Identifikacija lipokalina, povezanega z nevtrofilno želatinazo, kot novega zgodnjega urinskega biomarkerja za ishemično ledvično poškodbo

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

JAYA MISHRA,* QING MA,* ANNE PRADA,* MARK MITSNEFES,* KAMYAR ZAHEDI,* JUN YANG,† JONATHAN BARASCH,† in PRASAD DEVARAJAN*

*Nefrologija in hipertenzija, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio; in † Nefrologija, Fakulteta za zdravnike in kirurge, Univerza Columbia, New York, New York

Povzetek.

Akutnaledvičnaodpoved (ARF), ki je posledica ishemične poškodbe, ostaja pogost in potencialno uničujoč problem. Za identifikacijo ledvičnih genov, ki so inducirani zelo zgodaj po ledvični ishemiji, katerih proteinski produkti bi lahko služili kot novi biomarkerji za ARF, je bila uporabljena strategija zasliševanja celotnega transkriptoma. Identificiranih je bilo sedem genov, ki so regulirani plus - 10-krat, od katerih so nedavno poročali, da je eden (Cyr61) induciran po ishemiji ledvic. Nepričakovano je bila indukcija ostalih šestih transkriptov nova za področje ARF. V tej študiji je bil dodatno okarakteriziran eden od teh prej neprepoznanih genov, in sicer lipokalin, povezan z nevtrofilno želatinazo (NGAL), ker gre za majhen izločen polipeptid, ki je odporen na proteazo in ga je posledično mogoče zlahka zaznati v urinu. Izrazita regulacija ravni mRNA in beljakovin NGAL v zgodnji postishemični mišiledvicaje bil potrjen. Ekspresija proteina NGAL je bila odkrita predvsem v celicah proksimalnih tubulov, pozitivnih na jedrni antigen proliferirajočih celic, v pikčasti citoplazmatski porazdelitvi, ki je lokalizirana skupaj z markerji poznih endosomov. NGAL je bilo zlahka odkrito v urinu pri prvem izločanju urina po ishemiji tako pri mišjih kot podganjih modelih ARF. Pojav NGAL v urinu je bil povezan z odmerkom in trajanjemledvičnaishemijo in pred pojavom drugih urinskih markerjev, kot sta N-acetil- -D-glukozaminidaza in 2-mikroglobulin. Izvor NGAL iz tubulnih celic je bil potrjen v gojenih človeških proksimalnih tubulnih celicah, ki so bile izpostavljene ishemični poškodbi in vitro, kjer je bila mRNA NGAL hitro inducirana v celicah in je bil protein NGAL zlahka zaznaven v gojišču v 1 h po blagem izčrpanju ATP. NGAL je bilo prav tako zlahka zaznati v urinu miši z nefrotoksičnostjo, ki jo povzroča cisplatin, spet pred pojavom N-acetil- -D-glukozaminidaze in 2-mikroglobulina. Rezultati kažejo, da lahko NGAL predstavlja zgodnji, občutljivi, neinvazivni urinski biomarker za ishemično in nefrotoksičnoledvičnapoškodba.

Cistanche herbalahko zdravi poškodbo ledvic

Pridobite več informacij o izdelkih, povezanih s Cistanche

Akutnaledvičnaneuspeh(ARF), ki je posledica ishemične ali nefrotoksične poškodbe, ostaja pogost in potencialno uničujoč problem v klinični nefrologiji, z vztrajno visoko stopnjo umrljivosti kljub pomembnemu napredku v podporni oskrbi (1–4). Pionirske študije v več desetletjih so osvetlile vlogo vztrajne vazokonstrikcije, tubularne obstrukcije, celičnih strukturnih in presnovnih sprememb ter vnetnega odziva v patogenezi ARF (4–7). Čeprav so te študije utrle pot uspešnim terapevtskim pristopom na živalskih modelih, so poskusi translacijskih raziskav pri ljudeh prinesli razočarajoče rezultate (2–4). Razlogi za to lahko vključujejo večplasten odziv ledvic na ishemijo in nefrotoksine ter pomanjkanje zgodnjih markerjev za ARF s posledično zamudo pri uvedbi terapije (4–8).

Poskusi, da bi razkrili molekularno osnovo teh nešteto zgodnjihledvičnaodzive je olajšal nedavni napredek v funkcionalni genomiki, ki je prinesel nova orodja za genomsko analizo kompleksnih bioloških procesov, kot je ishemična ARF (8–11). Metode mikromrež cDNA zagotavljajo vzporedne in kvantitativne profile izražanja tisočih genov, ki lahko v kombinaciji z bioinformatičnimi orodji identificirajo gene v biološki poti, karakterizirajo delovanje novih genov in zaznajo podrazrede bolezni (9). S to presejalno tehniko smo identificirali podmnožico sedmih genov, katerih izražanje je 0-kratno povečano v prvih nekaj urah po ishemičniledvičnapoškodbav modelu miške. Nedavno je bilo potrjeno, da enega od teh transkriptov, s cisteinom bogatega proteina 61 (Cyr61), povzroča ledvična ishemija (8), vendar je obnašanje ostalih šestih različno izraženih genov novo za literaturo ARF. V tej študiji smo se odločili za nadaljnjo karakterizacijo enega od teh prej neprepoznanih genov, in sicer lipokalina, povezanega z nevtrofilno želatinazo (NGAL), ker gre za majhen izločen polipeptid, ki ga je mogoče zaznati v urinu, zlasti ker je odporen na proteazo. Naši rezultati kažejo, da lahko NGAL predstavlja nov zgodnji urinski biomarker za ishemično in nefrotoksičnoledvičnapoškodba.

Materiali in metode

Mišji modeli ledvične ishemije-reperfuzijske poškodbe

Uporabili smo dobro uveljavljene mišje modele, v katerih so strukturne in funkcionalne posledice kratkih obdobijledvičnaishemija je bila predhodno dokumentirana (11–15). Na kratko, samci miši Swiss-Webster (Taconic Farms, Germantown, NY), težki od 25 do 35 g, so bili nameščeni v ciklu 12:12-h svetloba:temna in jim je bil omogočen prost dostop do hrane in vode. Živali so bile anestezirane z natrijevim pentobarbitalom (50 mg/kg intraperitonealno) in postavljene na grelno mizo, da se vzdržuje rektalna temperatura 37 stopinj. Uporabljeni so bili trije ločeni protokoli: (1) enostranska ishemija brez ARF, (2) dvostranska ishemija z ARF in (3) dvostranska blaga subklinična ishemija. Za poskuse enostranske ishemije je bil levi ledvični pecelj zaprt z netravmatično žilno objemko za 45 minut, med tem časom pa je bila ledvica topla in vlažna. Objemko so nato odstranili, pregledali ledvico, da bi se vrnil krvni pretok, in rez zašili. Miši so pustili, da so si opomogle v ogreti kletki, in pridobili so časovno odmerjene zbirke urina. Po 0, 3, 12 ali 24 urah reperfuzije so živali ponovno anestezirali, odprli trebušno votlino in s punkcijo spodnje vene cave odvzeli kri za merjenje serumskega kreatinina s kompletom za kvantitativni kolorimetrični test (Sigma, St. Louis, MO). Miši smo ubili, ledvice perfuzijsko fiksirali in situ s 4 odstotki paraformaldehida v PBS in obe ledvici smo pobrali (desna ledvica je služila kot kontrola za vsako žival). V vsakem od obdobij ponovnega točenja so bile pregledane vsaj tri ločene živali. Polovica vsake ledvice je bila hitro zamrznjena v tekočem dušiku in shranjena pri 70 stopinjah do nadaljnje predelave; vzorec je bil fiksiran v formalinu, vlit v parafin in razrezan (4 m). Parafinske reze smo obarvali s hematoksilin-eozinom in histološko pregledali. Vkleščene ledvice so pokazale značilne morfološke spremembe, ki so posledica ishemično-reperfuzijske poškodbe, kot so že objavili drugi (12–14) in mi (11). Druga polovica vsake ledvice je bila vdelana v spojino OCT (Tissue-Tek) in pridobljeni so bili zamrznjeni odseki (4 m) za imunohistokemijo. Za poskuse dvostranske ishemije z ARF sta bili obe ledvici vpeti za 30 minut in pregledani v različnih obdobjih reflowa, kot je podrobno opisano zgoraj. Ta skupina osmih živali je bila zasnovana tako, da predstavlja klinično ARF in je pokazala znatno zvišanje serumskega kreatinina 24 ur po poškodbi. Za poskuse dvostranske blage subklinične ishemije sta bili obe ledvici stisnjeni samo za 5, 10 ali 20 minut in pregledani v različnih obdobjih reperfuzije, kot je navedeno zgoraj. Ta blaga stopnja poškodbe je bila zasnovana za simulacijo subklinične ledvične ishemije in miši v tej skupini niso pokazale nobenih povišanj serumskega kreatinina, izmerjenega 24 ur po poškodbi.

