Policistična bolezen ledvic

ali.ma@wecistanche.com

Del Ⅱ: Ledvični organoidi, pridobljeni iz eritroidnih matičnih celic bolnikov z avtosomno dominantno policistično boleznijo ledvic

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice in drugi.

Ozadje:Ledvicaorganoidi so bili na splošno pridobljeni iz komercialno dostopnih induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC); vendar je bil velik izziv učinkovito izdelati modele ledvičnih organoidov pri bolnikih z avtosomno dominantno policističnoledvicabolezni (ADPKD), ki povzemajo embriogenezo in mehanizme cistogeneze.

Kliknite za stranske učinke cistanche in koristi za ledvice

Metode: Krvni eritroidni progenitorji (EP) iz dveh ADPKD (avtosomno dominantna policističnaledvicabolniki in en zdrav darovalec (HC) so bili uporabljeni kot primerjalna kontrola za normalizacijo številnih tehničnih korakov za reprogramiranje EP in za generiranje organoidov. EP je reprogramiral episomalni vektor v iPSC (inducirane pluripotentne matične celice), ki so bili diferencirani v ledvične tubularne organoide in nato stimulirani s forskolinom, da so povzročili nastanek cist.

Rezultati: iPSC (inducirane pluripotentne matične celice), pridobljene iz EP, so pokazale vse značilnosti pluripotentnosti in so se lahko diferencirale v vse tri zarodne plasti. 3D cevasti organoidi so bili ustvarjeni iz posameznih celic po 28 dneh v Matrigelu. HC in ADPKD (avtosomno dominantna policističnaledvicabolezen) organoidi niso spontano tvorili cist, vendar so po stimulaciji s forskolinom opazili cistam podobne strukture pri ADPKD (avtosomno dominantni policističniledvicabolezen) organoidi, vendar ne v organoidih, pridobljenih iz HC.

Zaključek: Ugotovitve te študije so pokazale, daledvicaorganoidi so bili uspešno pridobljeni iz krvnih EP celic ADPKD (avtosomno prevladujoče policističneledvicabolezni) bolnike in zdravega kontrolnega darovalca. Ta pristop bi moral prispevati kot močno orodje za zarodekledvicarazvojni model, ki lahko povzame zelo zgodnje patofiziološke mehanizme, vključene v citogenezo.

KLIKNITE TUKAJ ZA DELⅠ

Diskusija

V tej študiji smo podrobno opisali postopek za ustvarjanje ledvičnih organoidov iz človeških iPSC (induciranih pluripotentnih matičnih celic), pridobljenih iz krvnih eritroidnih matičnih celic bolnikov z ADPKD (avtosomno dominantna policistična bolezen ledvic). Veliko vrst somatskih celic je bilo uspešno reprogramiranih v iPSC (inducirane pluripotentne matične celice), vključno s krvnimi celicami [Z]. Tukaj smo se odločili za uporabo krvnih eritroidnih prednikov kot izhodiščnega tipa celic zaradi številnih razlogov, kot so njihova genomska celovitost, epigenetski spomin in učinkovito reprogramiranje [11,17,18]. Učinkovitost, s katero so bili eritroidni predniki pretvorjeni v iPSC, je bila kar dva reda velikosti boljša (7 odstotkov -28 odstotkov ) kot učinkovitost diferenciranih vrst krvnih celic (0.0 2 odstotka -0.60 odstotka )ali fibroblasti (0,74 odstotka )[Z]. Kljub majhni številčnosti teh celic v periferni krvi jih je mogoče enostavno izolirati in razširiti in vitro, da proizvedejo zadostno število za reprogramiranje. Eden najpomembnejših izzivov pri vzpostavljanju ustreznih iPSC je njihova genotipska in fenotipska variabilnost [6], vendar je predlaganih nekaj tehničnih strategij za izogibanje ali zmanjšanje takšne variabilnosti. V pričujočih poskusih smo za reprogramiranje uporabili neintegrirajoči episomalni sistem, ki ne zahteva integracije genoma za izražanje genov za reprogramiranje [10], kar omogoča manjšo imunogenost in ustvarja genetsko bolj stabilne celice [19,20]. Poleg tega so bili vsi vzorci pridobljeni iz istega vira, kar pomaga zmanjšati epigenetsko variabilnost [12] ob predpostavki, da lahko diferenciacija začetne celice vpliva na učinkovitost končnih rezultatov. Analizo označevalcev pluripotentnosti in sposobnost iPSC (induciranih pluripotentnih matičnih celic), da se diferencirajo v vse tri zarodne plasti, so primerjali vzporedno in jih primerjali tudi z embrionalno celično linijo H9, ki je bila uporabljena kot pozitivna kontrola . Vse te primerjave niso pokazale pomembnih razlik med bolniki z ADPKD (avtosomno dominantno policistično boleznijo ledvic), HC in celicami H9.

