HPLC prstni odtis in razmerje med spektrom in protitumorskim učinkom za razlikovanje med Mylabris Phalerata Pallas in Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Fakulteta za farmacijo, Zunyi Medical University, Zunyi, Kitajska,

2 Ključni laboratorij za osnovno farmakologijo Ministrstva za izobraževanje in Skupni mednarodni raziskovalni laboratorij za etnomedicino Ministrstva za izobraževanje, Medicinska univerza Zunyi, Zunyi, Guizhou, Kitajska.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, Kitajska, 4Guizhou Provincial College Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi, Kitajska.

Kliknite tukaj za več informacij o zdravilu Cistanche proti tumorju

Poudarki

Ta študija zagotavlja uporabno, verodostojno in učinkovitejšo metodo HPLC za razlikovanje dveh vrst Mylabris. In HPLC prstni odtis in spekter-protitumorski učinkiintegrirali in našli tri pomembne diferencialne markerje za nov marker Mylabris.

Povzetek

Cilj: Vrednotenje diskriminacije med dvema vrstama Mylabris na podlagi prstnih odtisov HPLC in spektraprotitumorski učinekodnos. Metode: V tej študiji je preprosta in učinkovita metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), ki vključuje kemometrično analizo in spektralnoprotitumorski učinekrazmerje je bilo razvito za razlikovanje med dvema vrstama Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) in Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Rezultati: V analizi prstnih odtisov je bilo izbranih 14 značilnih vrhov za oceno razlik med MP in MC z analizo podobnosti in prepoznavanja vzorcev z uporabo PCA in OPLS-DA. Kromatogrami HPLC vzorcev iz 10 regij Kitajske so pokazali razlike med MP in MC, našli pa so tudi 7 značilnih kemičnih markerjev. V spektru-protitumorski učinekanalizo razmerja so 4 označevalci aktivnosti igrali ključno vlogo pri zniževanju IC50 in so lahko protitumorske komponente zdravila Mylabris po sivi relacijski analizi in multivariatni linearni regresijski analizi. Kemometrična analiza v kombinaciji z rezultati razmerja spekter-učinek je pokazala, da so bili vrhovi 2 (citozin), 4 (neznano) in 14 (neznano) pomembni diferencialni markerji za razlikovanje dveh vrst Mylabrisa.

Zaključek: Metoda je uporabna, verodostojna in učinkovitejša za razlikovanje MP in MC ter bo ponudila nov način za olajšanje nadzora kakovosti zdravil proti insektom.

Ključne besede: HPLC, prstni odtis, spekter-protitumorski učinek, Mylabris, Diskriminacija

Ozadje

Mylabris, na Kitajskem imenovan ban mao, se uporablja kot tradicionalna kitajska medicina (TCM) za zdravljenje furunkel, globoko zakoreninjenih razjed, trebušne mase in je pomembenprotitumorskiagent. Poleg tega se v Evropi pogosto uporablja kot ljudsko zdravilo [1]. Glavna aktivna sestavina Mylabrisa je kantaridin, ki je učinkovitprotitumorskispojina [2]. Sodobne farmakološke študije so pokazale, da ima Mylabris več aktivnosti in je zelo cenjen pri zdravljenju tumorjev zaradi svoje dvojneproti rakulastnosti in sposobnost povečanja števila levkocitov [3-4]. Trenutno se Mylabris pogosto uporablja v nekaterih kliničnih receptih TCM proti raku na Kitajskem, kot sta injekcija Aidi in kapsula Compound ban mao.

Po Farmakopeji Ljudske republike Kitajske (različica 2015) je Mylabris opredeljen kot posušeno telo Mylabris phalerata Pallas (MP) in Mylabris cichorii Linnaeus (MC), ki se razlikujeta po svojih botaničnih značilnostih, populacijski dinamiki in ekologiji [ 5-6]. Mylabris je tudi zelo strupeno zdravilo. Ker so zdravila, ki so na voljo na Kitajskem, običajno mešanica MP in MC, je treba ugotoviti razlike v kemiji in aktivnosti med obema vrstama.