Podganji model ledvične ishemije-reperfuzijske poškodbe

Uporabili smo dobro uveljavljene modele glodalcevledvičnaishemično-reperfuzijska poškodba (10). Na kratko, samci podgan Sprague-Dawley, ki so tehtali od 200 do 250 g (Taconic Farms), so bili anestezirani s ketaminom (150 g/g) in ksilazinom (3 g/g) ter izpostavljeni dvostranski okluziji ledvične arterije z mikrovaskularnimi sponkami za 30 minut, kot je podrobno opisano v protokol miške. Časovno odvzeti urin je bil pridobljen pri 3, 6, 9, 12 in 24 urah reperfuzije, kri pa je bila zbrana za merjenje kreatinina v času usmrtitve (24 ur).

Mišji model s cisplatinom povzročene ledvične poškodbe

Uporabili smo dobro uveljavljene mišje modele, v katerih so bile strukturne in funkcionalne posledice dajanja cisplatina predhodno dokumentirane (16–18). Na kratko, miši so dobile eno intraperitonealno injekcijo cisplatina (20 mg/kg telesne teže). Posledica tega je nekroza in apoptoza tubulnih celic ter povišan dušik sečnine v krvi v 3 dneh po injiciranju cisplatina (16–18). Živali so bile nameščene v presnovnih kletkah, zbiranje urina pa je potekalo dnevno.

Izolacija RNA

Mišja cela ledvična tkiva (ali gojene celice človeških proksimalnih tubulov; glej spodaj) so bila porušena s Tissue Terror (Biospec Products, Racine, WI). Celotno RNA iz kontrolnih in ishemičnih ledvic smo izolirali z uporabo RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) in kvantificirali s spektrofotometrijo.

Postopki mikromrež

Podrobni opisi strojne opreme mikromrež in postopkov so bili že objavljeni (11). Na kratko, za vsak poskus je bilo 100 g očiščene celotne RNK mišje ledvice reverzno prepisano z reverzno transkriptazo Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) v prisotnosti Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) za kontrole in Cy5-dUTP za ishemične vzorce. Vzorci cDNA so bili prečiščeni z uporabo filtra Microcon YM-50 (Millipore, Madison, WI) in hibridizirani v preparate z mikromrežami, ki vsebujejo 8979 edinstvenih mišjih sond, preverjenih zaporedjem (11). Tri ločene živali so bile pregledane za vsako od obdobij reflowa in za vsako od živali sta bila izvedena vsaj dva neodvisna poskusa z mikromrežami. Diapozitivi niza so bili skenirani z mikromrežnim skenerjem (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA), da smo dobili ločene slike TIFF za Cy3 in Cy5 fluorescenco. Intenzivnosti signala za Cy3 in Cy5 so bile določene za posamezne gene z uporabo programske opreme za ekstrakcijo podatkov GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Nadzor kakovosti in analiza podatkov sta bili zaključeni, kot je opisano prej (11).

cistanche rastlina za ledvice

Polkvantitativna povratna transkripcija – PCR

Enako količino (1 plus - g) celotne RNA iz kontrolnih in eksperimentalnih mišjih ledvic smo reverzno prepisali z reverzno transkriptazo Superscript II (Life Technologies) v prisotnosti naključnih heksamerov v skladu z navodili proizvajalca. PCR smo izvedli z uporabo kompleta (Roche, Indianapolis, IN) in naslednjih primerjev: mišji NGAL sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', mišji NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3', človeški NGAL smiselni 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3' in človeški NGAL protismiselni 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Pari primerjev za mišji in človeški -aktin in gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenazo (GAPDH) so bili pridobljeni pri Clontech (La Jolla, CA). Lažne reakcije brez cDNA so služile kot negativne kontrole. Produkte PCR smo analizirali z elektroforezo v agaroznem gelu, ki ji je sledilo barvanje z etidijevim bromidom, in jih kvantificirali z denzitometrijo. Kratne spremembe v ekspresiji mRNA NGAL v ishemičnih v primerjavi s kontrolnimi ledvicami so bile izražene po normalizaciji za pomnoževanje -aktina ali GAPDH.

mikroskopija

Za odkrivanje NGAL smo zamrznjene odseke permeabilizirali z {{0}}.2-odstotnim Tritonom X-100 v PBS 10 minut, blokirali s kozjim serumom 1 uro in inkubirali s primarnim protitelesom proti NGAL ( 1:500 razredčitev) 1 uro. Stekelca smo nato 30 minut izpostavili v temi sekundarnim protitelesom, konjugiranim s Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) in vizualizirali s fluorescenčnim mikroskopom (Zeiss Axiophot), opremljenim z rodaminskimi filtri. Za so-lokalizacijo NGAL z Rab11 so serijske odseke najprej inkubirali s protitelesom NGAL ali monoklonskim protitelesom proti Rab11 (razredčitev 1:500; Transduction Laboratories), nato s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s Cy5 (za NGAL) ali Cy3 (za Rab11). ) in vizualizirani z rodaminskimi oziroma fluoresceinskimi filtri. Za so-lokalizacijo NGAL z jedrnim antigenom proliferirajočih celic (PCNA) so bili odseki soinkubirani s protitelesom NGAL in monoklonskim protitelesom proti PCNA (razredčitev 1:500; Upstate), detekcija pa je bila opravljena z obarvanjem z imunoperoksidazo (ImmunoCruz Staining System, Santa Cruz biotehnologija). Za test TUNEL smo uporabili ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (Clontech). Parafinske rezine smo deparafinizirali s ksilenom in padajočimi stopnjami etanola, fiksirali s 4 odstotki formaldehida/PBS 30 minut pri 4 stopinjah, permeabilizirali s proteinazo K pri sobni temperaturi 15 minut in 0,2 odstotka Triton X-100/PBS 15 minut. min pri 4 stopinjah in inkubiramo z mešanico nukleotidov in encima TdT 60 minut pri 37 stopinjah. Reakcijo smo zaključili z 2 SSC in odseke sprali s PBS in pritrdili s Crystal/mount (Biomed, Foster City, CA). TUNEL-pozitivna apoptotična jedra so bila odkrita z vizualizacijo s fluorescenčnim mikroskopom.

