Identifikacija sitoglusida kot potencialnega sredstva za zmanjševanje pigmentacije kože prek mrežne farmakologije

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo, 1 Hongliang Zeng, 2 Chuhan Fu, 1 Jinhua Huang, 1 Jianyun Lu, 1 Yibo Hu, 1 Ying Zhou, 1 Liping Luo, 1 Yushan Zhang, 1 Lan Zhang, 1 Jing Chen, 1 in Qinghai Zeng 1

Veliko tradicionalnih kitajskih zdravil (TKM) zbeljenje koželastnosti so bile zabeležene v receptih Ben-Cao-Gang-Mu in infolk, nekatera literatura pa potrjuje, da imajo njihovi izvlečki potencial za zaviranjepigmentacija. Vendar nobena sistematična študija ni odkrila specifičnih regulativnih mehanizmov potencialnih učinkovin. Namen te študije je bil preveriti sestavine v TCM, ki zavirajo kožopigmentacijaprek mrežnega farmakološkega sistema in raziskati temeljne mehanizme. Identificirali smo 148 potencialnih aktivnih sestavin iz 14 TCM in na podlagi povprečne "stopnje" topoloških parametrov prvih pet TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones in Paeoniae Radix Alba), ki najverjetneje povzročilibeljenje kožeskozi protivnetne procese so bili izbrani. Sitogluside, najpogostejša sestavina v prvih petih TCM, zavira melanogenezo v celicah človeškega melanoma (MNT1) in mišjih melanomskih celicah (B16F0) ter zmanjšuje kožopigmentacijapri ribah cebricah. Poleg tega so mehanične raziskave pokazale, da je sitogluzid sposoben znižatitirozinaza(TYR) z zaviranjem poti ERK in p38 ter zaviranjem aktivnosti TYR. Ti rezultati kažejo, da je mrežna farmakologija učinkovito orodje za odkrivanje naravnih spojin z lastnostmi beljenja kože in določanje njihovih možnih mehanizmov. Sitogluside je nova aktivna sestavina za beljenje kože z dvojnim regulatornim učinkom, ki zaviraTYRizražanje in dejavnost.

Kliknite zaIzvleček Cistanche DHT za beljenje kože

Uvod

Melanin ne samo določa barvo človeške kože, oči in las, ampak ima tudi ključno vlogo pri kamuflaži, mimiki, socialni komunikaciji in zaščiti pred ultravijoličnimi žarki. Ko pa se melanin prekomerno proizvaja in nenormalno porazdeli v povrhnjici, povzroči različne stanj, kot so pege in melazma, ki lahko negativno vplivajo na človekovo zaznano lepoto in družbeno samozavest [1]. Melanin je končni produkt L-tirozina po več stopnjah encimskih reakcij in se sintetizira v melanosomih melanocitov [2]. V koži se melanociti nahajajo v bazalni plasti povrhnjice in lahko proizvajajo in prenašajo zrele melanosome v keratinocite, kar povzroči kožnopigmentacija [3]. TYRje glavni encim, ki omejuje hitrost pri proizvodnji melanina [4], z mikroftalmijo povezan transkripcijski faktor (MITF) pa je glavni transkripcijski faktor, ki uravnava transkripcijsko izražanje TYR [5].

Nedavno so študije pokazale, da imajo vnetni odzivi pomembno vlogo pri uravnavanju melanogeneze [6]. Na primer, IL-18, ki ga proizvajajo Langerhansove celice, dendritične celice in keratinociti v povrhnjici, lahko poveča izražanje TRP{{2 }} (protein 1, povezan s tirozinazo) in TRP-2 (protein, povezan s tirozinazo 2) z aktiviranjem poti p38/MAPK (protein kinaza, aktivirana z mitogenom) in PKA (protein kinaza A), s čimer se spodbuja melanogeneza [7, 8 ]. TNF- zmanjša proizvodnjo melanina B16 predvsem z aktiviranjem NF-κB [9]. Pokazalo se je, da PGe2 (prostaglandin e2), ki ga izločajo fibroblasti in keratinociti, spodbuja diferenciacijo dendritičnih celic in sproži aktivnost TYR v melanocitih prek signalnih poti cAMP (ciklični adenozin monofosfat) in Plc (fosfolipaza c) [10]. PIH (postinflamatorna hiperpigmentacija) je vrsta reaktivne melanizacije kože [11]. Pogosto vodijo različne kožne bolezni, poškodbe ali estetske operacijepigmentacijaprizadetega območja, zlasti pri temnopoltih [12]. Bolniki s PIH običajno prenašajo ogromen psihološki stres, ki v hudih primerih negativno vpliva na kakovost njihovega življenja. Zato se nekatera zdravila, ki uravnavajo vnetje, uporabljajo za zdravljenje PIH in drugih bolezni, ki povzročajo hiperpigmentacijo. Ugotovljeno je bilo na primer, da resveratrol, ki je zmanjšal vnetne poškodbe v celicah HaCaT [13], zavira sintezo melanina prek zunajceličnega uravnavanja signala kinaze 1/2 in signalizacije fosfoinozitid 3-kinaze/Akt [14].