Ker TCM vsebujejo številne znane in neznane sestavine, predstavlja kvantitativna analiza profila njihovih kemičnih sestavin velik izziv. Odvzem prstnih odtisov s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) igra pomembno vlogo pri nadzoru kakovosti (QC) TCM zaradi splošnih značilnosti profila večine spojin v kompleksnem sistemu. Poleg tega ima analiza prstnih odtisov TCM dobro ponovljivost in stabilnost za avtentikacijo vrst in vrednotenje kakovosti ter jo sprejemajo Svetovna zdravstvena organizacija, Državna uprava za hrano in zdravila Kitajske (SFDA) in Evropska agencija za vrednotenje zdravil (EMEA). Pred kratkim je bila za QC razvita kemometrična analiza, ki združuje HPLC prstne odtise in razlikuje različne kompleksne naravne vire [7]. Vendar pa je neučinkovito razlikovati med razlikami v TKM, saj ne more odražati razlik v aktivnih sestavinah, kar je bolj pomembno za klinično uporabo. Doslej je spekter-protitumorski učinekZa uspešno identifikacijo bioaktivnih sestavin TKM so bili uporabljeni pristopi medsebojnega odnosa [8]. Odvzem prstnih odtisov HPLC v kombinaciji s kemometrično analizo in razmerjem med spektrom in protitumorskim učinkom bo bolje razjasnil razliko med več viri TCM.

Pred kratkim so poročali o nekaterih metodah za določanje vsebnosti kantaridina, ki jih je mogoče uporabiti za določanje kakovosti Mylabrisa [9]. Nekateri kromatografski prstni odtisi so bili uporabljeni tudi za QC [10-11]. Samo ena študija je uporabila metodo, ki vključuje gradientno elucijo vodotopnih spojin zdravila Mylabris na podlagi HPLC. Medtem je bilo uporabljenih le deset vzorcev in nobenega vzorca MC [12]. Kolikor nam je znano, razlikovanje MP in MC na podlagi kemične sestave in aktivnosti še ni bilo raziskano.

Namen te študije je bil razviti preprosto in učinkovito metodo za razlikovanje dveh vrst Mylabrisa z uporabo prstnih odtisov HPLC v kombinaciji s kemometrično analizo in spektralnimprotitumorskiučinekodnos, ki bo zagotovil podlago za QC Mylabrisa. To metodo bi lahko uporabili tudi za identifikacijo markerja QC drugih TCM.

Materiali in metode

Skupaj je bilo iz različnih provinc Kitajske zbranih 20 serij Mylabris phalerata Pallas (MP) in Mylabris cichorii Linnaeus (MC) (tabela 1), ki jih je identificiral naš prof. Xiao-Fei Li. Vzorci vavčerjev so bili deponirani v naših laboratorijih.

Referenčni standardni citozin, uridin, gvanozin in adenozin so bili kupljeni pri ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). Acetonitril in metanol kakovosti HPLC sta bila kupljena pri Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, ZDA). V celotni študiji je bila uporabljena Watsonova čista voda. Druge kemikalije in topila so bile analitske kakovosti in pridobljene iz Aladdin Reagent (Šanghaj, Kitajska), Chengdu Kelong Reagent (Chengdu, Kitajska) in Sinopharm Chemical Reagent (Peking, Kitajska).

Aparatura in kromatografski pogoji

Analiza HPLC je bila izvedena s sistemom HPLC Agilent 1260 Infinity pri 30 stopinjah na napravi Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) za prstne odtise. Za ločevanje smo uporabili linearno gradientno elucijo z eluentoma A (voda/ledocetna kislina, 100:1, v/v) in B (metanol). Gradientni program je bil razvit na naslednji način: 0-1 min, 3.0-4.6 odstotkov B; 1-9 min, 4.6-6.8 odstotkov B; 9-25 min, 6.8-51.0 odstotkov B; 25-30 min, 51.0-100 odstotkov. Hitrost pretoka mobilne faze je bila 1,0 ml/min. Kromatogram smo spremljali pri 254 nm. Po 15-minutnem obdobju uravnoteženja smo za injiciranje uporabili 10 μL vzorcev.