Zbiranje urina

Miši ali podgane so bile postavljene v presnovne kletke (Nalgene, Rochester, NY) in urin so zbirali pred in vsako uro po obojestranskemledvičnaokluzija arterije. Vzorce urina smo centrifugirali pri 5000 g, da smo odstranili ostanke, in supernatant analizirali z Western blottingom. Kreatinin v urinu je bil izmerjen s kompletom za kvantitativni kolorimetrični test (Sigma) za normalizacijo vzorcev za določanje NGAL v urinu. Kolorimetrični testni komplet za določanje N-acetil-D-glukozaminidaze (NAG) v urinu je bil pridobljen pri Rocheju.

Celična kultura

Človekledvičnaproksimalne tubularne epitelne celice (RPTEC) so bile pridobljene pri Clonetics (San Diego, CA). Celice so gojili vledvičnabazalni medij epitelijskih celic, dopolnjen zledvičnaKompleks medija za rast epitelnih celic (REGM) ({{0}}.5 l/ml hidrokortizona, 10 pg/ml hEGF, 0.5 - g/ml epinefrina, 6,5 pg/ml trijodtironina, 10 plus - g/ml transferina, 5 - g/ml insulina, 1 -g/ml gentamicin sulfata in 2 odstotka FBS), kot priporoča proizvajalec.

Blago izčrpavanje ATP kultiviranih celic

Spremenili smo predhodno opisane protokole in vitro ishemije z deplecijo ATP z zaviralci oksidativne fosforilacije (19,20). Drugi dan po sotočju so bile celice RPTEC inkubirane z 1 m antimicina A (Sigma) v različnih časovnih obdobjih do 6 ur. Prej smo pokazali, da to povzroči blago delno reverzibilno izčrpavanje ATP in nobeno izgubo viabilnosti celic v drugih vrstah kultiviranih ledvičnih epitelijskih celic, kot so celice MDCK (19) in 786-O (20). Ravni ATP so bile spremljane s kompletom za testiranje na osnovi luciferaze (Sigma) in izražene kot odstotek kontrolnih vrednosti. Celice so bile pobrane v različnih časovnih točkah izčrpavanja ATP in analizirane na ekspresijo mRNA NGAL z reverzno transkripcijo – PCR (RT-PCR) in ekspresijo proteina NGAL z Western analizo. Spremljali smo tudi izločanje NGAL v gojišče.

Drugi materiali in metode

Vse kemikalije so bile kupljene pri Sigmi, razen če ni navedeno drugače. Za Western blot so bile koncentracije beljakovin določene z Bradfordovim testom (Bio-Rad, Hercules, CA) in v vsak pas so bile naložene enake količine skupnih beljakovin. Monoklonsko protitelo proti- -tubulinu (Sigma) je bilo uporabljeno v razmerju 1:10,000 razredčitev za potrditev enake obremenitve z beljakovinami in poliklonsko protitelo proti NGAL v razmerju 1:500 (21). Uporabljeno je bilo monoklonsko protitelo proti 2-mikroglobulinu v razmerju 1:500 (Sigma). Imunodetekcija prenesenih proteinov je bila dosežena z uporabo izboljšane kemiluminiscence (Amersham).

Rezultati

Karakterizacija živalskih modelov zgodnje ledvične ishemije-reperfuzijske poškodbe

Uporabili smo mišje modele, v katerih so bile dokumentirane strukturne in funkcionalne posledice kratkih obdobij ledvične ishemije (11–15). Značilne histopatološke značilnosti ishemične poškodbe so bile jasno vidne v 24-h reperfuzijskih vzorcih po enostranski (45 min) in dvostranski (30 min) ishemiji. Ti so vključevali izgubo membran krtačastega roba, tubulno dilatacijo, sploščen tubularni epitelij, luminalne ostanke in intersticijske infiltrate (slika 1). Dokumentirali smo prisotnost apoptotičnih celic s testom TUNEL. Apoptoza je bila pretežno lokalizirana na distalnih tubularnih celicah in naraščajočem delu Henlejeve zanke, tako v ločenih celicah znotraj lumna kot tudi v pritrjenih celicah. Občasne proksimalne tubularne celice so bile tudi apoptotične, vendar so bili glomeruli v bistvu brez apoptoze. V kontrolnih ledvicah ali v ishemičnih vzorcih, kjer je bil TdT izpuščen, niso odkrili TUNEL-pozitivnih celic (ni prikazano). Zgornje histološke in apoptotične spremembe niso bile v ledvicah, ki so bile izpostavljene blažjim stopnjam ishemije (5, 10 ali 20 minut dvostranske ishemije; ni prikazano). Ravni serumskega kreatinina so odražale opažene histopatološke spremembe. Tako so miši z enostransko ledvično ishemijo ali blagimi stopnjami subklinične dvostranske ishemije pokazale ravni kreatinina v serumu, ki jih ni bilo mogoče razlikovati od kontrolnih živali, medtem ko so miši z dvostransko ishemijo za 30 minut pokazale znatno zvišanje serumskega kreatinina (slika 1).

Slika 1. Karakterizacija mišjega modela ishemijeledvičnapoškodba. Leve plošče prikazujejo rezultate obarvanja s hematoksilinom in eozinom (zgoraj) in obarvanja s TUNEL (spodaj) odsekov ledvic kontrolnih miši ali po 24 urah ishemije-reperfuzije (IRI). (Desno) Rezultati določitev serumskega kreatinina pri kontrolnih miših (Con), po enostranski ishemiji 45 minut (U45) ali po dvostranski ishemiji za različna obdobja, kot je prikazano. *P 0.05 v primerjavi s kontrolo. Številke znotraj črt označujejo število živali.

NGAL mRNA je izrazito inducirana v zgodnji postishemični ledvici

Z mikromrežno analizo miši z enostranskoledvičnaishemije je bilo ugotovljeno, da je NGAL dosledno induciran (3,2 plus - 0.5-krat, 11,1 plus - 1.2-krat in 4,3 plus {{1{{30} }}}.6-krat pri 3, 12 in 24 urah reperfuzije) v ishemični mišji ledvici v primerjavi s kontrolnimi ledvicami iste živali (povprečje plus - SD treh živali na vsaki časovni točki). Ta ugotovitev je bila potrjena s semikvantitativno RT-PCR z uporabo normalizacijskega protokola s plus-aktinom in GAPDH. V nobenem od pregledanih obdobij reperfuzije niso opazili nobenih pomembnih sprememb v ekspresiji mRNA niti plus-aktina niti GAPDH, kot je opisano prej (11). Vendar pa smo z uporabo primerjev, specifičnih za miši, zaznali znatno povečanje ekspresije mRNA NGAL (4,1 plus -0.5-krat, 9 plus -0.6-krat in 4,2 plus 0.4-krat pri 3, 12 oziroma 24 urah reperfuzije, kjer vrednosti predstavljajo povprečje plus - SD za tri ločene živali). Ti rezultati so prikazani na sliki 2 in se na splošno ujemajo s spremembami, ki jih je odkrila analiza transkriptoma.