Razvitih je bilo več protokolov za indukcijo diferenciacije iPSC (induciranih pluripotentnih matičnih celic) v ledvične organoide [13,21]. Na podlagi protokolov, ki so jih opisali Cruz et al. [6] smo pridobili strukture z značilnostmi proksimalnih tubulov, vključno z izražanjem NHE3 in AOP1. Poleg tega so organoidi izražali NPHS2, kar kaže na prisotnost celic, podobnih podocitom.

Nasprotno pa AQP2 ni bil izražen v teh cevastih organoidih. Ta ugotovitev se ujema s prejšnjimi študijami, ki kažejo na več omejitev pri razvoju struktur, pridobljenih iz popka sečevodov (UB) in vitro, pri čemer razvoj UB zahteva posebne protokole, saj je časovno okno za dodajanje specifičnega induktorja zelo omejeno [ 6,22,23].

V procesu generiranja ledvičnih organoidov iz iPSC (induciranih pluripotentnih matičnih celic) je vsa ledvična embriogeneza povzeta in vitro, kar na začetku vključuje tvorbo kavitiranih sferoidov iz posameznih celic [14]. Dejansko smo ugotovili, da so nediferencirane iPSCss (inducirane pluripotentne matične celice) bolnikov z ADPKD (avtosomno dominantno policistično boleznijo ledvic) in zdrave kontrole oblikovale epiblastu podobne sferoidne strukture, ki so bile morfološko podobne. Čeprav sekvenciranje DNK genov PKD1 in PKD2 v tej študiji ni bilo izvedeno, trenutne ugotovitve kažejo, da vrsta mutacije, ki so jo prenašali bolniki, ni vplivala na tipično morfogenezo epiblasta. Še vedno so potrebne nadaljnje študije za pravilnejšo oceno izražanja ključnih molekul, vključenih v to fazo embrionalnega razvoja.

V skladu s protokolom, ki so ga razvili Freedman et al. [14] smo opazili, da so se sferoidi diferencirali v tubularne organoide 26 dni po indukciji diferenciacije, čas pa je bil podoben tako pri bolnikih z ADPKD (avtosomno dominantno policistično boleznijo ledvic) kot pri HC (slika ③). Kljub temu smo opazili nekaj variabilnosti glede časovnega razporeda izražanja in ravni markerjev diferenciacije. Po drugi strani pa je bila morfologija tubularnih struktur podobna in primerljiva med vzorci bolnikov z ADPKD in HC. Nasprotno pa je skupina Cruz et al z uporabo iPSC (induciranih pluripotentnih matičnih celic), pridobljenih iz ledvičnih biopsij bolnikov z ADPKD (avtosomno dominantno policistično boleznijo ledvic), ugotovila večjo variabilnost v sposobnosti teh celic za tvorbo organoidov [6]. Poleg velike raznolikosti mutacij, ki so značilne za to bolezen, je mogoče te razlike v učinkovitosti pridobivanja organoidov razložiti tudi s heterogenimi vrstami celic, prisotnimi v vzorcih biopsije, v nasprotju z eritroidnimi matičnimi celicami, ki predstavljajo bolj homogeno celično populacijo. Ti rezultati skupaj kažejo, da lahko kljub variabilnosti in razlikam v učinkovitosti različnih klonov iPSC za tvorbo ledvičnih organoidov pridobivanje slednjih od bolnikov z ADPKD (avtosomno dominantno policistično boleznijo ledvic) predstavlja edinstven model za proučevanje več oblik fenotipskih manifestacij te bolezni. Poleg tega je pomembno opozoriti, da če obstaja precejšnja variabilnost mutacij v populaciji, prizadeti z ADPKD, so za pacienta specifične iPSC (inducirane pluripotentne matične celice), ki so popolnoma imunsko združljive, lahko uporabljene za posamezne regenerativne terapije v prihodnosti. , poleg tega, da omogoča razvoj in vitro modela za preverjanje, ali so zelo zgodnje fenotipske manifestacije tako raznolike kot klinična slika.