Beljenjesredstva, kot sta hidrokinon (HQ) in vitamin C, se tradicionalno uporabljajo za zdravljenje pigmentacije [15]. HQ je hidroksifenol z močnim zaviralnim učinkom na melanogenezo. Vendar pa je zaradi različnih stranskih učinkov, kot so dražilni ali alergijski kontaktni dermatitis, razbarvanje nohtov in moteno celjenje ran, uporaba HQ omejena [16, 17]. Vitamin C zaviraTYRz medsebojnim delovanjem z bakrovimi ioni na aktivnih mestih TYR, s čimer se zmanjša melanogeneza. Vendar pa je vitamin C v končnih izdelkih nestabilen. Poleg tega, če je koncentracija vitamina C višja od 20 odstotkov, lahko povzroči draženje kože [18]. Zato je veliko povpraševanje po naravnih sestavinah iz širokega spektra virov, ki so varne, učinkovite, zelo stabilne in enostavne za shranjevanje.

Nedavno je bilo ugotovljeno, da je več sestavin TKM učinkovitih pri zaviranju kožepigmentacija, kot sta apigeninin in paeoniflorin [19–21]. TCM z belilno aktivnostjo, opisani v Ben-Cao-Gang-Mu, se pogosto uporabljajo kot skrivni recepti na Kitajskem in dandanes je potrjeno, da imajo učinek zaviranja pigmentacije. Na primer, izvleček Hedysarum multijugum Maxim (korenika Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) povzroči beljenje kože z zaviranjem poti ERK [22]. Suhi izvleček Typhonii Rhizoma (korenika Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano in Hett.) lahko učinkovito zaviratirozinazaaktivnost in vitro [23]. In medicina, ki temelji na dokazih, je tudi potrdila, da se izvleček semena SapindiMukorossi (plod Sapindus mukorossi Gaertn.), ki zavira aktivnost tirozinaze, lahko uporablja kot dodatek zdravilu in kozmetičnim sredstvom [24]. Tudi nekateri tradicionalni ljudski recepti se pogosto uporabljajo, čeprav niso zbrani v zbirki. San-Bai-Tang (SBT) je tipičen primer. Ye et al. dokazali, da lahko SBT zmanjša proizvodnjo melanina z zaviranjem signalne poti p38/MAPK in aktivnosti TYR [25]. Izkazalo se je, da imajo tudi drugi TKM, opisani v nekaterih receptihbeljenje kožeučinki. Izvleček Coicis Semen (semena Coix AquaticaRoxb.) zavira nastajanje melanina z znižanjem MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2 [26]. Poleg tega je test celicTYRje pokazalo, da je Ampelopsis japonica (rizom Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) zaviral aktivnost gobe TYR za več kot 50 odstotkov [27]. Beljenje TCM, zabeleženo v teh starodavnih receptih, je s sodobnimi eksperimentalnimi tehnikami dokazalo učinkovitost, vendar je večina preverjenih v obliki izvlečkov, učinkovine, ki delujejo, pa niso jasne. To je vzbudilo naše zanimanje za aktivne sestavine TCM z zabeleženimi belilnimi učinki. v starodavnih receptih.

Poleg tega imajo TCM ali recepti kompleksne sestavine, različne načine delovanja in neznane aktivne sestavine. Poleg tega ima neskladnost dejavnikov, kot so kakovost surovin, metode predelave, tehnike priprave, združljivost sestavin, uporabljenih v sestavku, in dozirne oblike večji vpliv na učinkovitost TKM [19, 28]. Zato je uporaba nekaterih TCM zbeljenje kožeučinki so omejeni. Zato je nujno identificirati aktivne sestavine s potencialnimi belilnimi učinki na koži s sistematičnim pregledovanjem, da se zagotovi varnost, učinkovitost in stabilnost teh sestavin.

V zadnjih letih je uporaba sistemske biologije na področju TKM zelo napredovala. Mrežna farmakologija TKM je nova meddisciplina, ki združuje farmakologijo TKM z mrežno znanostjo, sistemsko biologijo, računalniško znanostjo in bioinformatiko [29]. Popolnoma razume kompleksnost med zdravili, boleznimi in biološkimi sistemi z vidika mreže "kompleks-protein/gen-bolezen" [30]. Mrežna farmakologija je učinkovito in sistematično orodje za preučevanje farmakološkega delovanja, mehanizma, varnosti in drugih vidikov zeliščne medicine, zlasti TCM, in zagotavlja dragocene vpoglede za trenutno odkrivanje zdravil [31, 32].

sestavine za beljenje kože

2. Materiali in metode

2.1. Mrežni farmakološki proces

2.1.1. Gradnja baze podatkov za kemične sestavine

Diagram poteka proučevanega eksperimentalnega programa je prikazan na sliki 1. TKM z učinki proti pigmentaciji, opisani v Ben-Cao-Gang-Mu in v ljudskih receptih, so bili uporabljeni za mrežno farmakološko analizo. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones in Sapindi MukorossiSemen, opisani v Ben-Cao-Gang-Mu, imajobeljenjein zmanjševanje rumenosti ter lahko odstrani obrazne lise in madeže. Poria cocos (Schw.) Wolf (sklerocij Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba in Atractylodes macrocephala Koidz (rizom Atractylodes macrocephalaKoidz.), ki so sestavine SBT, so znani po tem, da izboljšujejo teksturo kože in zmanjšujejo kloazmo inpigmentacija. Druga tradicionalno zabeležena zelišča, kot je Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (korenika Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (korenika Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. in Hook.f. ex Franch. and Sav.), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (korenika Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi in Coicis Semen so bili prav tako vključeni v to študijo. Zaradi velikega števila TKM, vključenih v to študijo, bo več pregledov baze podatkov kitajske medicine povzročilo zmedo pri obdelavi podatkov. Uporabljamo samo zbirko podatkov o farmakoloških sistemih tradicionalne kitajske medicine (TCMSP), pogosteje uporabljeno zbirko podatkov, za nadaljnji pregled. Kemične sestavine teh TCM so bile preiskane v TCMSP (posodobljeno 24. aprila, 2020) [33]. Podobnost zdravilu (DL) in peroralna biološka uporabnost (OB) sta pogosto uporabljena presejalna parametra. Lokalna ali sistemska zdravila so običajna zdravila za kožne pigmentne bolezni; zato smo kot presejalni kriterij uporabili le DL. Odlični kompleksi z DL > 0:18 so bili izbrani za povečanje stopnje zadetkov kandidatov za zdravila.