Slika 2. Indukcija mRNA lipokalina (NGAL), povezanega z nevtrofilno želatinazo mišjih ledvic, po ishemiji. (Zgoraj) Reprezentativna reverzna transkripcija – PCR (RT-PCR) s primerji za mišji aktin in NGAL, z uporabo RNA, ekstrahirane iz ledvic kontrolnih (C) miši ali po različnih obdobjih reperfuzije, kot je prikazano (ure). Proga M vsebuje 100-bp DNK lestev. (Spodaj) Kratno povečanje izražanja mRNA NGAL v različnih časovnih točkah od kontrole (CON). Vrednosti, dobljene z mikromrežo (polna črta) v primerjavi z RT-PCR (črtkana črta), so srednja SD iz treh poskusov na vsaki časovni točki.

Protein NGAL je izrazito čezmerno izražen v proksimalnih tubulih zgodnjih ishemičnih mišjih ledvic

Naslednje je bilo zanimivo ugotoviti, ali je postishemična ekspresija proteina NGAL v ledvicah vzporedna z mRNA. Z Western analizo je bil NGAL zaznaven le kot 25-kD imunoreaktivni peptid v kontrolnih mišjih ledvicah. Identiteta tega pasu kot NGAL je bila ugotovljena v ločenem nizu poskusov, kjer je predinkubacija primarnega protitelesa z rekombinantnim mišjim lipokalinom popolnoma blokirala to imunoreaktivnost (ni prikazano). V poskusih enostranske ishemije je bila ekspresija NGAL inducirana tri- do štirikrat z denzitometrijo v ishemični ledvici petih ločenih živali v 3 urah po poškodbi, kot je prikazano na sliki 3. Ta odziv je bil dramatično povečan v dvostranskih poskusih ishemije pri osmih ločenih živalih . NGAL je bil pri teh miših induciran trikrat po 3 urah reperfuzije, dosegel je vrh 12--krat v 24--ih vzorcih in padel na normalne ravni do 72--urnega obdobja okrevanja (slika 3). .

Slika 3. Indukcija proteina NGAL v mišji ledvici po enostranski ali obojestranski ishemiji. (Zgoraj) Reprezentativni Western bloti z vzorci celih ledvic, pridobljenimi iz kontrolnih (Con) miši ali po obdobjih reperfuzije, kot je prikazano (ure), sondirani s poliklonskim protitelesom proti NGAL ali monoklonskim protitelesom proti tubulinu (za prikaz enake obremenitve beljakovin). Oznake molekulske mase so na levi. (Spodaj) Kratno povečanje izražanja proteina NGAL v različnih časovnih točkah od kontrole (CON). Vrednosti, dobljene z denzitometrijo, so povprečje SD za pet živali za enostransko ishemijo in osem živali za dvostransko ishemijo

Z uporabo imunohistokemičnih tehnik smo nato dokazali, da je bil protein NGAL komaj zaznaven v ledvicah kontrolne miši, vendar je povečan predvsem v proksimalnih tubulih v 3 urah po ishemiji, kot je prikazano na sliki 4. Identifikacija proksimalnih tubulov v teh delih je temeljila na prisotnosti ščetke mejna membrana, razmerje med velikostjo jedra in celico ter celično morfologijo. Inducirani NGAL se je pojavil v pikčasti citoplazemski porazdelitvi znotraj celic proksimalnih tubulov, ki spominja na izločen protein. Ta vzorec izražanja je bil identičen tako pri enostranskih kot pri dvostranskih modelih ishemijsko-reperfuzijske poškodbe in je bil dosledno očiten pri vsaki proučevani živali. Glomeruli so bili brez izražanja NGAL in nevtrofilcev, ki izražajo NGAL, ni bilo opaziti. Ker se je pokazalo, da se NGAL v kultiviranih ledvičnih celicah Wilmsovega tumorja vsaj delno lokalizira skupaj z endosomi (21), smo v serijskih odsekih pregledali porazdelitev NGAL in Rab11 (označevalec endosomov poznega recikliranja). Združene slike so pokazale pomembno so-lokalizacijo NGAL z Rab11 (slika 4). Da bi raziskali funkcionalni pomen povečane ekspresije NGAL po ishemiji, smo pregledali serijske odseke ledvic za ekspresijo NGAL, TUNEL-pozitivna jedra ali PCNA-pozitivna jedra. Medtem ko celice tubulov, ki prekomerno izražajo NGAL, niso bile TUNEL-pozitivne (ni prikazano), je bila očitna pomembna so-lokalizacija NGAL in PCNA v proliferirajočih in regenerirajočih celicah v 48-h obdobju reflowa (slika 4).

Slika 4. Indukcija proteina NGAL v mišji ledvici po ishemiji. (Zgoraj) Reprezentativni rezultati imunohistokemije na zamrznjenih delih mišjih ledvic, pridobljenih od kontrolnih miši ali po različnih obdobjih reflowa, kot je prikazano (ure), testiranih s poliklonskim protitelesom proti NGAL. G, glomerul. Plošča z oznako HP je visokozmogljiva povečava 100 plus, druge plošče pa so na 20. (Spodaj) Levi dve plošči prikazujeta tubul po 3 urah reperfuzije, ki izraža NGAL (rdeče) ali Rab11 (zeleno). Tretja plošča prikazuje združeno sliko, ki rumeno označuje solokalizacijo. Plošča na skrajni desni strani prikazuje so-lokalizacijo NGAL s proliferirajočim celičnim jedrnim antigenom v tubulih po 48 urah reflowa.

Protein NGAL je zlahka odkrit v urinu takoj po indukciji ARF pri miših

Naslednje je bilo zelo zanimivo ugotoviti, ali je mogoče zaznati postishemično izražanje proteina NGAL v urinu, kar kaže na njegovo uporabnost kot zgodnjega neinvazivnega biomarkerja ishemičnihledvičnapoškodba. Z uporabo koncentracij kreatinina v urinu za izenačitev nalaganja vzorca je bil NGAL odsoten v urinu pred ishemijo. V osupljivem nasprotju se je NGAL manifestiral kot pas 25-kD v 2 urah po poškodbi (v prvem izločanju urina po ishemiji) pri vseh pregledanih živalih (pet z enostransko in osem z dvostransko ishemijo), kot je prikazano v Slika 5. Identiteta tega pasu kot NGAL je bila ugotovljena v ločenem nizu poskusov, v katerih je predinkubacija primarnega protitelesa z rekombinantnim mišjim lipokalinom popolnoma blokirala to imunoreaktivnost (ni prikazano). Zanimivo je, da je bilo NGAL zlahka zaznati v samo 1 l nepredelanega urina z Western analizo in je vztrajal ves čas pregleda (24 ur reperfuzije). Nato smo primerjali izločanje NGAL z urinom s predhodno ugotovljenimi označevalci poškodb, kot sta 2-mikroglobulin in NAG. Medtem ko je bil NGAL v urinu očiten v 2 urah po ishemiji, je bil 2-mikroglobulin v istih vzorcih urina zaznaven šele po 12 urah enostranske in 8 urah dvostranske ishemije (slika 5). Podobno se je izločanje NAG z urinom znatno povečalo šele po 12 urah enostranske in 8 urah dvostranske ishemije v primerjavi z neishemičnimi kontrolnimi živalmi (slika 5).

Slika 5. Zgodnje odkrivanje proteina NGAL v urinu pri miših z akutno ishemičnoledvičnaokvara (ARF). (Zgoraj) Reprezentativni Western bloti nepredelanih vzorcev urina (1 do 2 plus - l na stezo, normalizirano za vsebnost kreatinina) so bili pridobljeni v obdobjih reperfuzije, kot je prikazano (ure), po enostranskem ali dvostranskemledvičnavpenjanje arterije. Oznake molekulske mase so prikazane na levi. Blote so testirali z NGAL (zgoraj) ali {{0}}mikroglobulinom (Beta2-M; sredina). (Spodaj) Določitve N-acetil--D-glukozaminidaze (NAG) v različnih obdobjih reperfuzije, kot je navedeno, pri petih živalih za enostransko ishemijo in osmih živalih za dvostransko ishemijo. Vrednosti so srednje vrednosti SD. *P 0,05 v primerjavi s kontrolo na vsaki časovni točki, ANOVA.

