Inhibitorji melanogeneze iz korenike ligusticum sinense v celicah melanoma B16-F10 in vitro in cebrice in vivo

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,† , Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4, Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* in Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Povzetek:Rhizoma Ligusticum sinense, kitajske zdravilne rastline, se že dolgo uporablja kot kozmetično sredstvo zabeljenjein vlaženje kože v starodavni Kitajski. Da bi raziskali antimelanogene sestavine korenike L. sinense, smo izvedliantimelanogenezaanalizo vodeno čiščenje z uporabo semi-preparativne HPLC skupaj s spektroskopsko analizo za določanje aktivnih komponent. Na podlagi metode, vodene z biološkim preizkusom, je bilo izoliranih in identificiranih 24 spojin iz plasti etil acetata metanolnih izvlečkov L. sinense, med njimi 5-[3-(4-hidroksi{{ 7}}metoksifenil)alil]ferulna kislina (1) in cis-4-pentilcikloheks-3-en-1,2-diol (2) sta bili novi spojini. Vse čiste izolate smo podvrgli testu antimelanogeneze z uporabo celic murinemelanoma B16-F10. Razstavljena sta spojina 1 in (3S,3aR)-neoknidilid (8).antimelanogenezaaktivnosti z vrednostmi IC50 78,9 oziroma 31,1 µM, brez očitne citotoksičnosti. Nadaljnje preiskave so pokazale, da je spojina 8 pokazala znatno protipigmentacijsko aktivnost na zarodkih cebric (10-20 µM) v primerjavi z arbutinom (20 µM) in brez kakršne koli citotoksičnosti proti normalnim človeškim epidermalnim keratinocitom. Te ugotovitve kažejo, da je (3S,3aR)-neoknidilid (8) močna antimelanogena in necitotoksična naravna spojina in se lahko potencialno razvije kotbeljenjesredstvo za kozmetične namene.

Ključne besede:Ligusticum sinense; korenika;antimelanogeneza; celica melanoma B16-F10; cebrica;pigmentacija

Kliknite zaCistanche tubulosa prašek za zaviranje melanina

Uvod

Melanin je rjavo-črni pigment, ki je v glavnem odgovoren za barvo kože, las in oči [1]. Melanin je biopolimer in vključuje dva glavna razreda pigmentov v človeški koži, rjavkasto-črni evmelanin in rdečkasto-rumeni feomelanin [1]. Biosinteza melanina je zapleten večstopenjski proces, imenovanmelanogeneza, ki je fiziološki odziv človeške kože za preprečevanje škodljivih učinkov ultravijoličnega (UV) sevanja in okoljskih onesnaževal. Vendar pa lahko čezmerna melanogeneza povzroči temnenje kože, nenormalna hiperpigmentacija pa povzroči različne dermatološke težave, kot so pege, melazma, senilni lentigin in celo kožni rak [2].

Melanin nastaja v membransko vezanih organelih, imenovanih melanosomi, ki so prisotni v specializiranih celicah, imenovanih melanociti. Sinteza melanina se začne s hidroksilacijo L-tirozina v L-dihidroksifenilalanin (DOPA), čemur sledi oksidacija v dopakinon. Obe reakciji katalizira encim tirozinaza, ki omejuje hitrost. V odsotnosti tiolnih substanc se dopakinon ciklizira v levkodopahrom, čemur sledi vrsta oksidoredukcijskih reakcij, ki vključujejo protein, povezan s tirozinazo-2 (Tyrp-2), da nastane vmesni dopakrom in 5,6-dihidroksiindol{ {9}}karboksilna kislina (DHICA). DHICA je podvržena kasnejši oksidaciji, ki jo katalizira Tyrp-1, in polimerizaciji, da nastane eumelanin. Dopakinon prav tako konjugira s cisteinom in glutationom, da nastane cisteinildopa in glutationildopa, ki se postopoma spremenita v feomelanin [1].