Nestimulirani organoidi, pridobljeni iz bolnikov z HCor ADPKD (avtosomno dominantno policistično ledvično boleznijo), niso spontano tvorili cist. Tipične morfologije cist in izražanja markerjev cistogeneze ni bilo mogoče zaznati v nobenem vzorcu, kar je celo podaljšalo organoidno diferenciacijo v kulturi do zaključka 35 dni. Dokazano je bilo, da sama celična proliferacija ne povzroči cist[24]. Poleg tega je za pospešitev nastajanja in rasti cist in vivo potreben tretji neodvisen dogodek (znan kot tretji zadetek) [23]. Nasprotno pa se je tvorba ciste, ki jo povzroča forskolin, res pojavila v organoidih bolnikov z ADPKD, ne pa tudi pri bolnikih s HC. Opozoriti je treba, da so bile ciste, čeprav prisotne, opažene v nizkem odstotku v vzorcih ADPKD tudi v prisotnosti forskolina, kot so opazili tudi Freedman et al. [14] v organoidih, ki nastanejo iz modela CRISPR/Cas9 bolezni ADPKD. Nekaj ​​hipotez je mogoče postaviti, da bi razložili nizko pogostost cist v tem modelu. 1) Organoidi, gojeni v 3D suspenzijskem okolju, so pokazali veliko večjo učinkovitost cistogeneze v primerjavi z adherentnimi organoidi [6], kar kaže, da je mikrookolje neposredno vpleteno v cistogenezo. 2) Eksperimentalni protokol, uporabljen v tej študiji, je oblikoval organoide proksimalnih tubulov, ne pa tudi distalni deli nefrona [23]. Čeprav lahko vsi segmenti nefrona izvirajo iz cist, vključno s proksimalnimi tubuli [25], se očitno zdi, da so tisti, ki izhajajo iz zbiralnih kanalov, večji in v večjem številu kot tisti iz drugih segmentov [26], 3) Nazadnje je bilo nedavno dokazano, da je izvor cist je lahko povezana s prisotnostjo več mutacij PKD1, ki določajo resnost bolezni in da je bila tvorba ciste v zbiralnih kanalih povezana z resnostjo bolezni [27, 28].

Skratka, sedanje ugotovitve so pokazale, da je mogoče ustvariti organoide s tridimenzionalnimi strukturami, podobnimi arhitekturi prednikov ledvic, z uporabo iPSC (induciranih pluripotentnih matičnih celic), reprogramiranih iz eritroidnih prednikov, ki jih je bilo enostavno izolirati iz ADPKD (avtosomno dominantna policistična bolezen ledvic). bolnikov in da so ti organoidi sposobni tvoriti ciste pod stimulacijo forskolina. Ta obetavna metodologija razkriva metodo za izboljšanje razumevanja zelo zgodnjih genetskih, fenotipskih in fizioloških korakov pri nastanku ciste pri ADPKD (avtosomno dominantna policistična bolezen ledvic).

Reference

1. Chebib FT, Torres VE: Avtosomno dominantna policistična ledvična bolezen: osnovni učni načrt 2016. AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:26530876

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatska mutacija v posameznih jetrnih cistah podpira model cistogeneze z dvema zadetkoma pri avtosomno dominantni policistični bolezni ledvic. Mol Cell, 2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Somatske mutacije PKD2 v posameznih ledvičnih in jetrnih cistah podpirajo model cistogeneze z dvema udarcema pri avtosomno dominantni policistični ledvični bolezni tipa 2.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: kritična razvojna sprememba opredeljuje kinetiko nastajanja ledvične ciste po izgubi Pkd1. Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: Poškodba ledvic je tretji udarec, ki spodbuja hiter razvoj policistične bolezni ledvic pri odraslih. Hum Mol Genet, 18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: Organoidna cistogeneza razkriva kritično vlogo mikrookolja pri človeški policistični bolezni ledvic. Nat Mater, 16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Indukcija pluripotentnih matičnih celic iz kultur fibroblastov. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al: Zmanjšan ciliarni policistin-2 v induciranih pluripotentnih izvornih celicah bolnikov s policistično boleznijo ledvic z mutacijami PKD1. J Am Soc Nephrol, 24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Izpeljava transgensko povzročenih pluripotentnih matičnih celic iz ene same kapljice krvi. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Človeško inducirane pluripotentne izvorne celice brez vektorskih in transgenskih sekvenc. Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID: 19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Stopnja diferenciacije določa potencial hematopoetskih celic za reprogramiranje v inducirane pluripotentne izvorne celice. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Učinkovita izpeljava človeških iPS celic z neintegrirajočim plazmidom iz krvnih celic z edinstvenimi epigenetskimi in genskimi ekspresijskimi podpisi. Cel/Res, 21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Pluripotentni organoidi ledvic, pridobljeni iz matičnih celic: in vivo podobna in vitro tehnologija. Eur J Pharmacol, 790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Modeliranje ledvične bolezni s CRISPR-mutantnimi ledvičnimi organoidi, pridobljenimi iz človeških pluripotentnih epiblastnih sferoidov. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Enotna merila za ultrazvočno diagnozo ADPKD (avtosomno dominantna policistična bolezen ledvic). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: Zaviralec ROCK omogoča preživetje disociiranih človeških embrionalnih izvornih celic. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Jedrsko reprogramiranje in pluripotentnost. Nature, 441: 1061-1067, 2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Visoko učinkovit sistem za ustvarjanje in študij pluripotentnih izvornih celic, ki jih povzroči človek. Cel/ matične celice. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420