Beljakovine NGAL se zlahka zaznajo v urinu tudi po blagi ledvični ishemiji pri miših

Za določitev občutljivosti odkrivanja NGAL v urinu v odsotnosti očitnega ARF smo uporabili protokole, po katerih so bile ločene skupine miši izpostavljene le 5, 10 ali 20-minutnemu bilateralnemuledvičnaokluzija arterije. Te študije so bile zasnovane za oceno izločanja NGAL z urinom po blagi subklinični ledvični ishemiji. Serumski kreatinin, izmerjen po 24 urah reflowa, je bil v mejah normale pri vseh teh miših (slika 1). Presenetljivo je bilo, da je bil NGAL pri teh živalih zlahka odkrit v samo 1 l nepredelanega urina (slika 6), čeprav je bil njegov videz nekoliko zakasnjen v primerjavi z živalmi z očitno ARF. Tako, medtem ko je 30 minut obojestranske ishemije povzročilo izločanje NGAL z urinom v 2 urah (slika 5), ​​so miši z 20 ali 10 minutami obojestranske ishemije pokazale urinsko NGAL po 4 urah, tiste s 5 minutami ishemije pa so izločile NGAL šele po 6 urah ( Slika 6). Tako je pojav NGAL v urinu v korelaciji z odmerkom in trajanjem ledvične ishemije.

Protein NGAL je zlahka odkrit v urinu takoj po indukciji ARF pri podganah

Slika 6. Odkrivanje proteina NGAL v urinu pri miših s subklinično ledvično ishemijo. Reprezentativni Western blot vzorcev nepredelanega urina (1 do 2 l na stezo, normalizirano za vsebnost kreatinina), dobljenih v reperfuzijskih obdobjih, kot je prikazano (ure), po 5, 10 ali 20 minutah dvostranskega vpenjanja ledvične arterije. Oznake molekulske mase so prikazane na levi. Te živali so pokazale normalen serumski kreatinin po 24 urah reflowa.

Ker obstaja razprava glede vrstnih razlik v odzivih na okluzijo ledvične arterije (22), smo nato preučili vedenje NGAL v drugem živalskem modelu, in sicer dobro uveljavljenem podganjem modelu ledvične ishemije-reperfuzijske poškodbe. Z uporabo koncentracij kreatinina v urinu za izenačitev nalaganja vzorca je bil NGAL odsoten v urinu pred ishemijo. V izrazitem nasprotju se je NGAL manifestiral kot 25-kD imunoreaktivni peptid v 3 urah po poškodbi (v prvem izločanju urina po ishemiji), kot je prikazano na sliki 7. Za primerjavo, serumski kreatinin v tem modelu ishemična poškodba se je povečala šele po 24 urah reperfuzije (ni prikazano). Še enkrat, NGAL je bilo mogoče zaznati v 1 l nepredelanega urina in je vztrajal ves čas pregleda (24 ur reperfuzije).

Slika 7. Zgodnje odkrivanje beljakovin NGAL v urinu pri podganah z ishemično ARF. Reprezentativni Western blot vzorcev neobdelanega urina (1 do 2 l na stezo, normalizirano za vsebnost kreatinina), dobljenih v obdobjih reperfuzije, kot je prikazano (ure), po 30 minutah dvostranskega vpenjanja ledvične arterije pri podganah. Oznake molekulske mase so prikazane na levi. Te živali so pokazale znatno povečanje serumskega kreatinina po 24 urah reflowa.

NGAL mRNA se inducira v gojenih človeških proksimalnih tubulnih celicah po zgodnji blagi ishemiji

Da bi potrdili izvor NGAL iz ishemičnih celic proksimalnih tubulov, smo spremenili predhodno opisane protokole ishemije in vitro z zmanjšanjem ATP v gojenih celicah proksimalnih tubulov človeka (RPTEC). Inkubacija je 1-m antimicina povzročila blago delno zmanjšanje ATP na približno 83 plus 3 odstotke kontrole v 1 uri, s postopnejšim znižanjem na približno 75 plus - 3 odstotkov kontrole do 6 ur ( povprečna SD iz štirih poskusov). Morfoloških posledic tega blagega izčrpavanja ATP ni bilo opaziti. NGAL mRNA je bilo mogoče zaznati le v celicah v mirovanju. Vendar pa je bila po delnem izčrpanju ATP hitra in od trajanja odvisna indukcija mRNA NGAL očitna z RT-PCR, kot je prikazano na sliki 8.

Protein NGAL je zlahka odkrit v mediju po zgodnji ishemiji in vitro

Nato smo pregledali izražanje proteina NGAL v celicah RPTEC in gojišču po blagem izčrpanju ATP. Protein NGAL je bil zaznaven v kontrolnih celicah RPTEC in njegova ekspresija se je povečala po izčrpanju ATP na način, ki je odvisen od trajanja, kot je prikazano na sliki 8. V gojišču iz kontrolnih celic ni bilo najdenega imunoreaktivnega proteina NGAL, vendar je bilo NGAL zlahka zaznati v 1 h blagega izčrpavanja ATP (slika 8). Opazili so nadaljnje povečanje številčnosti beljakovin NGAL v povezavi s trajanjem izčrpavanja ATP. Ti rezultati kažejo, da se inducirani protein NGAL hitro izloča v medij, podobno kot pri hitrem pojavu NGAL v urinu po ishemiji ledvic in vivo.

Slika 8. Indukcija mRNA NGAL po ishemiji in vitro. (Zgoraj) Reprezentativni RT-PCR s primerji za človeški NGAL z uporabo RNA, ekstrahirane iz celic ledvičnih proksimalnih tubularnih epitelijskih celic (RPTEC) po različnih obdobjih delnega izčrpavanja ATP, kot je prikazano (ure). Proga M vsebuje 100-bp DNK lestev. (Srednje) Kratno povečanje izražanja mRNA NGAL v različnih časovnih točkah od kontrole (0), normalizirano za izražanje gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze. Prikazane vrednosti so srednje vrednosti SD iz treh poskusov na vsaki časovni točki. (Spodaj) Reprezentativni Western blot z vzorci RPTEC po različnih obdobjih delnega izčrpavanja ATP, kot je prikazano (ure), pridobljen iz enakih količin celičnih peletov (Pel) ali gojišča (Sup), sondiranih s poliklonskim protitelesom proti NGAL. Oznake molekulske mase so na levi. Slika predstavlja tri ločene poskuse.

Protein NGAL je zlahka odkrit v urinu zgodaj po indukciji s cisplatinom povzročene nefrotoksičnosti

Nato smo želeli ugotoviti, ali je mogoče NGAL zaznati v urinu po drugih oblikah poškodbe tubulnih celic. V uveljavljenem mišjem modelu nefrotoksičnosti cisplatina je bil NGAL zlahka odkrit v urinu v 1 d po dajanju cisplatina (slika 9). Nasprotno pa je bil 2-mikroglobulin v urinu komaj zaznaven po 2 dneh in ga je bilo mogoče zanesljivo zaznati šele 4. do 5. dan po cisplatinu. Podobno je bilo povečano izločanje NAG z urinom opazno šele 4. in 5. dan po dajanju cisplatina (slika 9).