2.1.2. Presek med ciljnimi geni TCM in geni, povezanimi s pigmentacijo.

Nabor genov, povezan zpigmentacijaje bil izbran na podlagi baze podatkov GeneCards (posodobljeno 24. aprila 2020), iz katere so bili izbrani cilji z oceno agene-bolezni > 1. Na koncu je bilo identificiranih 6180 tarč, povezanih s pigmentacijo. Presečišče med ciljnimi geni TCM in geni, povezanimi s pigmentacijo, je bilo ponazorjeno z Vennovim diagramom [34].

2.1.3. Konstrukcija mreže Active Compound-Target-PathwayNetwork.

Učinkovine in regulirani ciljni geni so bili pregledani glede na rezultate Vennovega diagrama. Omrežje je bilo zgrajeno s programsko opremo Cytoscape [35] in je bilo uporabljeno za označevanje razmerja med aktivnimi spojinami TCM in ciljnimi genipigmentacija.Vsak ciljni gen, ki ga regulira aktivna sestavina v aTCM, je veljal za eno "stopnjo." Povprečni "stopenjski" topološki parametri vsakega TCM so bili uporabljeni za ovrednotenje pomembnosti izbranih TCM. Spojine so bile razvrščene in pet najboljših TCM je bilo izbranih za ključne analize. Poleg tega so bile analizirane podrobne informacije o potencialnih aktivnih sestavinah, ki naj bi uravnavale pigmentacijo.

2.1.4. Kjotska enciklopedija genov in genoma (KEGG) Analiza obogatitve ciljnih genov, ki jih regulirajo potencialno učinkoviti TCM.

Ciljni geni, ki jih uravnava pet najboljših TCM, so bili izbrani za določitev ciljnih poti KEGG in raziskovanje možnih mehanizmov potencialno učinkovitih sestavin v teh TCM protipigmentacija.DAVID bioinformatični viri 6.8 so bili uporabljeni za analizo obogatitve ciljnih poti KEGG. Naloženi so bili genski simboli potencialnih tarč učinkovitih učinkovin. Pridobljene genske identifikatorje smo nato prenesli in vnesli v KOBAS3. Izbran je bil gen, ki je prilagodil vrednosti p manj kot 0.05.

2.1.5. Simulacija molekularnega priklopa.

2D strukture sitogluzida, arbutina, nikotinamida, HQ, kojične kisline in askorbinske kisline so bile pridobljene iz baze podatkov PubChem. Mehanske strukture majhnih molekul so bile optimizirane z uporabo ChemBio3D Ultra 14.0. 3D kristalna struktura gobTYR(PDB ID: 2Y9X, koordinate priklopa: X =−8:87, Y=−30:74 in Z=−41:52) je bilo pridobljeno iz Protein Data Bank ( PDB) baze podatkov [36]. 3D kristalne strukture šestih membranskih receptorjev (opioidni u receptor, PDB ID: 4DKI; melanokortin 1 receptor, PDB ID: 2L1J; endotelin B receptor, PDB ID: 5GLI; adrenergični receptor, PDB ID: 4GBR; prostaglandinski receptor, PDB ID: 6D26 ; receptor faktorja izvornih celic, PDB ID: 2EC8) so bili pridobljeni iz baze podatkov PDB. Proteinske strukture so bile pripravljene z uporabo orodja AutoDock Tools z odstranitvijo vodnih molekul, dodajanjem vodikov in ustvarjanjem vezi ničelnega reda na kovine in disulfidnih vezi. Nazadnje so bile izvedene simulacije molekularnega priklopa z uporabo AutoDock Vina 1.1.2 [37], rezultati pa so bili analizirani z uporabo PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Eksperimentalna validacija

2.2.1. Kemikalije in protitelesa.

Sitogluside (čistost večja ali enaka 98 odstotkom) je bil kupljen pri ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Dimetilsulfoksid (DMSO) je bil kupljen pri Sigma-Aldrich. Nevtralni paraformaldehid (4 odstotki) je bil kupljen pri Biosharp (Hefei, Kitajska). Kojična kislina, Fontana-Masson Stain Kit, natrijev deoksiholat in L DOPA so bili kupljeni pri Solarbio (Peking, Kitajska). Dulbeccov spremenjeni Eagleov medij (DMEM) je bil kupljen pri Gibco (#C11995500BT, Gibco). Fetalni goveji serum (FBS) in komplet za štetje celic -8 (CCK8) sta bila kupljena pri BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izrael). PMA (12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat, aktivator ERK/MAPK) je bil kupljen pri APExBIO (#N2060, APExBIO). Anizomicin (aktivator p38/MAPK) je bil kupljen pri MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Primarna protitelesa proti ras-sorodnemu proteinu Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), zunajcelični signalno regulirani kinazi (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-terminalna kinaza JNK (#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP odzivni protein, ki veže elementCREB ( #9107, CST) in p-CREB (#9198, CST) sta bila kupljena pri Cell Signaling Technology. Primarna protitelesa proti TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058,Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory),TYR(BS1484, Bioworld) in GAPDH (#AP0066, Bioworld) sta bila kupljena pri Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory oziroma Bioworld.