Priprava vzorca

Posušene vzorce smo zdrobili v prah in 2,5 g vsakega vzorca v prah dvakrat ekstrahirali s 50 mL 75-odstotnega etanola z refluksom vsakič 1,5 ure. Ekstrahiran vzorec smo zmešali in koncentrirali pod znižanim tlakom na 20 ml. Zmes smo nato oborili z 80 mL vode 24 ur pri 4 stopinjah. Nato smo ekstrakt centrifugirali pri 3000 g min-1 10 minut, da smo ločili supernatant. Supernatant smo koncentrirali pri znižanem tlaku na 25 ml. Na koncu smo supernatant pred analizo HPLC filtrirali skozi 0,22 μm Millipore film.

Validacija metodologije

Metoda HPLC je bila potrjena glede natančnosti, ponovljivosti in stabilnosti (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Validacija je bila ocenjena na podlagi retencijskega časa (RT) in površine vrha (PA). Končno so bili določeni kemični prstni odtisi 20 serij Mylabrisa za identifikacijo integriranih kemičnih značilnosti več spojin. Nekatere kemometrične tehnike so bile uvedene na kemičnem prstnem odtisu za analizo.

Analiza prepoznavanja vzorcev

Razlike med dvema vrstama površin vrhov so bile ovrednotene glede statistične pomembnosti z uporabo neparnega Studentovega t-testa. P-vrednost, manjša od 0.05, je veljala za statistično pomembno. Kot klasična nenadzorovana metoda se analiza glavnih komponent (PCA) široko uporablja za statistično analizo podatkov. Namesto uporabe številnih spremenljivk PCA uporabi majhno število osebnih računalnikov, ne da bi pri tem izgubil veliko informacij, nato pa se vizualizirajo grafovi rezultatov za prosto ločevanje opazovanj. V tej študiji je bil PCA izveden na normaliziranih površinah vrhov vsake komponente v prstnih odtisih HPLC z uporabo programske opreme SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Švedska), da bi ugotovili diskriminacijo med obema vrstama Mylabris.

Za bolj prednostno razlikovanje med dvema vrstama Mylabris je bila uporabljena nadzorovana metoda pravokotne delne diskriminantne analize najmanjših kvadratov (OPLS-DA) za analizo razlik v normaliziranih površinah vrhov vsake komponente v prstnih odtisih HPLC. Vrednost VIP je utežena vsota kvadratov uteži OPLS, ki odraža relativni prispevek vsake spremenljivke X k modelu. Šteje se, da so spremenljivke z VIP > 1 skupaj s S-grafom vplivne za ločevanje vzorcev v grafih rezultatov, ustvarjenih z analizo OPLS-DA. Nato so bili pridobljeni značilni kemični markerji za razlikovanje.

Analiza razmerja spekter-protitumorski učinek

Za raziskovanjeprotitumorskiobmočje vrha učinka za vzorce Mylabris, integrirane s podatki o prstnih odtisih, in primerjajte razlike med obema vrstama, korelacijo med vrhom prstnih odtisov inproti-tumoručinke so preučevali. SPSS19.0 (IBM, ZDA) in GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Kitajska) sta uporabili dve metodi, ki združujeta sivo relacijsko analizo in multivariatno linearno regresijsko analizo (MLRA). Theproti-tumorje bil test izveden z našimi objavljenimi metodami [12], celice celične linije hepatocelularnega karcinoma človeka HepG2 smo vzdrževali v mediju RPMI1640, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma. Celice smo gojili v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2 pri 37 C. Metoda SRB je bila uporabljena za oceno proliferacije zaproti-tumordejavnosti, nato je bil izračunan IC50 celic HepG2, končno pa so bili IC50 in normalizirana območja vrhov uporabljeni za kemometrično analizo. Nato so bili pridobljeni značilni označevalci aktivnosti Mylabrisa.