Slika 9. Zgodnje odkrivanje proteina NGAL v urinu pri miših s poškodbo, ki jo povzroča cisplatin. (A) Reprezentativni Western bloti na neobdelanih urinskih vzorcih (1 do 2 l na stezo, normalizirano za vsebnost kreatinina), dobljeni na dneve, kot je prikazano po dajanju cisplatina, sondirani s protitelesi proti 2-mikroglobulinu ali NGAL. Oznake molekulske mase so prikazane na levi. (B) Določitve NAG v urinu v različnih dneh po dajanju cisplatina (n 4). Vrednosti so povprečje plus -SD. *P 0.05 v primerjavi z dnem 0.

Diskusija

Uporabili smo strategijo zasliševanja na celotnem transkriptomu za identifikacijo ledvičnih genov, ki so inducirani zgodaj po ledvični ishemiji, katerih beljakovinski produkti bi lahko služili kot novi biomarkerji za ARF. Identificirali smo sedem genov, ki so 10-kratno regulirani, od katerih so nedavno poročali, da je eden (Cyr61) induciran po ishemiji ledvic (8). Nepričakovano je bila indukcija ostalih šestih transkriptov nova za področje ARF. V tej študiji smo se odločili za nadaljnjo karakterizacijo enega od teh prej neprepoznanih genov, in sicer NGAL.

NGAL spada v naddružino lipokalinov - 20 strukturno sorodnih izločenih proteinov, za katere se domneva, da prenašajo različne ligande znotraj sodčaste čašice (23). Človeški NGAL je bil prvotno identificiran kot 25-kD protein, kovalentno vezan na želatinazo iz človeških nevtrofilcev, kjer predstavlja enega od proteinov sekundarnih zrnc nevtrofilcev (24, 25). Študije molekularnega kloniranja so pokazale, da je človeški NGAL podoben mišjemu genu 24p3, ki je bil prvič identificiran v primarnih kulturah mišjih ledvic, ki so bile inducirane za razmnoževanje (26). NGAL se izraža v zelo nizkih ravneh v drugih človeških tkivih, vključno z ledvicami, sapnikom, pljuči, želodcem in debelim črevesom (27). Izražanje NGAL je izrazito inducirano v stimuliranem epiteliju. Na primer, povečana je v epitelijskih celicah debelega črevesa na območjih vnetja ali neoplazije, ni pa ga na vmesnih nevpletenih območjih ali znotraj metastatskih lezij (28). Koncentracije NGAL so povišane v serumu bolnikov z akutnimi bakterijskimi okužbami (29), sputumu oseb z astmo ali kronično obstruktivno pljučno boleznijo (30) in bronhialni tekočini iz emfizemskih pljuč (31). V vseh teh primerih se domneva, da je indukcija NGAL posledica interakcij med vnetnimi celicami in epitelijsko oblogo, pri čemer je uravnavanje izražanja NGAL očitno tako v nevtrofilcih kot v epiteliju (28–32).

Uravnavanje NGAL v zreli ledvici do sedaj ni bilo opisano. Več vrst dokazov, zbranih iz naše študije, kaže, da odkrita indukcija NGAL predstavlja nov intrinzični odziv celic proksimalnih tubulov ledvic na ishemično poškodbo in ne izhaja le iz aktiviranih nevtrofilcev. Prvič, odziv je izredno hiter, saj se NGAL v urinu pojavi v 2 urah po poškodbi (v prvem izločku urina po okluziji ledvične arterije), kopičenje ledvičnih nevtrofilcev pri tem modelu ishemične ARF pa se običajno prvič opazi pri 4 urah. po poškodbi (33–35). Drugič, časovni vzorci indukcije NGAL in kopičenja nevtrofilcev so različni. Ekspresija mRNA in beljakovin NGAL je bila največja pri 12 urah reflowa, medtem ko kopičenje nevtrofilcev doseže vrh pri 24 urah (33–35), do takrat pa se je ekspresija NGAL znatno zmanjšala. Tretjič, z imunofluorescenco v pregledanih vzorcih ledvic ni bilo mogoče zaznati nevtrofilcev, ki izražajo NGAL (slika 4). Četrtič in najbolj prepričljiv, indukcija mRNA in beljakovin NGAL se je dokumentirala v gojenih človeških celicah proksimalnih tubulov po in vitro ishemiji, pri čemer se NGAL izloča v gojišče v 1 uri po izčrpanju ATP, v sistemu, v katerem so nevtrofilci popolnoma odsotni. Vendar nam naše študije in vivo ne dovoljujejo, da bi popolnoma izključili del prispevka infiltriranih aktiviranih nevtrofilcev k opaženi povečani regulaciji NGAL. Dejansko je možno, da se povečana regulacija NGAL v celicah ledvičnih tubulov sproži z lokalnim sproščanjem citokinov iz nevtrofilcev, ujetih v mikrocirkulacijo, zgodaj po ishemični poškodbi.

Kaj je cistanche? Cistanchelahko zdraviledvičnapoškodba

Ustrezne razlage za indukcijo NGAL s stimuliranim epitelijem ni bilo in ali je NGAL zaščitna ali blizu poškodbe ali celo nedolžnega mimoidočega, ostaja nejasno. Nedavni dokazi kažejo, da vsaj v podmnožici tipov celic lahko NGAL predstavlja proapoptotično molekulo (36–38). V mišji pro-B limfocitni celični liniji je odvzem citokinov povzročil izrazito indukcijo NGAL kot tudi začetek apoptoze (36, 37). NGAL je bil povezan tudi z apoptozo v reproduktivnih tkivih. Epitelne celice involucijske mlečne žleze in maternice izražajo visoke ravni NGAL, ki časovno sovpadajo z obdobjem maksimalne apoptoze (38). Verjetno je, da NGAL regulira podmnožico celičnih populacij z indukcijo apoptoze. Stimuliran epitelij lahko poveča NGAL, da inducira apoptozo infiltriranih nevtrofilcev, s čimer omogoči rezidenčnim celicam, da preživijo opustošenje vnetnega odziva. Druga možnost je, da lahko epitelne celice uporabijo ta mehanizem za uravnavanje lastne smrti. Vendar pa je v naših študijah zanimivo omeniti, da se indukcija NGAL po zgodnji ledvični ishemiji-reperfuzijski poškodbi pojavi pretežno v celicah proksimalnih tubulov, ki niso pokazale TUNEL-pozitivnih jeder.

