1×50 cm), enakovredno z ultrapurno vodo. Po nalaganju vzorca se je steber izmikal z ultrapurno vodo s pretokom 5 ml/min. Različne frakcije so bile zbrane z uporabo epruvet. Skupna vsebnost ogljikovih hidratov v vsaki cevi je bila izmerjena pri 490nm po metodi fenol-H2SO4 [22]. Raztopina iz vode je bila ločena na dve frakciji CDOS-1 in CDOs-2. Dve frakciji sta bili prečiščeni naprej na stolpcu Sephadex G-25 (2,7×85 cm) z uporabo ultrapurne vode (pri pretoku 1 ml/min). Po zbiranju prečiščene frakcije, je bila lyophilized.

2.4 Analiza sestave monosaharida

Monosaharidno sestavo CDO so dosegli s HPLC analizo. CdOs (2 mg) so hidrolizirati najprej z brezvodnim metanolom, ki vsebuje 2 M HCl pri 80 °C za 16 h v dušikovem ozračju, nato pa z 2 M TFA pri 120 °C za 1 h. Po odstranitvi TFA z izhlapevanjem so bili hidrolizati nato izvedeni s PMP po opisani metodi [23], analizirali pa jih je HPLC. Ločitev HPLC je bila izvedena na sistemu EF-2002 HPLC (podjetje KNAUER, Nemčija). Derivati PMP so bili kromatografirani z uporabo sugar- PAK volumna (6,5×300mm, očala vodne družbe, Amerika), absorbanca pa je bila izmerjena pri 245 nm. Volumen injiciranja je bil 20μL, mobilna faza, sestavljena iz PBS (topilo A) in acetonitrila (vehikel B), pa je bila uporabljena za izokratsko elucijo pri razmerju volumna 82 % (A) do 18 % (B). Skupni čas teka HPLC je bil 40 min, pretok pa 0,5 ml/min.

2.5 Imunobiološke dejavnosti

2.5.1. Phagocytic funkcija monocita-makrofaga

Šestdeset kunming miši (RazredII, star šest tednov) so bili kupljeni v Farmakološkem eksperimentalnem centru univerze v Notranji Mongoliji in so bile aklimatizirane 1 teden pred uporabo. Vse miši so bile naključno razdeljene v štiri skupine, sestavljene iz skupine za nadzor slane soli, skupine z visokim cdos odmerjanjem, zmerne skupine odmerjanje in nizke cdos odmerjanje skupine. Miši so intraperitonealno injicirali z 0,5mL raztopine oligosaharidov enkrat na dan 5 dni. Skupina za odmerjanje z visokim, zmernim ali nizkim cdosom je prejela 100, 50 ali 25 mg/kg/BW CDO; in 0,5ml soli v kontrolni skupini. Sedmi dan je bil v skladu s hou [24] izveden poskus očistek ogljikovih delcev, izmerjeni pa sta bila indeks vranice in indeks timusa. Na kratko, 0,05 ml/10 g/bw Indijsko črnilo je bilo vbrizgano v vsako miško skozi veno caudalis, nato pa 20μL krvi dobili iz vena orbitalis posterior 3 in 7 minut po injiciranju. Vzorci krvi so bili dani v cevi z 2mL 0,1% Na2CO3, vrednosti OD pa 600 nm. Indeks očisteka (K),fagocitski indeks (α) in indeks imunskih organov so bili izračunani na naslednji način(1), t2 in t1 pomenijo 7 minut oziroma 3 minute.

2.5.2 Proliferacija celic, ki proizvajajo protitelesa

Skupine kunming miši (pet na skupino) so bile imunizirane z intraperitonealno injekcijo 2 x 107 SRBC v 1, 0 ml PBS dodane s 50ug preskusnih materialov (nobena v nadzoru). Teden dni kasneje so bili splenociti (106 celic na 2 ml na dobro) kunming miši kultureni s preskusnim materialom za 72 h v 10% RPMI 1640 srednje pod 5% CO2 v zraku, v trojni za vsako kulturo. Število PFC proti SRBC na 106 splenocitih je bilo določeno [25], [26].