Celice, ki obkrožajo melanocite, kot so keratinociti in fibroblasti, sodelujejo pri uravnavanjumelanogeneza[3]. Stalna izpostavljenost UV-sevanju povzroči poškodbe DNK inkeratinocitov in povzroči p53-posredovano navzgornjo regulacijo proopiomelanokortina (POMC). POMC je podvržen posttranslacijskemu cepljenju, da nastane hormon, ki stimulira melanocite (-MSH) in -endorfin. V zameno se -MSH veže na receptor melanokortina 1 (MC1R) na sosednjih melanocitih, kar povzroči uravnavanje cAMP. Povišan cAMP stimulira izražanje z mikroftalmijo povezanega transkripcijskega faktorja (MITF). MITF nato uravnava transkripcijo pigmentacijskih encimov, vključno s tirozinazo, Tyrp-1 in Tyrp-2. UV-sprožena pot sčasoma vodi do sinteze melanina in prenosa melanosomov v keratinocite [4–6]. Poleg zunanjih dražljajev na proizvodnjo melanina vplivajo tudi intrinzični dejavniki, kot so hormonske spremembe, genetske motnje, vnetja in starost [3].

V vzhodni Aziji večina žensk pričakuje, da se bo izognila neenakomerni pigmentaciji kože in si prizadevala za posvetlitev kože. Na primer, arbutin, kojična kislina, azelainska kislina, askorbinska kislina ter izvleček bele murve in korenine sladkega korena so bili uporabljeni kotbeljenjesestavine v kozmetičnih pripravkih [7]. Izkoriščanje učinkovite in preventivne kožebeljenjesredstva iz naravnih virov je zelo zanimiva na kozmetičnem področju, predvsem zaradi relativne netoksičnosti in manj stranskih učinkov [7,8]. Korenika Ligusticum sinenseOliv. (Umbelliferae) se že dolgo uporablja kot tradicionalna kitajska medicina že 2000 let in vse do danes so njene korenine zelo priporočljiv zeliščni čaj [9]. L. sinense, v kitajščini imenovano "Gaoben", znana tudi kot kitajski lovage, so uporabljali za odganjanje vetrov, lajšanje bolečin in revmatičnih artralgij ter lajšanje anemofrigidnega glavobola. Glavna zunanja uporaba L. sinense je za beljenje kože in vlaženje [10]. Do danes poročane kemične sestavine, prisotne v L. sinense, vključujejo terpenoide, ftalidne analoge in fenilpropanoidne glikozide [11–16]. Poročali so, da imajo takšne sestavine številne farmakološke učinke. Na primer, poročali so, da imajo eterična olja iz korenin in korenike L. sinense analgetične, pomirjevalne in protimikrobne učinke [15, 17]. Ligustilid, glavni ftalid, ki ga pogosto najdemo v rastlini Umbelliferae, je pokazal dilatacijski učinek na miometrij in zmanjšal vnetje. in nevrogene bolečine [18]. Dokazano je, da ima knidilid, še en ftalid, ki je v rastlini Umbelliferae veliko ftalidov, antispazmodične in vnetne učinke [19, 20]. Prejšnje študije so pokazale, da je ekstrakt L. sinense zaviralmelanogenezana mišjih celicah melanoma B16-F10 [21]. Vendar pa aktivne komponente za zaviralno aktivnost melanogeneze še vedno niso bile prijavljene.

naravne sestavine

V našem predhodnem biološkem pregledu je bilo ugotovljeno, da so metanolni izvlečki L. sinense pokazaliantimelanogenezaaktivnost v celicah B16-F10 z vrednostjo IC50 50 µg/mL [22], načela antitimealne geneze pa še vedno niso razkrita. Zato smo se odločili raziskati aktivni princip korenike L. sinense z metodo, usmerjeno v biološke teste, kar je vodilo do izolacije in identifikacije dveh novih spojin 1 in 2 skupaj z 22 znanimi spojinami 3–24. Namen tega članka je bil tudi raziskati učinke spojin 1 in 8 na celice melanoma B16-F10 in vitro in ribe cebrice in vivo, oceniti varnost z običajnim človeškim epidermalnim keratinocitnim MTT testom in kvantificirati 1 in 8 v rizomu L. sinense .