2.2.2. Celična kultura in zdravljenje.

MNT1 in B16F0, ki sta bogata z melanosomi, se pogosto uporabljata za preučevanje melanogeneze [38]. Posledično sta bili ti dve celični liniji izbrani za nadaljnje poskuse. Celice MNT1 in B16F0 smo gojili v 20- ali 10-odstotnem fetalnem govejem serumu (BiologicalIndustries, Izrael) in 1-odstotnem penicilin-streptomicinu (Gibco) v DMEM. Vse celice so bile gojene v mokrem inkubatorju pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. Sitogluzid smo raztopili v DMSO in končna koncentracija DMSO je bila<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Gojenje in zdravljenje cebric.

Zarodki cebrice in gojišče so bili kupljeni pri EzeRinka Biotech (Nanjing, Kitajska). Eksperimentalni protokol je odobril odbor za etiko tretje bolnišnice Xiangya univerze Central South (št. 2021-S137). Prvi dan po izvalitvi so zebrice gojili v 12-plošči z vdolbinicami (10 perwell), zaščiteno pred svetlobo in gojili pri 37 stopinjah. Ribe cebrice so bile obdelane z različnimi koncentracijami sitogluzida in z invertnim mikroskopom v 24-urnih intervalih so bile posnete fotografije, da bi zabeležili spremembe melanina v repih rib cebric. Po slikanju so raztopine sitogluzida različnih koncentracij odčitavali in beležili neprekinjeno en teden.

2.2.4. Viabilnost celic.

Preživetje celic je bilo ocenjeno z uporabo CCK8.MNT1 in celice B16F0 so bile nanesene v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 2000 celic/vdolbinico ali 500 celic/vdolbinico. Celice smo obdelali z različnimi koncentracijami sitogluzida (25, 50, 100, 200, 400, 600 in 800 μM). Po 24 ali 48 urah smo v vsako vdolbino dodali 10 μL reagenta CCK8 in celice inkubirali pri 37 stopinjah 1 uro. Ko se je medij obarval oranžno, smo gojenje prekinili in za merjenje absorbance pri 490 nm uporabili čitalnik mikroplošč (PerkinElmer EnVision Xcite, UK).

2.2.5. Fontana-Massonovo barvanje melanina.

Celice so bile kultivirane v 6-plošči z vdolbinicami in obdelane z različnimi koncentracijami sitogluzida 2 dni, dodana pa je bila kojična kislina kot pozitivna kontrola pri 200 μM. Celice smo nato za 15 minut dali v 4-odstotni paraformaldehid. Po izpiranju z vodo smo celice inkubirali z raztopino amoniaka in srebra Fontana 24 ur v temni komori, splaknili z vodo in nato dali v hiposulfit za dodatnih 5 minut. Za opazovanje melanina smo uporabili invertni mikroskop.

2.2.6. Eksperiment za obnovitev funkcije.

PMA, kot priznani aktivator ERK/MAPK [39, 40], je bil testiran na citotoksičnost s poskusom CCK8 pri različnih koncentracijah (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 in 800 ng/mL) 24 ur. In potem, ko so bile celice MNT1 in B16F0 obdelane z različnimi koncentracijami (25, 50 in 100 ng/mL) PMA 2 uri, je bila stopnja fosforilacije ERK odkrita s poskusom westernblotting. Pri izbrani koncentraciji so bile celice obdelane z 0, 1, 2, 4, 6 in 8 urami, da bi odkrili učinkovit čas aktivacije. Potem ko so bile celice 48 ur obdelane s sitogluzidom (200 μM) in PMA (25 ng/mL) (ponovno tretiranje vsakih 8 ur), so bile ravni beljakovinTYRin p-ERK. Fontana-Massonovo barvanje z melaninom je zaznalo vsebnost melanina. Anizomicin [41] je aktivator p38/MAPK, katerega raziskovalna koncentracija je 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 in 512 nM, druge eksperimentalne metode pa so enake kot pri PMA.

2.2.7. Meritve aktivnosti TYR.

Celice smo 2 dni obdelali z različnimi koncentracijami sitogluzida. Po prebavi in ​​centrifugiranju smo celice prešteli in dvakrat resuspendirali v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS). Nato smo vsakemu vzorcu dodali 500 μl 0,5-odstotne raztopine natrijevega deoksiholata. Vzorci so bili inkubirani pri 4 stopinjah 10 minut in nato pri 37 stopinjah 15 minut. Dodali smo 1 ml 1-odstotne raztopine L-DOPA, nato pa 200 μL takoj odpipetirali v 96-ploščo z vdolbinicami. Nato smo uporabili večmodni čitalnik plošč za merjenje vrednosti absorbance (A0) pri 475 nm in meritev ponovili po 30 minutah (A30).TYRaktivnost je bila izračunana kot (A{{0}}A0)/število celice.

2.2.8. Sonda aktivnosti TYR.

Fluorescenčna sonda za skoraj infrardečo svetloboTYRaktivnost, ki temelji na resorufinu, je bila uporabljena za vizualizacijo aktivnosti v živih celicah, kot je opisano prej [42]. Na kratko, celice MNT1 in B16F0 smo gojili v 6-vdolbinski plošči in 2 dni obdelali z različnimi koncentracijami sitogluzida . Dodali smo 10 μM fluorescenčno sondo in po 4 urah celice nadomestili s PBS. Potem ko je bila rdeča svetloba vznemirljiva, so za fotografiranje takoj uporabili fluorescentni invertni mikroskop.

