Kako sintaza dušikovega oksida vpliva na ledvice?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Molekularna študija toksičnosti diazinona na podlagi izražanja inducibilne sintaze dušikovega oksida (iNOS) v hepatocitih in histopatologiji ledvic podgan (Rattus norvegicus)

Povzetek

Diazinon je organofosfatni insekticid, ki se pogosto uporablja za izkoreninjenje škodljivcev, vendar ima večjo toksičnost kot drugi insekticidi. Diazinon, ki ga pomotoma zaužijemo oralno, vpliva na povečano količino reaktivnih kisikovih vrst (ROS) v telesu. Reaktivne kisikove vrste (ROS) bodo aktivirale provnetni citokin, ki bo induciral inducibilnoSintaza dušikovega oksida(iNOS), pri kateri iNOS (Sintaza dušikovega oksida) bo proizvajalDušikov oksid(NO) kot prosti radikal. Visoka raven ROS bo povzročila poškodbe celic. Ta študija je bila namenjena ugotavljanju toksičnega učinka diazinona na iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje v jetrih inledvicahistopatologija podgan (Rattus norvegicus). Podgane so bile razdeljene v 4 skupine, ki so bile sestavljene iz negativne kontrolne skupine in treh poskusnih skupin, ki so dobivale diazinon 20 mg/kg TM (P1), 40 mg/kg TT (P2) in 60 mg/kg TM (P3). Parametri, ki smo jih opazovali v tej raziskavi, so izražanje iNOS (Sintaza dušikovega oksida)v jetrih z imunohistokemijskim barvanjem, nato analizirano z enosmerno ANOVA, ki ji sledi Tukeyjev test (a=0,05), inledvicahistopatologijo, ki smo jo opazili z barvanjem s hematoksilin-eozinom in kvalitativno opisno analizirali. Rezultati so pokazali, da je oralno dajanje diazinona pomembno povečalo iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izraz (str<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">ledvičnaskorje, ki se je pokazala z vnetno celično infiltracijo, nekrotičnoledvicatubulnih celic in krvavitev v medtubulnem prostoru.

Ključne besede:Diazinon, organofosfat, iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje,ledvicahistopatologija.

Cistanche izboljšuje delovanje ledvic

1. Uvod

Menijo, da uporaba pesticidov povečuje proizvodnjo, zlasti kot preventiva proti škodljivcem in plevelom (Kusriani, 2012). Vendar pa lahko pogosta uporaba pesticidov povzroči, da so ti pesticidi strupeni za potrošnike, vključno z živalmi, tako pri vdihavanju, oralni uporabi in skozi kožo (Ameriana, 2006). Eden od pesticidov, ki se pogosto uporablja, je diazinon. Diazinon je organofosfatni pesticid, ki ima mehanizem zaviranja delovanja encima holinesteraze. Ti pesticidi imajo tudi manjši učinek na neciljne organizme in so bolj strupeni za vretenčarje v primerjavi z organoklorovi (Luthfanto, 2014). Običajno bodo pesticide v jetrih nevtralizirali hepatociti z razstrupljanjem, vendar so te spojine sposobne tvoriti tudi proste radikale zaradi poškodb celic. Izpostavljenost organofosfatom, ki se pojavlja nenehno, lahko povzroči poškodbe jeter kot organa, ki igra vlogo v procesu razstrupljanja (Ginting, 2014). Organofosfati, ki so bili presnovljeni v jetrih, lahko zavirajo encim AChE. Inhibicija tega encima neposredno povzroči zvišanje ravni acetilholina v živčnem in živčno-mišičnem sistemu. Povečanje AChE lahko povzroči, da ioni v celicah postanejo nestabilni in sprožijo nastanek reaktivnih kisikovih vrst (ROS) (Uchendu, 2012). Povečan ROS bo sprožil nastajanje vnetnih citokinov. Naik in Vishva (2011) navajata, da ROS vpliva na transkripcijo proinflamatornih citokinov, pri čemer bodo visokim nivojem ROS sledile visoke ravni proinflamatornih citokinov, prav tako pa bo, če zaviralci inhibirajo proizvodnjo ROS, to vplivalo na zmanjšanje proizvodnje proinflamatornih citokinov, kot so kot IL-6 in TNF. Povečana proizvodnja vnetnih citokinov bo povzročila iNOS (Sintaza dušikovega oksida)in tvorijo NO v prevelikih količinah (Aktan, 2004).