2. Rezultati in razprave

2.1. Izolacija in strukturna razlaga

V poskusu izolacije in identifikacijemelanogenezainhibitorjev učinkovito iz aktivnih frakcij, smo uporabili strategijo frakcioniranja, vodeno z biološkimi testi. Metanolni ekstrakt terhizoma L. sinense smo porazdelili, da smo dobili etil acetat, n-butanol in vodotopne plasti. Dobljene tri plasti smo nato testirali na antimelanogenezno aktivnost v celicah mišjega melanoma B16-F10. Mišja celica melanoma B16 je občutljiva, zanesljiva in izvedljiva platforma za presejanje velikega števila majhnih molekularnihmelanogenezaregulatorji [23–25]. Pri koncentracijah 25–100 µg/ml je v etil acetatu topna plast pokazala najmočnejšo zaviralno aktivnost, medtem ko so opazili rahlo inhibicijo bodisi za n-butanol ali vodotopne plasti (slika 1A), kar dokazuje vsebnost melanina v liziranem Celice melanoma B16-F10 (slika 1B). Odprta kolonska separacija plasti etil acetata na silikagelu, ki ji je sledilo čiščenje s HPLC, je dala dve prej neprijavljeni kemični entiteti 1 in 2 (slika 2A) skupaj z 22 znanimi spojinami. Znane spojine so bile označene kot evgenol (3) [26], {{17} }hidroksi-4-metilacetofenon(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-butilheksahidroftalid (5) [28], karvakrol (6) [29], skvalen (7) [30 ],(3S,3aR)-neoknidilid (8) [31], koniferil alkohol 9-metilester (9) [32], bergapten (10) [33], metoksalen (11) [34], metil vanilat ( 12) [35], 2,5-dihidroksi-4-metilacetofenon (13) [36],2-metoksi-4-nitrofenol (14) [37], 2,{{ 55}}dimetoksifenol (15) [38], falkarindiol (16) [39], (9Z)-heptadecen-4,6-diin-1,8-diol (17 ) [40], 3-O-(p-kumaroil)ursolna kislina (18) [41], pregnenolon(19) [42], (9Z,11E,13R)-13-hidroksioktadeka{{79 }},11-dienojska kislina (20) [43], ferulinska kislina (21) [44], koniferilferulat (22) [45], p-hidroksifenetil ferulat (23) [46] in vanilin likovna kislina (24) [47].

Spojina 1, dobljena kot brezbarvno olje, je imela formulo C20H20O6, kot je razvidno iz 13C NMR in HRESI-MS s pozitivnim ionom, ki je pokazal fragmentni ion pri pozitivni HRESI-MS m/z 357,1331 [M plus H] plus (izračunano za C20H21O6, 357.1333). Njegove IR absorpcije pri 3444, 1633 in 1509 cm-1 so pokazale prisotnost hidroksi, olefinske oziroma aromatske funkcionalnosti. V 1H NMR 1,a 1,3,4,5-tetrasubstituiranega aromatskega dela [δH 7,07 (d, J=1,8 Hz, H-6) in 7,22 (d, J=1.8 Hz, H-2)], aromatska funkcionalnost tipa ABX [δH 6.69 (dd, J=7.9, 1.8 Hz, H-60) , 6,74 (d, J=7,9 Hz, H-50) in 6,87 (d, J=1,8 Hz, H-20)], dva trans- medsebojno sklopljeni olefinski protoni [δH 6,33 (d, J=15,9 Hz, H-8) in 7,56 (d, J=15,9 Hz, H-7) ], terminalna alilna skupina [δH 4,99 (ddd, J=17.1, 1.8, 1.8 Hz, H-90a), 5.10, (br d,J=7.6 Hz , H-70), 5,15 (ddd, J=10.1, 1.8, 1.8 Hz, H-90b) in 6.40 (ddd, J=17.1, 10.1 , 7,6 Hz, H-80)] in dve metoksilni resonanci [δH 3,77 (s, 30-OCH3) in 3,92 (s, 3-OCH3)]. Dvajset ogljikovih resonanc, ki jih je mogoče pripisati sedmim neprotoniranim aromatskim ogljikom [δC 126,7 (C-1), 131,2 (C-5), 135,3(C-10), 146,1 (C{{116} }), 148,6 (C-3), 147,2 (C-4) in 148,2 (C-30)], enokislinski karbonil (δC 168,4, C-9), onemetin (δC 48,2, C-70), osem olefinskih metinov [δC 108,9 (C-2), 113,2 (C-20), 115,6 (C-50), 116,1 (C -8), 121,8 (C-60), 123,8 (C-6), 141,5 (C-80) in 146,2 (C-7)], en eksometilen (δC 115,9, C-90) in dva metoksila [δC 56,4 (30-OCH3) in 56,6 (3-OCH3)] so opazili v 13C NMR spektru skupaj s spektrom DEPT 1 ( Tabela 1). Povezljivost 1 je bila nadalje ugotovljena z navzkrižnimi vrhovi δH5,10 (H-70)/δC 113,2 (H-20), 115,9 (H-90), 121,8 (H{{ 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 141,5 (C-80) in 147,2 (C{{ 198}}), δH 7,56 (H-7)/δC 108,9 (C-2), 116,1 (C-8), 123,8 (C-6), 126,7 (C -1) in 168,4 (C-9), δH 3,77(30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) in δH 3,92 (3-OCH3)/ δC 148,6 (C-3) v spektru HMBC (slika 2B), ki so bili dodatno potrjeni z medsebojno koreliranimi signali δH 3,77 (30-OCH3)/δH 6,87(H-20 ) in δH 3,92 (3-OCH3)/δH 7,22 (H-2) v spektru NOESY (slika 2B). V skladu s tem je bil 1 karakteriziran, kot je prikazano, in imenovan kot 5-[3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)alil]ferulna kislina. Kolikor vemo, je bil 1 z dvema sklopoma enot C6–C3, povezanih na C-70, nova skeletna vrsta lignana.