Druge nedavne študije so pokazale, da NGAL krepi epitelijski fenotip. NGAL se izraža s prodornim popkom sečevodov in sproži nefrogenezo s spodbujanjem pretvorbe mezenhimskih celic v ledvični epitelij (21). Za drug lipokalin, glikodelin, je bilo dokazano, da inducira epitelijski fenotip, ko je izražen v celicah človeškega karcinoma dojke (40). Te ugotovitve so še posebej pomembne za zrelo ledvico, pri kateri je eden od dobro dokumentiranih odzivov na ishemično poškodbo izjemen videz dediferenciranih epitelijskih celic, ki obdajajo proksimalne tubule (41). Pomemben vidik regeneracije in okrevanja ledvic po ishemični poškodbi vključuje ponovno pridobitev epitelijskega fenotipa, proces, ki povzema več vidikov normalnega razvoja (42). To nakazuje, da se lahko NGAL izraža v poškodovanem tubulu, da povzroči ponovno epitelizacijo. Podpora za to idejo izhaja iz nedavne identifikacije NGAL kot beljakovine, ki prenaša železo in je komplementarna transferinu med nefrogenezo (21). Dobro je znano, da je dostava železa v celice ključnega pomena za celično rast in razvoj, kar je verjetno kritično za postishemično regeneracijo ledvic, tako kot med ontogenezo. Ker se zdi, da NGAL veže in prenaša železo (21), je tudi verjetno, da lahko NGAL služi kot ponor železa, ki se izloči iz poškodovanih epitelijskih celic proksimalnih tubulov. Ker lahko NGAL endocitozira proksimalni tubul (K. Mori in J. Barasch, neobjavljena opažanja), bi lahko protein potencialno recikliral železo v celice, sposobne preživetja. To bi lahko spodbudilo rast in razvoj ter odstranilo železo, reaktivno molekulo, z mesta poškodbe tkiva in s tem omejilo citotoksičnost, ki jo povzroča železo. Naši rezultati, ki kažejo na so-lokalizacijo NGAL v PCNA-pozitivnih regenerirajočih in proliferirajočih tubulnih celicah, dodatno podpirajo to hipotezo.

Glavna posledica naših ugotovitev se nanaša na možnost, da so NGAL nov urinski biomarker za ishemičnoledvičnapoškodbaki se ugodno primerja z drugimi opisanimi biomarkerji. Morda je najbolje raziskan primer molekula poškodbe ledvic-1 (KIM-1), domnevna adhezijska molekula, ki sodeluje pri regeneraciji ledvic (43,44). Pri podganjem modelu ishemično-reperfuzijske poškodbe je bilo ugotovljeno, da je KIM-1 reguliran navzgor 24 do 48 ur po začetnem napadu, zaradi česar je zanesljiv, a nekoliko pozen marker poškodbe tubularnih celic. Nedavne elegantne študije so pokazale, da je KIM-1 mogoče zaznati v biopsiji ledvic in urinu bolnikov z ishemično akutno tubularno nekrozo (45). Vendar je bilo to odkrivanje dokumentirano pri bolnikih z ugotovljeno ishemično ledvično okvaro in uporabnost merjenja KIM-1 v urinu za odkrivanje zgodnje subklinične poškodbe doslej ni bila potrjena. V drugem nedavnem primeru je bilo ugotovljeno, da je Cyr61 izločen protein, bogat s cisteinom, ki ga je mogoče zaznati v urinu 3 do 6 ur po ishemični poškodbi ledvic (8). Vendar pa je to odkrivanje zahtevalo stopnjo bioafinitetnega čiščenja s kroglicami heparin-sepharose in tudi po takem čiščenju je bilo očitnih več navzkrižno reagirajočih peptidov. Nasprotno pa naša študija dokazuje, da je bil NGAL zlahka in hitro zaznan kot relativno čisti imunoreaktivni peptid v Western blotih z le 1 l prvega neobdelanega urina po ledvični ishemiji pri miših in podganah. Poleg tega je bil NGAL v urinu očiten tudi po zelo blagi "subklinični" ledvični ishemiji, kljub normalnim nivojem kreatinina v serumu. Poleg tega je odkrivanje NGAL v urinu veliko pred pojavom tradicionalnih markerjev v urinu, vključno z 2- mikroglobulinom in NAG.

Nazadnje je treba omeniti, da je bilo NGAL mogoče zaznati tudi v urinu zgodaj po dajanju cisplatina, v času, ko so bili drugi morfološki in biokemični kazalciledvičnapoškodbaso bili odsotni. Tako lahko povečana regulacija in izločanje NGAL z urinom predstavljata hiter odziv celic ledvičnih tubulov na različne insulte, odkrivanje NGAL v urinu pa lahko predstavlja široko uporabno neinvazivno klinično orodje za zgodnjo diagnozo poškodbe tubulnih celic.

Če povzamemo, naši podatki kažejo, da NGAL predstavlja nov, občutljiv, neinvaziven urinski biomarker za ishemijo ledvic. Pri prihodnjem prevajalskem delu bo pomembno preučiti izražanje NGAL v urinu bolnikov z blagimi in zgodnjimi oblikami ishemičneledvičnapoškodba. Upamo, da bo takšno zgodnje odkrivanje kliničnim zdravnikom omogočilo pravočasno ukrepanje pri ARF, stanju, ki je še vedno povezano s slabo prognozo, za katero so obupno potrebne nove terapije. Poleg tega upamo, da bo tako hitro in preprosto odkrivanje NGAL v urinu pri bolnikih z subtilno, subklinično ishemičnoledvičnapoškodba(npr. z življenjem povezani presadki ledvic, žilni kirurški posegi, kardiovaskularni dogodki) ali subklinične nefrotoksične poškodbe (npr. uporaba kontrastnih sredstev in aminoglikozidov) bodo klinika opozorili, naj izvede manevre, namenjene preprečevanju napredovanja v očitno ARF.

Zahvala

To delo so podprli štipendije Nacionalnega inštituta za zdravje/Nacionalnega inštituta za sladkorno bolezen ter prebavne in ledvične bolezni za PD (DK53289, DK52612) in JB (DK55388 in DK58872).

Cistanche tubulosalahko zdravipoškodba ledvic

Reference
1. Thadani R, Pascual M, Bonventre JV: Akutna odpoved ledvic. N Engl J Med 334: 1448–1460, 1996
2. Star RA: Zdravljenje akutnegaledvičnaneuspeh. Kidney Int 54: 1817–1831, 1998
3. Liaño F, Pascual J: Napovedni dejavniki in točkovanje. V: Akutna ledvična odpoved, uredila Molitoris BA in Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, str. 507–518
4. Molitoris BA: Prehod na terapijo pri ishemični akutni odpovedi ledvic. J Am Soc Nephrol 14: 265–267, 2003
5. Brady HR, Brenner BM, Clarkson MR, Lieberthal W: Akutna odpoved ledvic. V: The Kidney, 6. izdaja, uredil Brenner BM, Philadelphia, WB Saunders, 2000, str. 1201–1262
6. Sutton TA, Molitoris BA: Mehanizmi celične poškodbe pri ishemični akutni odpovedi ledvic. Semin Nephrol 18: 490–497, 1998
7. Sheridan AM, Bonventre JV: Celična biologija in molekularni mehanizmi poškodb pri akutni ishemični bolezniledvičnaneuspeh. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 327–334, 2000
8. Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PST, Craig L, Hu X, Star RA: Zgodnje odkrivanje s cisteinom bogatega proteina 61 (CYR61, CCN1) v urinu po ledvični ishemiji-reperfuzijski poškodbi. Kidney Int 62: 1601–1610, 2002

9. Kurella M, Hsiao LL, Yishida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR: Analiza mikromrež DNK kompleksnih bioloških procesov. J Am Soc Nephrol 12: 1072–1078, 2001

10. Yoshida T, Kurelia M, Beato F, Min H, Ingelfinger JR, Stears RL, Swinford RD, Gullans SR, Tang SS: Spremljanje sprememb v izražanju genov pri ledvični ishemiji-reperfuziji pri podganah. Kidney Int 61: 1646–1654, 2002