Theledvicaje glavni organ, ki vzdržuje ravnovesje ekstracelularne tekočine (ECF) z izvajanjem svojih funkcij pri izločanju in presnovi (Curthoys, 2014). Izločanje ali izločanje presnove ksenobiotikov poteka vledvica. Theledvicapoškodbe lahko zmanjšajo stopnjo izločanja kemikalij, ne da bi povečali toksičnost strupenih snovi (Gupta, 2012). Stanje oksidativnega stresa bo sprožilo proces peroksidacije lipidov z odvzemom vodikovih ionov iz vezi polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), da se tvori stabilnejša molekula. Proces pretrganja vezi na PUFA lahko povzroči nekrozo celic ali tkiv (Sharma et al., 2003).

Ta študija je bila izvedena za določitev toksičnega učinka diazinona na iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanja v histopatologiji jeter in ledvic podgan.

Sintaza dušikovega oksida vpliva na delovanje ledvic

2. Materiali in metode

2.1. Živalski modeli in načrtovanje eksperimentov

Dvajset podgan (Rattus norvegicus) smo razdelili v 4 skupine: negativna kontrolna skupina (zdrave podgane). Skupinam P1, P2 in P3 so 8 tednov peroralno dajali diazinon z uporabo napajalne sonde z odmerki 20 mg/kg TM, 40 mg/kg TT oziroma 60 mg/kg TM. Diazonium 600EC je bil mešan z destilirano vodo, dokler ni vseboval 5 mg diazonija v 1 ml (Baconi et al., 2013).

Podgane so bile aklimatizirane teden dni pred zdravljenjem. Vsi pogoji in ravnanje z živalmi je potekalo v skladu s protokolom, ki ga je odobril Odbor za etična dovoljenja univerze Brawijaya (št.: 732-KEP-UB).

2.2. Priprava in opazovanje histopatologije ledvic

Priprava naledvicahistopatologija je sestavljena iz naslednjih stopenj: fiksacija, dehidracija, čiščenje, vdelava, rezanje, lepljenje na steklene predmete po Muntiha (2001). Opažanja oledvicahistopatologijo smo izvedli z binokularnim svetlobnim mikroskopom s 100-kratno povečavo mikroskopa, nato do 400-kratno. Opazovanje je bilo opravljeno na ledvičnih glomerulih in ledvičnih tubulih.

2.3. Analiza izražanja iNOS (sintaze dušikovega oksida) v jetrih

iNOS (Sintaza dušikovega oksida)ekspresijo na jetrih smo analizirali z imunohistokemijskimi metodami z uporabo anti iNOS (Sintaza dušikovega oksida) kot primarno protitelo in anti-kunčji IgG, označen z biotinom, kot sekundarno protitelo. Meritev iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje na jetrih je bilo izvedeno s programsko opremo Immunoratio. Rezultate odstotnega območja izražanja iNOS smo kvantitativno analizirali z uporabo enosmernega testa analize variance (ANOVA) in jim sledili s Tukeyevim testom.

3. Rezultati in razprave

3.1. Analiza izražanja iNOS (sintaze dušikovega oksida) na jetrih

Za analizo izražanja iNOS (Sintaza dušikovega oksida)na jetrnih celicah smo opravili z imunohistokemijsko metodo. Izraz iNOS (Sintaza dušikovega oksida)lahko prikažemo kot izraz rjave barve na hepatocitih, kar lahko vidimo na sliki 1.

Slika 1. iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje na jetrih.

(1) Negativna kontrolna skupina (K-). (2)P1 (inducirano z diazinonom 20 mg/kg TM. (3) P2 (inducirano z diazinonom 40 mg/kg TM).

(4) P3 (induciran z diazinonom 60 mg/kg telesne mase. Beli krog prikazuje območje iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje.

Rezultat imunohistokemije je bil kvalitativno analiziran in je pokazal, da se intenzivnost rjave barve poveča (slika 1). Ta rezultat kaže na povečanje iNOS (Sintaza dušikovega oksida)stopnje izražanja v zdravljeni skupini v primerjavi s kontrolno skupino.