Spojino 2 smo izolirali kot brezbarvno olje z molekulsko formulo C11H2{{20}}O2, kot je bilo ugotovljeno s pozitivnim ionom HR-ESIMS, ki prikazuje [M plus H] plus ion pri m/z 185,1501 (izračunano za C11H21O2, 185.1541). Izrazite absorpcije pri 3445 in 1660 cm-1 v IR spektru 2 so pokazale prisotnost hidroksi oziroma olefinske funkcionalnosti. 1H NMR (tabela 2) skupaj s spektrom COSY 2 je pokazal dve alifatski verigi pri δH 0,85–1,97 (–H2-7–H3-11) in δH 1,66–5,44(–H-3 –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). Zgornje dodelitve se odražajo tudi v 13C NMR 2, podprtem s spektri DEPT, v katerih en metil (δC 14,2, C-11), šest metilenov [δC 22,7 (C-10), 26,3 (C{{ 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) in 37,4 (C-7)], trije metini [δC 67,1(C-2), 69,2 (C-1) in 121,0 (C-3)] in en kvarterni ogljik (δC 144,1, C-4). V spektru HMBC 2 (slika 2C) so navzkrižni vrhovi δH 5,44 (H-3)/δC 27,2 (C-5) in 37,4 (C-7), δH 1,92– 2,01 in 2,04–2,10 (H2-5)/δC144,1 (C-4) in δH 1,97 (H2-7)/δC 144,1 (C-4) označen C{ {100}}–C-6 je bil cikloheksenski del z dvojno vezjo pri ∆3, C-7–C-11, nasičena linearna alifatska veriga, pa je bila pritrjena na C{{105 }}. Relativnim konfiguracijam kiralnih C-1 in C-2 s hidroksi nosilnostjo so se približale vrednosti J karbinoilprotonov H-1 (9,1, 4,2 Hz) in H-2 (4,2 Hz ), kar je pokazalo, da sta bila H-1 in H-2 psevdoaksialno oziroma psevdoekvatorialno usmerjena (slika 2C). Relativna konfiguracija 1,2-dihidroksi v 2 je bila tako izpeljana na cis. Končno je bila struktura 2 pojasnjena, kot je prikazano, in je bila imenovana cis-4-pentilcikloheks-3-en-1,2-diol.

2.2. Učinki spojin 1 in 8 na vsebnost melanina v celicah B16-F10, stimuliranih z -MSH

Da bi ugotovili depigmentacijske sestavine v koreniki L. sinense, so bili vsi čisti izolati izpostavljeniantimelanogenezatest v celicah melanoma B16-F10. Celice B16-F10 mišjega melanoma so dobro uveljavljen model za odkrivanje antimelanogenih principov in so bile široko sprejete v prejšnjih študijah [48]. -Melanocite stimulirajoči hormon (-MSH) je peptidni hormon in je odgovoren za proizvodnjo melanina v melanocitih z aktiviranjem receptorja melanokortina 1 [49]. V tej raziskavi so bile celice B16-F10 stimulirane z -MSH (100 nM) in sočasno obdelane z vsako spojino v koncentracijah 25, 50 ali 100 µM. Vsebnost melanina v celicah melanoma B16-F10 brez obdelave s spojino je bila dodeljena kot 100 odstotkov. Arbutin, običajna kožabeljenjesredstvo v kozmetičnih izdelkih, je bila uporabljena kot pozitivna kontrola. Od teh spojin 1 in 8 zavirata -MSH-inducirano proizvodnjo melanina na način, ki je odvisen od odmerka. Vrednosti IC50 spojin 1 in 8 so bile 78,9 oziroma 31,1 µM (slika 3B). Spojini 1 in 8 pri učinkovitih koncentracijah nista pokazali očitnih učinkov na test MTT (slika 3A). Rezultati MTT lahko izhajajo iz kombiniranih učinkov zmanjšanja celične proliferacije in inhibicije celične viabilnosti glede na eksperimentalne pogoje. Ti rezultati kažejo, da se antimelanogeni učinki spojin 1 in 8 ne pripisujejo celični smrti ali zaviranju rasti.