Rezultati in razprava

Optimizacija pogojev izvlečka

Za zadostno ekstrakcijo vodno raztopljenih spojin iz Mylabrisa je bil sistem ekstrakcije optimiziran. Ultrazvok in refluksiranje sta pokazala, da je mogoče te spojine optimalno ekstrahirati z refluksiranjem.

Optimizacija metode HPLC

Za pridobitev maksimalnih kromatografskih vrhov za opis splošne značilnosti zelišča so raziskali sestavo kromatografske kolone, mobilne faze in detekcijske valovne dolžine (200, 254, 265 in 278 nm). Rezultati so pokazali, da so bili kolona Phenimenex Synergy Polar-RP80, voda (ki vsebuje 1 odstotek ledocetne kisline) in metanol ter 254 nm najboljši pogoji za analizo Mylabris HPLC (slika 1), struktura 4 standardnih substanc je prikazana na sliki 2 .

Validacija metode

V tej študiji je bilo 14 vrhov dobro ločenih in uporabljenih kot "skupni vrhovi". Natančnost, ponovljivost in stabilnost so temeljile na retenzijskem času (RT) in površini vrha (PA). Vrednosti RSD RT in PA za natančnost (n=6) niso presegle 0.2 oziroma 4 odstotkov; Vrednosti RSD RA in PA za ponovljivost (n=6) so bile pod 0.2 oziroma 4 odstotki, vrednosti RSD za stabilnost (0-24 h) pa manj kot { {10}}.4 oziroma 5 odstotkov, kar je pokazalo, da so bili vzorci stabilni v 24 urah. Ti rezultati so pokazali, da sta bila kakovost proučevanih vzorcev in metode HPLC stabilna in dobro nadzorovana.

Ocena podobnosti prstnih odtisov

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 razen vzorcev MC (iz Guizhou2 in Guizhou4), katerih podobnosti so bile 0.888 oziroma 0.887. Ti podatki so pokazali, da je bila kakovost Mylabrisa znotraj ene vrste stabilna. Vendar so bile podobnosti samo treh vzorcev MP v primerjavi z referenčnim prstnim odtisom HPLC > 0.930; in podobnosti samo dveh vzorcev MC v primerjavi z referenčnim prstnim odtisom HPLC so bile > 0,921. Ti rezultati so pokazali, da sta se dve vrsti Mylabris precej razlikovali na nekaterih vrhovih.

Diskriminacija MP in MC z analizo razpoznave vzorcev

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>Kot je prikazano na sliki 1, so lahko vrhovi 1, 2, 4, 7, 9, 12 in 14 najpomembnejše spremenljivke pri razlikovanju med obema vrstama (slika 6). Skupina vrhov (1, 2, 4, 7, 9, 12 in 14) lahko igra ključno vlogo pri razlikovanju med MP in MC kot značilnimi kemičnimi markerji.

Razmerje spekter-učinek s sivo relacijsko analizo

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Razmerje spekter-učinek z MLRA

Model MLRA je najpogostejša metoda modeliranja za izpeljavo kompleksnosti odnosa med dvema ali več spremenljivkami in odzivom, ki je bil zgrajen z naslednjo formulo

kjer je Y ocenjena vrednost in predstavlja odziv; Xn je neodvisna spremenljivka, b{{0}} je presek in bn je regresijski koeficient za Xn. V tej študiji je bil MLRA uporabljen za določitev razmerja med prstnim odtisom in učinkovitostjo med vrednostmi površin vrhov v prstnih odtisih HPLC in IC50 anti-HepG2, nato pa so našli možne protitumorske komponente. Združevanje podatkov je bilo ugotovljeno s skupnim modelom MLRA, ki ni primeren za raziskovanje korelacije med Y (IC50) in X (PA). Za preučevanje razmerja med prstnimi odtisi in učinkom je bil uporabljen model PCA MLRA, za analizo pa je bilo izbranih prvih šest osebnih računalnikov s kumulativno stopnjo prispevka variance: 91,068 odstotka. Končno je bila glede na izhod SPSS in osebne računalnike določena naslednja enačba: IC50=1.115864 plus （ 1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 plus 2.95283PA7- 15.5305PA8 plus 13.0297PA9 plus 22.5683PA10 - 10.3462PA11 plus 123.762PA12 plus 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R je bil 0,682, P <>

Integracijska analiza dveh vrst Mylabris

Poskus je pokazal, da se HPLC prstni odtisi lahko uporabijo za prikaz kemijskih lastnosti zdravila Mylabris. Za iskanje razlike med MC in MP so bili uporabljeni algoritmi podobnosti, PCA in OPLS-DA. Skupina vrhov (1, 2, 4, 7, 9, 12 in 14) je bila opredeljena kot značilni kemični markerji.