Za merjenje ravni iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje na hepatocitih uporablja programsko imunoreakcijo. Rezultati kvantitativne analize iNOS (Sintaza dušikovega oksida)ekspresijo v jetrih podgan lahko vidite v tabeli 1 in lahko sklepamo, da obstaja pomembna razlika (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Sintaza dušikovega oksida)Spolna ekspresija je bila 1,340 ±0,092 odstotka. V zdravljeni skupini 1 (P1), to je bila skupina, ki je bila inducirana z diazinon organofosfatom v odmerku 20 mg/kg telesne mase, je bila povprečna odstotna površina iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izraz je bil 4,184±1,041 odstotka. Zdravljena skupina 2 (P2) je bila skupina, inducirana z diazinon organofosfatom v odmerku 40 mg / kg telesne mase in povprečjem iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izraz je bil 7,496±0,997 odstotkov. Zdravljena skupina 3(P3) je bila skupina, inducirana z diazinon organofosfatom v odmerku 60 mg/kg telesne mase in povprečjem iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izraz je bil 11,604 ± 0.864.

Na negativni kontrolni skupini je pokazal iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izražanje v nizki intenzivnosti (1,340 ± 0,092 odstotka ). McNaughton et al. (2002) so ugotovili, da iNOS (Sintaza dušikovega oksida)je bila izražena v normalnih jetrnih acinusih. Širjenje iNOS (Sintaza dušikovega oksida)v normalnih jetrih kaže območje okoli portala z najmočnejšo izraženostjo, intenzivnost pa se zmanjša vzdolž jetrnih acinov. Po Kubesu (2000) iNOS (Sintaza dušikovega oksida)lahko zagotovi terapevtske učinke, če je reguliran v pravi količini in na pravem mestu, iNOS ima pozitivno vlogo, vključno s celjenjem kože in črevesne sluznice, bojem proti določenim bakterijam, potencialom pri regulaciji proliferacije celic T in diferenciacije ter regulaciji pridobivanja levkocitov .

Zdravljena skupina je pokazala znatno povečanje v odstotkih površine iNOS (Sintaza dušikovega oksida) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Povečanje ROS bo sprožilo nastajanje vnetnih citokinov. Reaktivne kisikove vrste vplivajo na transkripcijo provnetnih citokinov, kjer bodo visokim ravnem ROS sledile visoke ravni provnetnih citokinov, prav tako bo, če je proizvodnja ROS zavrta z zaviralci, vplivala tudi na zmanjšanje proizvodnje provnetnih citokinov, kot je IL{{0 }} in TNF (Naik in Vishva, 2012). Dunlop et al. (2014) in Pahan et al. (2000) so navedli, da imata TNF- in IL-1 vlogo pri povečanju izražanja iNOS (Sintaza dušikovega oksida)v tkivih z aktivacijo Nappar Kappa B(NF-kB), pri kateri NF-kB vstopi v jedro in se veže na promotorsko regijo iNOS (Sintaza dušikovega oksida). Povečana proizvodnja vnetnih citokinov bo povzročila iNOS (Sintaza dušikovega oksida)in tvorijo prevelike količineDušikov oksid(NE) (Aktan, 2004).

3.2. Analiza ledvične histopatologije

Rezultati te raziskave o vplivu toksičnosti diazinona naledvicahistopatološke značilnosti z barvanjem s hematoksilinom-eozinom (HE) so predstavljene na sliki 2. Histološka slika podganje ledvične skorje v (K-) skupini negativne kontrole je pokazala normalno stanje in ni bilo nobenih nepravilnosti. To dokazuje pojav ledvičnega korpusa, proksimalnih in distalnih konvulzivnih tubulov s plastjo kockastih epitelijskih celic (Slika 2(1)).