Z uporabo metode HPLC-DAD smo iz surovega ekstrakta (slika 4) opredelili glavne učinkovite sestavine (1 in 8) s primerjavo z retenzijskim časom čistega 1 (iz laboratorijske sinteze, podatki še niso objavljeni) in 8 (iz Sigme). kot standardi. Uporabljene so bile osnovne raztopine 1, 10, 20, 40, 60, 80 in 100 µg/mL. Vsako koncentracijo smo injicirali v trojniku. Vsebna razmerja 1 in 8 v ekstraktu posušenega materiala so bila kvantificirana na 0,009 odstotka in 0,15 odstotka (m/m) z linearno regresijo zadevnih površin vrhov.

2.3. In Vivo test pigmentacije cebrice

Poleg ocene učinka 8 na in vitroantimelanogeneza, je bila njegova sposobnost proti pigmentaciji in vivo s testom pigmentacije cebrice nadalje raziskana. Cebrica velja za ugoden vzorčni organizem vretenčarjev zaradi svoje majhnosti, visoke plodnosti ter podobnih genskih zaporedij in organskih sistemov kot človeška bitja. Poleg tega je zaradi procesa pigmentacije melanina na njeni površini, ki omogoča enostavno opazovanje, cebrica posebej uporaben model za raziskovanje vivomelanogenih inhibitorjev ali stimulatorjev [50]. V tej študiji je bil kot pozitivna kontrola uporabljen 20 mM arbutin, vključen pa je bil 20 µM arbutin za primerjavo s spojino 8 pri enaki ravni koncentracije. Po inkubaciji zarodkov rib cebrice od 7 hpf do 72 hpf je spojina 8 pokazala večjo aktivnost zaviranja pigmentacije pri koncentracijah 10 in 20 µM v primerjavi z arbutinom (20 µM) (slika 5). Po obdelavi 20 µM spojine 8 se stopnja pigmentacije cebrice opazno zmanjša za približno 31 odstotkov; medtem ko spojina 8 pri 10 µM zmanjša 26,2-odstotno raven pigmentacije.

2.4. Test sposobnosti preživetja ekvivalentov človeške epidermalne kože

Varnost kozmetičnih izdelkov je resna skrb. Na primer, hidrokinon, učinkovito sredstvo za posvetlitev kože, je bil prepovedan s trga zaradi številnih neželenih učinkov in polemik glede možnega rakotvornega tveganja [7]. Kojična kislina, močan zaviralec tirozinaze, lahko povzroči kontaktni dermatitis in potencialno genotoksičnost [51, 52]. Da bi ocenili varnost spojin 1 in 8 na človeški koži, smo izvedli test viabilnosti celic na modelu ekvivalentov človeške kože (HSE). HSE so tridimenzionalni sistemi kulture, ki nastanejo s sejanjem humanih keratinocitov na ustrezen dermalni substrat, predhodno zasejan s človeškimi fibroblasti. HSE so fiziološko primerljivi z naravno kožo in zagotavljajo primerne alternative za testiranje na živalih. Pod nadzorovanimi pogoji gojenja HSE izkazujejo veliko podobnost z naravnim tkivom, iz katerega so bili pridobljeni [53]. V tej študiji so bili izvedeni testi sposobnosti preživetja na normalnih človeških epidermalnih keratinocitih (NHEK) v Leidenskih epidermalnih modelih (LEM). Spojini 1 in 8 nista vplivali na sposobnost preživetja celic pri koncentracijah 10–100 µM. Preživetje celic spojine 1 je 98 odstotkov in 106 odstotkov pri koncentracijah 10 oziroma 100 µM. Preživetje celic spojine 8 je 97 odstotkov oziroma 92 odstotkov pri koncentracijah 10 oziroma 100 µM. Skladno s tem spojini 1 in 8 nista pokazali citotoksičnosti proti NHEK v epidermalnih modelih Leiden pri koncentracijah pod 100 µM (slika 6). Ker je učinkovita koncentracija 8 pod 100 µM, kar nakazuje, da je lahko 8 varen za kožobeljenjepod testiranimi koncentracijami. Vendar pa se v praksi lahko kozmetični izdelki na človeški koži nanašajo dlje časa, zato je treba nadaljevati s podaljšanim poskusnim obdobjem testiranih spojin na HSE.