Poleg tega sta se tako GRA kot MLRA izkazali kot zadovoljivi metodi za nadaljnjo diskriminacijo. Če združimo rezultate analize GRA in MLRA, bi morali biti vrhovi 2, 4 in 14 kot označevalci aktivnosti zdravila Mylabris odgovorni za protitumorski učinek, ki je lahko osnova farmakodinamičnega materiala zdravila Mylabris.

Pomembni diferencialni markerji so bili definirani za vrh z značilnimi kemičnimi lastnostmi in lastnostmi markerjev aktivnosti. Torej so bili med MC in MP na prstnih odtisih HPLC po analizi razmerja spekter-učinek vrhovi 2 (citozin), 4 (neznano) in 14 (neznano) pomembni diferencialni označevalci za razlike med MP in MC, kot je prikazano na sliki 7.

Zaključek

Končno je bila v tej raziskavi predlagana metoda HPLC za kemični prstni odtis MP in MC. S kombiniranjem odvzema prstnih odtisov HPLC, PCA in analize razmerja med spektrom in učinkom, kot sta GAS in MLRA, bi lahko razlikovali kemijske in farmakološke lastnosti dveh podobnih vrst Mylabrisa. To je pokazalo, da so spojine iz vrhov 2 (citozin), 4 (neznano) in 14 (neznano) kot pomembni diferencialni markerji igrale prevladujočo vlogo pri razlikovanju med MP in MC. Strukturo vrhov 4 in 14 je treba identificirati z drugo tehnologijo. Metoda prstnih odtisov HPLC v kombinaciji s statistično, kemometrično analizo in analizo razmerja spekter-učinek se je izkazala za učinkovito pri odkrivanju komponent markerjev ali za spodbujanje QCzeliščna zdravila.

Reference

1 Wang GS. Medicinska uporaba Mylabrisa v starodavni Kitajski in novejše študije. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Določanje vsebnosti kantaridina in njegov zaviralni učinek na celice človeškega hepatoma HepG2. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: inhibitorne aktivnosti holesterol aciltransferaze amidov maščobnih kislin, izoliranih iz Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Pretisni omoti s kantaridinom: tehnika za raziskovanje prometa z levkociti in proizvodnje citokinov na mestih vnetja pri ljudeh. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Študija o prednostni hrani odraslih Mylabris phalerata v različnih geografskih populacijah. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Biološke značilnosti meloidae in njihovo umetno hranjenje. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Kvantitativna analiza v kombinaciji s tehnologijo prstnih odtisov in kemometrično analizo, uporabljena za ocenjevanje šestih vrst divjega pariža z uporabo UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Spremljanje in ocenjevanje doslednosti kakovosti tablet sestavljenega bizmutovega aluminata s preprosto kvantificirano metodo prstnega odtisa razmerja v kombinaciji s hkratnim določanjem petih spojin in korelacijo z antioksidativnimi aktivnostmi. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analiza kantaridina pri lažnih mehurčkih (Coleoptera: Oedemeridae) z mikroekstrakcijo v trdni fazi in plinsko kromatografijo-masno spektrometrijo. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Študija GC prstnih odtisov Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX in Shi XF. HPCE je digitaliziral prstne odtise Mylabrisa. Central South Pharmacy (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX in Wang, Z. Študija o digitaliziranih HPLC prstnih odtisih Mylabrisa. China Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008; 28 (7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Aktivnost kantaridina, pridobljenega iz province Guizhou in okoliških regij, proti človeškim celicam hepatocelularnega karcinoma HepG 2. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.