Histopatološka slika ledvične skorje podgan v skupini P1 je pokazala nenormalnosti, za katere je značilna prisotnost celic, ki so podvržene kariolizi in hipertrofiji. Za celice kariolize je bilo značilno izginotje celičnega jedra, medtem ko imajo epitelijske celice, ki so podvržene hipertrofiji, značilnosti povečane velikosti celic, tako da je struktura ledvičnih tubulov videti nepravilna. Na tej sliki so vidni eritrociti v medtubularnem prostoru, kar kaže na prisotnost krvavitve (Slika 2(2). Histopatološka slika v skupini P2 kaže nepravilnosti podobno kot v skupini P1. Nenormalnosti, ki jih lahko opazimo v ledvični skorji podgan P2 vključujejo pojav celic, ki so podvržene kariolizi, hipertrofijo celic in krvavitve.Poleg tega strukturaledvicatubulih se zdi nepravilen v primerjavi s skupino K (slika 2(3)). Histopatološka slika ledvične skorje podgan v skupini P3 je pokazala nenormalnosti, kot jih vidimo na histopatološki sliki ledvične skorje pri podganah P1 in P2, za katere je značilen pojav hipertrofije celic, kariolize in eritrocitov v medtubularnem prostoru (krvavitev ). Prav tako je mogoče opaziti prisotnost vnetne celične infiltracije v tkivih (slika 2(4)).

Diazinon organofosfat, ki so ga podgane dajale peroralno, bo prebavil prebavni trakt, nato pa ga bo absorbiralo črevo, zlasti dvanajstnik. Presnova organofosfatov v glavnem poteka v jetrih, v manjši meri pa tudi v dlani in črevesju. Organofosfat bo podvržen presnovi faze 1, ki je proces oksidacije, kjer se organofosfat s pomočjo encimov citokroma (CYP) razgradi na okson-organofosfatne presnovke in proste žveplove ione (Gupta, 2009; Elersek in Metka 2011). Okson-organofosfatni metabolit nato vstopi v krvni obtok in gre v jetra za nadaljnjo presnovo. V jetrih se okson-organofosfatni presnovki hidrolizirajo s pomočjo encimov karboksilesteraze (CE) in paraoksonaze ​​(PON), razcepijo se v dialkilfosfat in zapustijo skupino. Dialkilfosfatazo bodo nato katalizirali encimi v presnovi faze 2, ki bodo proizvedli molekule, ki so hidrofilne in se lahko izločijo z urinom, medtem ko zapustijo skupine (v obliki dietila), ki lahko povzročijo oksidativni stres v telesu. Dietil je zelo reaktivna molekula in lahko reagira s skupinami hidroksilnih radikalov (-OH) in tvori nove proste radikale (Elersek in Metka, 2011). Velikega števila prostih radikalov v telesu endogeni antioksidanti ne morejo nevtralizirati, kar povzroči neravnovesje med prostimi radikali in antioksidanti, ki povzroči oksidativno škodo (Caramori in Papi, 2004). Do te oksidativne poškodbe pride, ker dietil-hidroksil kot prosti radikal iz organofosfatnega diazinona lahko proizvede velike količine ROS (Uchendu et al., 2012). Naraščajoča ROS bo nato povzročila stanja oksidativnega stresa in sprožila proces peroksidacije lipidov z odvzemom vodikovih ionov iz polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) za tvorbo stabilnejših molekul. Proces pretrganja vezi PUFA lahko povzroči nekrozo celic ali tkiv (Sharma et al., 2003).

Nenormalnosti so se pojavile vledvicatubularni epitelij zaradi neposrednega stika epitelija s toksično snovjo diazinona in vledvicatubula, pride do procesa reabsorpcije in povečanja v procesu tvorbe urina (Mescher, 2010). Toksična snov diazinon, ki je še vedno v krvnih žilah, bo v neposrednem stiku z endotelijem in tako povzročila motnje v prepustnosti žilne membrane. Krvavitev v medtubularnem prostoru je nastala zaradi motenj prepustnosti membrane krvnih žil (peritubularnih kapilar), tako da lahko eritrociti vstopijo v tkivo (Djumadi et al., 2008). Poškodba endotelijskih celic sproži vnetne reakcije, ki povzročijo kopičenje makrofagov in trombocitov zunaj in znotraj arterij. Pojav infiltracije vnetnih celic v poškodovanem tkivu kaže, da metaboliti diazinona povzročajo toksičnost zaledvica(Khudair et al., 2017).