2.6 Statistična analiza

Podatki so bili izraženi kot ±SD. Razliko med preizkušenimi skupinami in nadzorom je analiziral Študentov t-test. P< 0.05="" was="" considered="" to="" be="">

3. Rezultati in razprava

3.1. Izolacija in čiščenje oligosaharidov

CDO so bili izolirani iz alkalnega ekstrakta posušenih teles C. deserticola z donosom 3,07%. Dve frakciji CDOS-1 in CDOS-2 sta bili izolirani iz destilirane vode, ki jo izpusti stolpec Sephadex G-100 (slika 1). Prečiščeni frakciji CDOS-1 in CDOS-2 sta pokazali en vrh na stolpcu Sephadex G-25, kar kaže, da v vzorcu ni bilo drugih oligosaharidov. Rezultati monosaharidnih sestav so pokazali, da je bil CDOS-1 sestavljen samo iz suharoze (slika 2) in CDOS-2, ki sta bila v glavnem sestavljena izharoze, rhamnose in manitola (slika 3), z razmerjem mola 1:0,73:3,61.

3.2 Imunobiološke dejavnosti CDO

Veliko in vivo in in vitro dokazov je pokazalo, da naravni oligosaharidi prikazujejo imunomodulacijo funkcijo s spodbujanje tako celične kot humoralneImunski Odgovor[27], [28]. V tem papirju so 100 mg/kg/BW CDO povečali indeks vranice miške, vendar ni bilo pomembnih razlik v indeksu timusa med zdravljenimi skupinami in kontrolnimi skupinami(preglednica 1). Makrofag je pomemben sestavni del obrambe gostitelja pred virusno okužbo z zaviranjem znotrajcelične replikacije virusov in ubijanjem celic, okuženih z virusi [29]. Pri aktiviranju se iz makrofag sprostijo različni kisikovi ali dušikovi intermediati in citokini ter sodelujejo pri različnih pomembnih bioloških funkcijah, kot so protivnetne in proti tumorske dejavnosti [30]-[32]. Zato je phagocytic aktivnost makrofagov pomemben kazalnik imunskih funkcij organizma. V tej študiji so zmerni in visoki odmerki CDO povečali aktivnost phagocytoze makrofagov (preglednica1). Proliferacijo celic, ki proizvajajo protitelesa, ki so jo inducirale CDO, so preučili s pregledom povečanja hemolitične PFC pri vranicah kunming miši, ki so bile imunizirane s SRBC in preskusnim vzorcem. Rezultati so kazali, da zmerni in visoki odmerki CDO bistveno povečajo proliferacijo celic, ki proizvajajo protitelesa (preglednica2). Visoki odmerki CDO so povzročili zelo pomembno povečanje števila PFC (P<>

Sklicevanja

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Prepoznavanje biološkega signala, mešanega na podlagi wavelet analize. V: Y. Jiang, et al (eds). Proc. of UK-China Sports Engineering Workshop. Liverpool: Svetovna akademska unija. 2007, pp. 1-8.

[2] J. Ouyang, X.D. Wang, B. Zhao, et al. Učinki redkih zemeljskih elementov na rast cistanche deserticola celic in proizvodnjo fenilethanoidnih glikozidov. J B io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian, et al. Nov naravni izdelek iz cistanche deserticola Y.C.MA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioksidativno delovanje glikozidov Cistancheja v tkivu miši. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin L.W, Hsieh M.T, Tsai F.H, Wang W.H, Wu C.R.Anti-nociceptive in anti-vnetna aktivnost, ki jo povzroča Cistanche deserticola pri glodavcih. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, J.G; Luna, M; Jeong, H.U; Kim, M.C. Kim, S.Y; Oh, M.S. Cistanches Herba povečuje učenje in spomin z induciranje živčnega rastnega faktorja. Vedenjsko raziskovanje možganov. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Primerjava med Cistanche deserticola Y. C. Ma in C, tubulosa (Shenk) Wight o nekaterih farmakoloških dejanjih. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu X.F, Zeng G.Z, et al . Študija o krepitvi spolne potencnosti C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng G.Z, He W, Wu G.L, et al. Primerjave med cistanche deserticola Y. C. Ma in C.tubulosa težo na nekaterih farmakoloških dejanjih. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng Q.L, Zheng Y.F, Lu Z.L. Imunomodulatorni učinki polisaharida Cistanche deserticola Y. C. Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Napredek v raziskavah kemičnih sestavin in zdravilne dejavnosti cistanche. Kitajski divji rastlinski viri, 2010, 29(1):7-11.