2.2.9. Ekstrakcija beljakovin in Western blotting.

Potem ko so bile celice 2 dni obdelane z različnimi koncentracijami sitogluzida, je bil celoten celični protein ekstrahiran z uporabo liznega pufra RIPA (Thermo Fisher) in koktajlov zaviralca proteaze in zaviralca fosfataze (Roche). Koncentracijo beljakovin smo določili s kompletom za testiranje beljakovin BCA (KeyGEN Biotec). Po blokadi z 1 odstotkom BSA so primarna protitelesa protiTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 in p-p38 smo inkubirali z membranami čez noč pri 4 stopinjah pri 1:1000 in GAPDH pri 1:3000 Membrane smo sprali s TBS-T in inkubirali s kozjim anti-kunčjim sekundarnim protitelesom pri 1:3000 1 uro. Vezavno protitelo smo odkrili z elektrokemiluminiscenco (ECL).

2.2.10. Statistična analiza.

Za statistično analizo je bila uporabljena programska oprema SPSS22.0, za primerjave več skupin pa je bil uporabljen Studentov t-test ali enosmerna analiza variance (ANOVA). Mann-Whitneyjev U test je bil uporabljen za neparametrične podatke. p < 0:05="" je="" v="" vseh="" primerih="" veljalo="" za="" statistično="" pomembno.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" in="" ∗p=""><>

3. Rezultati

3.1. Sestavljene sestavine TCM.

Proučevanih je bilo 14 TCM, zapisanih v Ben-Cao-Gang-Mu in v ljudskih receptih, z učinki proti pigmentaciji. Skupno 372 sestavin kitajske medicine iz 14 TCM je bilo pridobljenih iz baze podatkov TCMSP (dodatna tabela S1).

3.2. Ciljni geni, ki jih regulirajo TCM, in sorodni pigmentacijski geni.

Glede na ciljni napovedni sistem v podatkovni bazi TCMSP je bilo pridobljenih skupno 834 ciljnih genov iz 14 TCM. Skupaj 9431 genov, povezanih zpigmentacijaso bili pridobljeni iz podatkovne baze GeneCards, od katerih je bilo izbranih 6180 z oceno ustreznosti > 1.

3.3. Razvrstitev 14 TCM in Disease-Compound-TargetNetwork.

S programsko opremo Cytoscape smo vzeli presečišče regulatornih genov vsake TCM in genov, povezanih s pigmentacijo, ter pridobili potencialne aktivne sestavine in skupne ciljne gene. Nato je ciljno omrežje spojine bolezni med TCM inpigmentacijaje bil zgrajen. Na podlagi tega smo pridobili povprečno "stopnjo" vsake aktivne sestavine in TKM razvrstili glede na njihove rezultate. Glede na rezultate uvrstitve je bilo najboljših 5 zelišč Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones in Paeoniae Radix Alba (slika 2(a)). Z analizo KEGG 220 ciljnih genov prvih 5 TCM je bilo 19,3 odstotka genov bogatih s signalno potjo PI3K-Akt, 13,6 odstotka genov je bilo povezanih s signalno potjo TNF in približno 12,3 odstotka genov je bilo povezanih z IL{{ 12}}. Poleg tega je bilo 37 genov vključenih v pot MAPK in 28 genov v pot HIF-1. Te poti so tesno povezane z uravnavanjem presnove melanina in fotostaranjem kože. Med 20 najbolj obogatenimi signalnimi potmi je ena četrtina teh poti, povezanih z vnetjem (slika 2(c)). Slike 2(d)–2(h) prikazujejo mrežo spojine-tarče bolezni med Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba oziroma pigmentacijo. Glede na Vennov diagram sestavin v prvih petih TCM smo ugotovili, da štirje TCM vsebujejo sitogluzid in beta-sitosterol (slika 2(b), dodatna tabela S2).

3.4. Potencialne aktivne sestavine pri zaviranju pigmentacije.

Glede na ciljno mrežo spojin proti boleznim je 148 sestavin povezanih zpigmentacijaso bili pridobljeni iz 14TCM. Preiskava literature je pokazala, da 25 od 148 sestavin zavira melanogenezo. Poročali so o štirih aktivnih sestavinah kot rastlinskih izvlečkih, ki zavirajo melanogenezo. Raziskanih je bilo štirinajst aktivnih sestavin in poročali so, da njihovi derivati ​​uravnavajo pigmentacijo. Zanimivo je, da štiri sestavine spodbujajo melanogenezo, medtem ko mehanizem šestih sestavin za uravnavanje melanogeneze še vedno ni jasen. Preostalih 95 potencialnih kitajskih zdravilnih sestavin še ni raziskanih za uravnavanje pigmentacije. Podrobne informacije o teh sestavinah so navedene v dodatni tabeli S3.