Na podlagi rezultatov histopatološkega videza je ledvična skorja v zdravljeni skupini imela nenormalnosti v primerjavi s skupino K. Znano je, da je skupina P1 z najnižjim odmerkom 20 mg/kg telesne mase pokazala poškodboledvicatubularnih celic v primerjavi s K-skupino.

Cistanche izboljša delovanje ledvic

4. Sklep

Dajanje diazinona z najnižjim odmerkom 20 mg/kg telesne mase je imelo toksičen učinek pri podganah, kar je razvidno iz znatnega povečanja iNOS (Sintaza dušikovega oksida)izraz (str<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Reference

[1] Aktan, F 2004 iNOS (Sintaza dušikovega oksida)-Posredovana proizvodnja dušikovega oksida in njena regulacija. Znanosti o življenju, 75: 639-653.

[2] Ameriana, M. 2006. Perilaku Petani Sayuran dalam Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CG in EHJohn.1997.Fisiologi Kedokteran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana in NL Rahmah. 2012. Moč Sargassuma je podvojila izvlečke Bory pri terapiji bolezni vnetnih črevesnih ekstraktov pri Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6:144-154.

[5] Caramori, G. in A. Papi. 2004. Antioksidanti pri zastrupitvi z organofosfornimi spojinami. IntJ Pharm Bio Sci, 59 (2): 170-173.

[6] Cox, C.2000. Diazinon: Toxicology. Journal of Pesticide Reform/ Summer 20(2).

[7] Curthoys, NP in WM Orson. 2014. Funkcija proksimalnih tubulov in odziv na acidozo. Ameriško združenje za nefrologijo. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 9:1627-1638

[8] Djumadi, H., in H. Sugiyono.2008. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon in Kurkumin Kunyit (Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus).Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol.9(1):62-83.

[9] Dunlop, K., G. Kiranjot, K. Crystal, I. Julijana, D. Rupinder, D. Jean-Francois, ACKim, J. Amish, PJ McNamara in PJ Robert. 2014. Terapevtska hiperkapnija preprečuje sistolično disfunkcijo desnega prekata, ki jo povzroča vdihani dušikov oksid pri mladih podganah. Elsevier Inc. Biologija in medicina prostih radikalov 9: 35-49.

[10] Elersek, T. in F. Metka. 2011. Pesticidi: vplivi izpostavljenosti pesticidom. InTech Europe. Rijeka.

[11] Frazier, SK, CSJohn, CH Gordon, B. Graham, B. Roger, N. Shinji, N. Akiyoshi, D. Beate in B. Axel. 2012. Proliferativne in neproliferativne lezije urinarnega sistema podgan in miši. Toksikološka patologija, 40:14S-86S

[12] Georgievskii, V.1., BNAnnenkov in VTSamokhin. 2013. Materialna prehrana živali: študije kmetijskih in živilskih znanosti. Butterworths & Co. (Publishers) Ltd London. 160-161.

[13] Gupta, RC2012. Veterinary Toxicology Second Edition. Elsevier inc. Waltham. ZDA.

[14]Hubrecht, R. in J. Kirkwood. 2010. UFAW: Priročnik o oskrbi in upravljanju laboratorijskih in drugih raziskovalnih živali. Zveza univerz za dobro počutje živali. Združeno kraljestvo.

[15] Khudair, ZW, ASHanan in KE Manal. 2017. Histopatološke spremembe, ki so nastale v notranjih organih bele podgane po izpostavljenosti diazinonu.Bas..Vet.Res. 1 (2)

[16] Kubes, P.2000. Inducibilna sintaza dušikovega oksida: malo dobrega v vseh nas. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24. julij 2019].

[17] McNaughton, L., P. Lakshmi, AMMaria, K. Norm, M. Irvin, M. Redwan, H. Outayba in WR Marek. 2002. Porazdelitev sintaze dušikovega oksida v normalnih in cirotičnih človeških jetrih. Proceedings of the National Academy of Science Vol.99, št.26 17161-17166.

[18] Mescher, AL2010. Junqueira's Basic Histology: Text & Atlas 12 Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. Združene države Amerike.

[19] Mishra, BP 2013. Antioksidativni status in oksidativni stres pri zastrupitvi z organofosfatnimi pesticidi.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Zvezek 7, številka 6 (maj.-junij 2013), PP 20-24