Du N.S, Wang H, Yi YH. Izolacija in identifikacija fenilethanoidnih glikozidov iz cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu N.S, Liu J.L. Določanje fenilethanoidnih glikozidov v Cistanche deserticola z makro retikularno smolo- spektrometrijo. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong Q.B, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Zaviranje dušikovega oksida s fenilethanoidi v aktiviranih makrofagih.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan, et al. Strukturna analiza vodotopnega polysaccharide SPA Izolirana iz stebla Cistanche Deserticola Ma. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Študija o imunski farmakologiji in absorpcijskem značaju polisaharidov cistanche deserticola. 2011, št. S1, Medicine and Health Sciences, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotective activity of phenylethanoids from Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Priročnik amilaz in povezanih encimov (ed. the Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (ur.) Postopek 5. konference o zobnih kariesih in coupling sugarju (v japonščini), Nacionalni inštitut za zdravje, Tokio (1980)

[20] Kodo Otaka. Funkcionalni Oligosaharid in njegov novi vidik kot imunska modulacija. J. Biol. Makromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysaccharides iz ekstraktov tople vode praženih coffea arabica fižola: Izolacija in karakterizacija. Ogljikov hidrat. Polim.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles K.A, Hamilton J.K, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substancs. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analiza monosaharidnih komponent v Angelici polysaccharides z visoko zmogljivostjo tekoče kromatografije. Analni sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan, et al. Ekstrakcija in čiščenje Lectina iz red Kidney Bean in Preliminary Imune Function Studies of the Lectin in Four Chinese Herbal Polysaccharides. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, A. J. in A. Szenberg. Nadaljnje izboljšave tehnike plaka za odkrivanje enojnih celic, ki tvorijo protitelesa. Imunologija.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura, et al. Imunobiološke dejavnosti porinske frakcije izolirane iz fusobakterijskega jedrca ATCC 10953 [J]. Okužba in imuniteta. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang M.Q, Guilbert L.J, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu S.R, Pang P, Shan J.J. Imunomodulating activity of CVT- E002: lastniški izvleček iz severnoameriškega ginsenga (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard C.S, Kiyohara H, Reynolds J.C, Thomas-Oates J.E, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen B.S. Strukture i odnosi strukture-aktivnosti tri mitogena i komplementarne pektične arabinogalaktane iz malijskih antiulcernih biljki Cochlospermum tinctorium A. Rich i Vernonia kotschyana Sch Bip. Bivši Walp. Biomakromolekule. 2006, 7:71–79.

[29] E.M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim in J.-K. Hwang, Imunomodulating aktivnost arabinogalaktana in Fucoidan in vitro. Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.

Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Ocena in primerjava imunoregulatorne aktivnosti štirih hidrotopnih frakcij zdravila Angelica Sinensis in vitro na peritonealnih makrofagih pri miših ICR. Mednarodna imunofarmakologija. 2010, 10:422–430.

[31] Y. S. Lee, O. K. Han, C. W. Park, et al. Pro-vnetni citokin genski izraz in dušikov oksid regulation izvodnega Astragali radiksa v 264,7 makrofažnih celic RAW. Revija za etnofarmakologijo. 2005, 100(3): 289–294.

[32] K. Y. Lee in Y. J. Jeon. Polysaccharide izoliran iz Poria cocos sclerotium inducira NF-κB/ Rel aktivacijo in iNOS izražanje v makrofagi murine. Mednarodna imunofarmakologija. 2003, 3(10-11):1353–1362.