3.5. In vitro in in vivo učinki sitogluzida na melanogenezo.

Po zgornjem postopku presejanja smo ugotovili, da štirje TKM v najvišjih TKM vsebujejo sitogluzid in -sitosterol. Poročali so, da -sitosterol inhibitalfa-melanocite stimulirajoči hormon (-MSH) spodbuja melanogenezo prek signalne poti p38 v celicah melanoma B16F10 [43]. Vendar pa o učinkih sitogluzida proti pigmentaciji in njegovem specifičnem mehanizmu niso poročali. Zato smo izbrali sitogluzid kot kandidata za zdravilo za te študije. Test CCK8 je bil izveden za raziskovanje potencialnih toksičnih koncentracij sitogluzida v celicah MNT1 in B16F0. Rezultati so pokazali, da sitogluzid ni imel očitnega učinka na proliferacijo celic (sliki 3(a) in 3(b)) pri koncentracijah pod 400 μM. Barvanje z melaninom, opravljeno z uporabo 25, 50, 100 in 200 μM sitogluzida, je pokazalo, da lahko sitogluzid zmanjša vsebnost melanina v celicah MNT1 in B16F0 na način, ki je odvisen od odmerka (slika 3(c)). Poleg tega je zdravljenje s sitogluzidom znatno zaviralo kožopigmentacijapri ribah cebricah na način, ki je odvisen od časa in odmerka (slika 3(d)). Ti rezultati kažejo, da sitogluzid zavira melanogenezo in vitro in in vivo.

3.6. Učinki sitoglusida na izražanje TYR.

Iz prejšnjih rezultatov lahko sitogluzid učinkovito zmanjša vsebnost melanina, toda kako uravnava ta proces, še ni znano in je zato zanimivo. Western blot je bil izveden za odkrivanje ekspresije genov, povezanih z melanogenezo (TYR,MITF, TRP1, TRP2 in RAB27A) na ravni beljakovin. Rezultati analiz so pokazali, da je bila ekspresija TYR znatno zmanjšana, ekspresiji MITF in TRP1 pa sta bili po zdravljenju s sitoglusidom zmerno znižani. (Slika 4(a)). Ker sta MAPK in PKA ključni signalni poti navzgor, ki uravnavata TYR, smo nadalje raziskali spremembe ključnih proteinov v teh dveh poteh. Po tem, ko smo celice MNT1 in B16F0 2 dni zdravili s sitogluzidom, so bile ravni fosforilacije ERK in P38 občutno znižane , medtem ko ni bilo pomembnih sprememb skupnih ravni proteinov CREB, ERK, JNK in p38 ali ravni fosforilacije JNK in CREB (slika 4 (b), slika S1A). Glede na rezultate eksperimenta CCK8 smo ugotovili, da PMA pod 100 ng/mL ni toksičen za obe celici (slika S1B), 25 ng/mL PMA pa lahko očitno poveča raven fosforilacije ERK. Stopnja fosforilacije ERK se je po 4 urah postopoma zmanjšala (slika S1C-D). Z melaninskim barvanjem po Fontana-Massonu smo ugotovili, da lahko PMA znatno poveča vsebnost melanina v celicah MNT1 in B16F0. Rezultati westernblottinga tudi kažejo, da lahko PMA poveča raven fosforilacije ERK, sitogluzid pa lahko zmanjša raven fosforilacije ERK, ki jo regulira PMA. Z zaviranjem ravni fosforilacije ERK in zmanjšanjem ravni beljakovinTYR, sitogluzid zmanjša vsebnost melanina, povečano s PMA (sliki 4(c) in 4(e), slika S2A). Hkrati smo ugotovili, da ima anizomicin podobne rezultate. Anizomicin pod 8 nM ni toksičen za obe celici, 2 nM anizomicin pa lahko znatno poveča raven fosforilacije p38. Po 8 urah je raven fosforilacije p38 še vedno visoka (slika S1B, slika S1E-F). Rezultati Fontana-Massonovega melaninskega obarvanja in western blottinga tudi kažejo, da lahko sitogluzid zavre raven fosforilacije p38, ki jo regulira anizomicin, zmanjša vsebnost proteina TYR in zavirapigmentacija(Sliki 4(d) in 4(f), Slika S2B). Zato lahko sitogluzid zmanjša izražanje TYR z zaviranjem poti ERK/MAPK in p38/MAPK. Vendar mehanizem, s katerim sitogluzid zavira te signalne poti, ostaja nejasen. Sledili smo zgornjim membranskim receptorjem teh signalnih poti in uporabili molekularno priklop, da bi raziskali mehanizem uravnavanja spodnjih poti. Energije vezave med sitogluzidom in šestimi membranskimi receptorji, tj. opioidom u, melanokortinom 1, faktorjem matičnih celic, endotelinom B, adrenergičnimi in prostaglandinskimi receptorji, so bile -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 oziroma 0 kal/mol. Z molekularnim priklopom smo ugotovili, da ima sitogluzid med šestimi membranskimi receptorji zelo visoko afiniteto z opioidom u, melanokortinom 1 in receptorji rastnega faktorja matičnih celic (slika 4(g)). Špekuliramo, da sitogluzid lahko zavira poti ERK/MAPK in p38/MAPK z vezavo na prej omenjene membranske receptorje, s čimer zmanjša izražanje TYR.

3.7. Vpliv sitoglusida na aktivnost TYR.

OdTYRje ključni encim pri sintezi melanina, je najbolj pomembna tarča za zaviranje melanogeneze. Večina komercialno dostopnih kozmetičnih izdelkov ali sredstev za posvetlitev kože, kot so HQ, arbutin in kojična kislina, so zaviralci TYR. Uporabili smo sitogluzid in nekaj klinično uporabljenihbeljenje kožesredstva (arbutin, nikotinamid, kojična kislina, HQ in askorbinska kislina) za izvajanje molekularnega spajanja s TYR. Podrobne interakcije med sitoglusidom in zgoraj omenjenimi učinkovinami zTYRso prikazani na sliki 5(a). Energije vezave teh šestih spojin so bile -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 in {{ 11}}.4 kcal/mol. Na splošno velja, da če je afinitetna energija -4, to kaže na silo vezave, če pa je večja ali enaka -7.0, to kaže na močno silo vezave. Stran Sitoglu je bila uvrščena na drugo mesto po afiniteti, nekoliko šibkejša od arbutina, ki kaže razmeroma izjemno sposobnost kombiniranja.