11. Supavekin S, Zhanh W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P: Diferencialna genska ekspresija po zgodnji ledvični ishemiji/reperfuziji. Kidney Int 63: 1714–1724, 2003
12. Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, Saito T, Abe K, Saito H, Nakane PK, Nakanishi Y, Koji T: Indukcija apoptoze v ishemijsko-reperfuzijskem modelu mišje ledvice: Možna vpletenost Fas. J Am Soc Nephrol 9: 620–631, 1998
13. Daemen MARC, Van de Ven MWCM, Heineman E, Buurman WA: Vpletenost endogenega interlevkina-10 in faktorja tumorske nekroze pri ledvični ishemiji in reperfuzijski poškodbi. Transplantacija 67: 792–800, 1999
14. Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC: Dodatek gvanozina zmanjša apoptozo in ščitiledvičnadelovanje v primeru ishemične poškodbe. J Clin Invest 108: 1291–1298, 2001
15. Burne NJ, Rabb H: Patofiziološki prispevki fukoziltransferaz pri ledvični ishemiji-reperfuzijski poškodbi. J Immunol 169: 2648–2652, 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM: Indukcija p21WAF1/CIP/SD1 v celicah ledvičnih tubulov vpliva na potek s cisplatinom povzročenega akutnegaledvičnaneuspeh. J Clin Invest 101: 777–782, 1998
17. Shiraishi F, Curtis LM, Truong L, Poss K, Visner GA, Madsen K, Nick HS, Agarwal A: ablacija ali izražanje gena heme oksigenaze-1 modulira s cisplatinom povzročeno ledvično tubularno apoptozo. Am J Physiol 278: F726–F736, 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF posreduje izražanje kemokinov in citokinov terledvičnapoškodbapri nefrotoksičnosti cisplatina. J Clin Invest 110: 835–842, 2002
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: Delno izčrpavanje ATP povzroči apoptozo, posredovano s Fas in kaspazo, v celicah MDCK. Am J Physiol 276: F837–F846, 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: Genski produkt von Hippel-Lindau zavira apoptozo ledvičnih celic prek Bcl-2-odvisnih poti. J Biol Chem 276: 40599–40605, 2001
21. Yang J, Goetz D, Li JY, Wand W, Mori K, Setlik D, Du T, ErdjumentBromage H, Tempst P, Strong R, Barasch J: Pot dostave železa, posredovana z lipokalinom. Mol Cell 10: 1045–1056, 2002
22. Molitoris BA, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Zager RA, Nath KA, Goligorsky MS: Akutna odpoved ledvic II. Eksperimentalni modeli akutne odpovedi ledvic: nepopolni, a nepogrešljivi. Am J Physiol 278: F1–F12, 2000
23. Flower DR, North AC, Sansom CE: Družina beljakovin lipokalina: pregled strukture in zaporedja. Biochim Biophys Acta 1482: 9–24, 2000
24. Kjeldsen L, Cowland JB, Borregaard N: lipokalin in homologni proteini, povezani s humano nevtrofilno želatinazo, pri podganah in miših. Biochim Biophys Acta 1482: 272–283, 2000
25. Xu S, Venge P: Lipokalini kot biokemični označevalci bolezni. Biochim Biophys Acta 1482: 298–307, 2000
26. Hraba-Renevey S, Turler H, Kress M, Salomon C, Weil R: SV40-inducirana ekspresija mišjega gena 24p3 ​​vključuje posttranskripcijski mehanizem. Oncogene 4: 601–608, 1989
27. Cowland JB, Borregaard N: Molekularna karakterizacija in vzorec tkivne ekspresije gena za lipokalin, povezan z nevtrofilno želatinazo, pri ljudeh. Genomika 45: 17–23, 1997
28. Nielson BS, Borregaard N, Bundgaard JR, Timshel S, Sehested M, Kjeldsen L: Indukcija sinteze NGAL v epitelijskih celicah človeške kolorektalne neoplazije in vnetnih črevesnih bolezni. Gut 38: 414–420, 1996
29. Xu SY, Pauksen K, Venge P: Serumske meritve humanega nevtrofilnega lipokalina (HNL) razlikujejo med akutnimi bakterijskimi in virusnimi okužbami. Scand J Clin Lab Invest 55: 125–131, 1995
30. Keatings VM, Barnes PJ: Markerji aktivacije granulocitov v induciranem sputumu v primerjavi med kronično obstruktivno pljučno boleznijo, astmo in normalnimi osebami. Am J Respir Crit Care Med 155: 449–453, 1997
31. Betsuyaky T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M, Venge P, Xu S, Kawakami Y: Proteini zrnc nevtrofilcev v bronhoalveolarni izpiralni tekočini oseb s subkliničnim emfizemom. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985–1991, 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: Človeški nevtrofilni lipokalin je edinstven marker vnetja nevtrofilcev pri ulceroznem kolitisu in proktitisu. Gut 50: 501–506, 2002
33. Chiao H, Kohda Y, McLeroy P, Craig L, Housing I, Star RA: -Melanocite stimulirajoči hormon ščiti predledvičnapoškodbapo ishemiji pri miših in podganah. J Clin Invest 99: 1165–1172, 1997
34. Rabb H, Ramirez G, Saba SR, Reynolds D, Xu J, Flavell R, Antonia S: Ledvična ishemična reperfuzijska poškodba pri miših s pomanjkanjem L-selektina. Am J Physiol 271: F408–F13, 1996
35. Rabb H, Star R: Vnetni odziv in njegove posledice pri akutnemledvičnaneuspeh. V: Akutna ledvična odpoved, uredila Molitoris BA in Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, str. 89–100
36. Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR: Indukcija apoptoze z izločenim lipokalinom, ki je transkripcijsko reguliran z odvzemom IL-3. Znanost 293: 829–834, 2001
37. Persengiev SP, Devireddy LR, Green MR: Inhibicija apoptoze z ATFx: Nova vloga za člana družine ATF/CREB transkripcijskih faktorjev bZIP pri sesalcih. Genes Dev 16: 1806–1814, 2002
38. Ryon J, Bendickson L, Nilsen-Hamilton M: Visoka ekspresija uterokalina/24p3, lipokalina in proteina akutne faze v involucijskih reproduktivnih tkivih. Biochem J 367: 271–277, 2002
39. Izbrisano v dokazovanju.
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: Ekspresija glikodelina v celicah raka dojke MCF-7 inducira diferenciacijo v organiziran acinarni epitelij. Lab Invest 77: 565–573, 1997
41. Witzgall R, Brown D, Schwarz C, Bonventre JV: Lokalizacija proliferirajočega celičnega jedrnega antigena, vimentina, c-fosa in klasterina v postishemični ledvici: dokazi za heterogeni genetski odziv med segmenti nefrona in veliko skupino mitotičnih aktivne in dediferencirane celice. J Clin Invest 93: 2175–2188, 1994
42. Hammerman MR: Rekapitulacija filogenije z ontogenezo v nefrologiji. Kidney Int 57: 742–755, 2000
43. Ichimura T, Bonventre JV, Bailly V, Wei H, Hession CA, Cate RL, Sanicola M: Molekula za poškodbo ledvic-1 (KIM-1), domnevna adhezijska molekula epitelijskih celic, ki vsebuje nov imunoglobulin domene, je po poškodbi v ledvičnih celicah reguliran navzgor. J Biol Chem 271: 4135–4142, 1998
44. Bailly V, Zhang Z, Meier W, Cate R, Sanicola M, Bonventre JV: Izločanje molekule poškodbe ledvic-1, domnevne adhezijske beljakovine, ki sodeluje pri regeneraciji ledvic. J Biol Chem 277: 39739– 39748, 2002
45. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadani R, Bonventre JV: Molekula poškodbe ledvic-1 (KIM-1): nov biomarker za poškodbo proksimalnih ledvičnih tubulov pri človeku. Kidney Int 62: 237–244, 2002