Istočasno je bil za odkrivanje aktivnosti TYR uporabljen poskus pretvorbe L-DOPA, pri čemer je bila kot pozitivna kontrola uporabljena kojična kislina. Rezultati so pokazali, da sitogluzid zavira aktivnost TYR v celicah MNT1 in B16F0 na način, ki je odvisen od koncentracije, skupina z visoko koncentracijo (200 μM) pa je pokazala enakovreden zaviralni učinek, kot ga je pokazal 200 μM kojic kisline (sliki 5(b) in 5(c)). Poleg tega so rezultati eksperimenta s sondo TYR pokazali, da se je z večanjem koncentracije sitogluzida intenzivnost fluorescence v celicah postopoma zmanjševala in je bila intenzivnost fluorescence skupine z visoko koncentracijo blizu tiste pri 200 μM kojične kisline v celicah MNT1 in B16F0 (slika 5(d), slika S2C). Ti rezultati kažejo, da lahko sitogluzid učinkovito zaviraTYRaktivnost v celicah MNT1 in B16F0. Poleg tega špekuliramo, da lahko sitogluzid, kot naravna sterolna spojina, neposredno prodre v celično membrano in se veže na TYR ter zavira njegovo aktivnost in s tem zavira melanogenezo.

4. Razprava

V tej študiji smo uporabili mrežno farmakologijo za raziskovanje potencialnih mehanizmovbeljenje kožesestavine, ki jih najdemo v 14 TCM, dokumentiranih v receptih Ben-Cao-Gang-Mu in narodnih receptih, pri zaviranjupigmentacija. Študija je predlagala tudi inovativno metodo, ki uporablja topološki parameter povprečne "stopnje" vsake aktivne sestavine za oceno potencialne učinkovitosti zelišč. Glede na povprečno "stopnjo" so bili izbrani Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones in Paeoniae Radix Alba, z analizo obogatitve KEGG genov, ki jih uravnava teh pet TCM, pa je bilo nepričakovano, da je 25 odstotkov obogatenih signalne poti so bile povezane z vnetjem, vključno s signalnimi potmi IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt in MAPK.

Pred kratkim je bilo dokazano, da različni vnetni mediatorji aktivirajo ali zavirajo z melanogenezo povezane signalne poti, ki spodbujajo ali zavirajo kožopigmentacija[6]. Gojene celice melanoma B16F10, TNF- zmanjšajo izražanjeTYRter aktivnost TRP1 in TYR na način, ki je odvisen od odmerka [44]. IL-17 in TNF- lahko zmanjšata izražanje z melanogenezo povezanih genov v melanocitih, IL-17 pa lahko znatno poveča zaviralni učinek TNF- na melanogenezo. Po zdravljenju z etanerceptom (anti-TNF) so bili geni, povezani z melanogenezo, v kožnih lezijah bolnikov s psoriazo znatno povečani [45]. Poročali so, da HIF-1, močan transkripcijski faktor, ki uravnava vnetni odziv, sodeluje pri uravnavanju dejavnikov, kot sta IL-17 in TNF- [46–48]. Zato je verjetno, da HIF-1 sodeluje pri uravnavanju melanogeneze z vplivanjem na vnetje. Drugi citokini, kot so IL-18, IL-33, GM-CSF in IL-1 lahko spodbuja melanogenezo z aktiviranjem PKA, MAPK ali drugih signalnih poti, medtem ko IFN-, IL-1, IL-4 in IL-6 zmanjšajo melanogenezo z zaviranjem STAT1, NF-κB, in JAK2-STAT6 signalne poti [6]. Naše ugotovitve kažejo, da lahko prvih pet TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones in Paeoniae Radix Alba) delujejo proti pigmentaciji predvsem prek protivnetnih poti. Prejšnja literatura je tudi omenjala, da ima teh pet najboljših TCM močne protivnetne učinke in učinke proti staranju [49, 50]. To tudi podpira našo domnevo, da lahko TCM igrajo nezanemarljivo vlogo pri povnetni pigmentaciji.

Med pregledovanjem literature o 148 sestavinah, ki jih najdemo v 14 TCM, smo ugotovili tudi, da je bilo med 35 prijavljenimi sestavinami za skoraj 70 odstotkov potrjeno, da zmanjšajo vsebnost melanina ali zavirajo aktivnost TYR. To ne samo potrjuje, da so zapisi o receptih za beljenje kože v starodavnih knjigah v veliki meri zanesljivi, ampak tudi kaže, da je sklicevanje na starodavno literaturo zanesljiva metoda za pridobivanje znanja o tradicionalnih kitajskih tehnikah. Še vedno je 95 neraziskanih spojin, ki se lahko uprejopigmentacija. Z analizo Vennovih diagramov prvih petih TCM je bilo pridobljenih 13 pogostih sestavin. Med njimi so in vitro poskusi potrdili, da lahko daidzein, rutin in (plus) -katehin zmanjšajo vsebnost melanina [51–53]. Saharoza moti pravilno zorenje melanosoma. z indukcijo osmotskega stresa in zaviranjem poti kinaze PI3, s čimer moti melanogenezo [54]. Kvercetin zmanjša melanogenezo, ki jo povzroča oksidativni stres [55]. Poleg tega so kemijske in fizikalne metode, kot so spektroskopske analize in analize strukturne aktivnosti, potrdile, da lahko lupeo in kaempferol zavirataTYRin zmanjša melanogenezo [56, 57]. To kaže, da je mrežna farmakologija morda izvedljiva metoda za odkrivanjebeljenjesestavine. Štirje TCM v prvih petih TCM so vsebovali sitogluzid in ni poročil o tem, ali sitogluzid uravnava pigmentacijo ali z njo povezan mehanizem. Zato smo za te študije izbrali sitogluzid.

Poročali so, da ima sitogluzid, sterolni glikozid, ki je široko prisoten v rastlinah, protitumorske, antioksidativne in nevroprotektivne učinke [58–60]. V tej študiji smo odkrili, da sitogluzid učinkovito zmanjša vsebnost melanina in vitro in in vivo. Poznejši poskusi so dokazali, da lahko bistveno zmanjša izražanje TYR. Kojična kislina je bila uporabljena kot pozitivna kontrola in lahko tudi zavira nivoje beljakovin genov, povezanih z melanogenezo, kot so TYR,MITF in TYRP1 pod stimulacijo -MSH, o čemer so poročali Jeon et al. [61]. Glede na odsotnost eksogene stimulacije je imela 200 μM kojična kislina le zmerne zaviralne učinke na izražanje genov v naši študiji, a ker ima kojikacid veliko zaviralno aktivnost na tirozinazo, jo v tej študiji še vedno uporabljamo kot pozitivno kontrolo. Poročali so, da je izražanje TYR neposredno ali posredno regulirano s potmi MAPK ali PKA. Potrjeno je, da ima čedalje več sestavin belilni učinek na kožo z zaviranjem signalne poti MAPK. Fargesin na primer zmanjša izražanjeTYRz zaviranjem poti P38/MAPK [62]. Polisaharidi Ganoderme lucidum se lahko uprejo melanogenezi, povzročeni z UVB, tako da znižajo pot MAPK [63]. Naša študija je pokazala, da ima sitogluzid v koncentraciji 200 μM potencial za zmanjšanje izražanja TYR z zaviranjem signalnih poti ERK/-MAPK in P38/MAPK. O tem so poročali prek molekularnega spajanja med zgornjimi membranskimi receptorji poti MAPK [64] in sitogluzidom. Ugotovili smo, da se sitogluzid močno veže na opioid u, melanokortin 1 in receptorje rastnega faktorja matičnih celic. Zato špekuliramo, da lahko sitogluzid interagira s temi membranskimi receptorji, zavira signalne poti ERK/MAPK in P38/MAPK ter zmanjša izražanje TYR.

Ker je TYR ključni encim pri sintezi melaninskih delcev v melanocitih, je zaviranje aktivnosti katalitičnega mesta TYR bistveno za zmanjšanje kožnihpigmentacija[65]. Številna sredstva za posvetlitev kože na trgu so zaviralci TYRactivity, kot so HQ, arbutin in kojična kislina. V tej študiji smo uporabili molekularno spajanje, da bi raziskali učinke vezave sitogluzida in petih pogostihbeljenje kožeaktivne sestavine (arbutin, nikotinamid, kojična kislina, HQ in askorbinska kislina) [66] zTYR. Rezultati so pokazali, da ima sitogluzid močno vezavno afiniteto s TYR, šibkejšo od arbutina, a močnejšo od kojične kisline, nikotinamida, HQ in askorbinske kisline. Arbutin je predzdravilo HQ in naravni proizvod, ki lahko zmanjša ali zavre sintezo melanina z zaviranjem TYR. Vendar pa je naravna oblika arbutina kemijsko nestabilna in se lahko pretvori v HQ, ki se katalizira in presnavlja v metabolite benzena s potencialno toksičnostjo za kostni mozeg [67]. Uporaba kojične kisline v kozmetiki je omejena zaradi njene rakotvornosti in nestabilnosti med shranjevanjem [68]. Zato se pričakuje, da bo sitogluzid, naravna sterolna spojina, pridobljena iz različnih rastlin, deloval kot močno sredstvo za posvetlitev kože. Vendar pa je topnost sitogluzida v DMSO nizka, kar je tudi pomanjkljivost te naravne sestavine. Naknadno eksperimentalno preverjanje je pokazalo, da je sitogluzid varen v celičnih linijah MNT1 in B16F0 in da je imela skupina z nizko koncentracijo dober zaviralni učinek na aktivnost TYR, medtem ko je imela skupina z visoko koncentracijo enak učinek kot enaka koncentracija kojične kisline. Zato se lahko sitogluzid terapevtsko uporablja kot regulator beljenja kože, ki ne le zmanjša izražanje TYR, ampak tudi zavira njegovo aktivnost (slika 6).

5. Sklepi

Mrežna farmakologija je morda učinkovito orodje za odkrivanje naravnih učinkovin, ki zmanjšujejo pigmentacijo kože, in njihovih možnih mehanizmov. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones in PaeoniaeRadix Alba imajo potencialbeljenje koželastnosti in lahko zavirajopigmentacijaz uravnavanjem vnetja. Sitogluside je romanbeljenje kožeučinkovina z dvojnim regulatornim učinkom, tj. zaviranjeTYRizražanje in dejavnost.

cistanche tablete