2.5. Molecular Docking Study of B16-Mus Musculus Tirosinase

Tirozinazna kataliza je stopnja, ki omejuje hitrost biosinteze melanina. Tako je zaviranje tirozinaze najpogostejši pristop za doseganje beline kože [54, 55]. Da bi ugotovili, ali je L. sinense potlačenmelanogenezav celicah B16-F10 z inhibicijo tirozinaze so izvedli 3D modele palice (slika 7A) in 2D diagram (slika 7B) molekularnega priklopa z uporabo programske opreme DS, kar je razkrilo možen zaviralni mehanizem spojine 8 na miših (Mus musculus) tirozinaze. Pokazalo se je, da se aktivno mesto mišje tirozinaze nahaja na domeni, obdani z aminokislinami His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 skupaj z dvema bakrovim ionom. Energija interakcije CDOCKER med encimom in inhibitorjem je bila -46,0067 kcal/mol. Rezultati simulacije so pokazali, da so hidrofobne aminokisline, vključno z Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 in His192 okoli katalitičnega mesta, tvorile van der Waalsove sile s spojino 8. Poleg tega oksigenatom -laktonskega dela 8 tvori vodikove vezi s His377 in His215 , medtem ko njegova karbonilna skupina tvori koordinacijske vezi z dvema bakrovim ionom. Opazili so tudi, da sta cikloheksenski obroč in butan izvajala šibko π-alkilno interakcijo s His381 oziroma His215. Prejšnje študije so pokazale, da je izvleček L. sinense pokazal inhibicijo gobje tirozinaze in znižanje ekspresije mRNA tirozinaze v celicah B16-F10 [21,56]. Ker je molekularno spajanje ponazorilo močno interakcijo med aktivno domeno mišje tirozinaze in spojino 8, je bilo tako predlagano, da (3S,3aR)-neoknidilid (8) kaže antimelanogenezno aktivnost zaradi oslabitve aktivnosti tirozinaze in nadaljnjega zmanjšanja proizvodnje melanina. Vendar pa poleg zaviranja tirozinaze tudi drugi osnovni mehanizmiantimelanogenezaaktivnost (3S,3aR)-neoknidilida (8) je treba še dodatno raziskati.

3. Materiali in metode

3.1. Splošno

Topila stopnje HPLC, n-heksan, etil acetat, metanol in acetonitril, so bila kupljena pri JT Baker (Phillipsburg, NJ, ZDA). Etanol je bil kupljen pri Mercku (Darmstadt, Nemčija). -Melanocite stimulirajoči hormon (-MSH), dimetil sulfoksid (DMSO), fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom (PBS), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2 ,5-difenil tetrazolijev bromid (MTT) smo kupili pri Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Odprta kolonska kromatografija je bila izvedena na silikagelu (70–230 mesh, Merck, Darmstadt, Nemčija). Predhodno prevlečene silikagelne plošče 60 F254 in aluminijaste plošče RP-18 F254S za TLC so bile kupljene pri Mercku (Darmstadt, Nemčija). Optične rotacije so bile izmerjene na polarimetru JASCO P-1020 (Jasco, Tokio, Japonska). 1H in 13C NMR smo pridobili s spektrometrom Bruker Avance DRX-500 (Bruker, Rheinstetten, Nemčija). Masni spektri nizke in visoke ločljivosti so bili pridobljeni z uporabo ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, ZDA) in Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, ZDA). ), oz. IR spektri so bili posneti na spektrometru JASCO FT/IR 4100 (Jasco, Tokio, Japonska).

3.2. Rastlinski materiali

Posušena korenika L. sinense Oliv. je bilo kupljeno pri Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Tajvan.

3.3. Izolacija in strukturna razlaga

Posušeno koreniko (9,9 kg) L. sinense smo zdrobili in ekstrahirali z metanolom (40 L × trikrat), ki smo ga filtrirali in uparili, da smo dobili črn ostanek (1758 g). Ta ostanek smo nato suspendirali v H2O (3.0 L) in trikrat zaporedoma porazdelili z enakim volumnom etil acetata in n-BuOH. Vsako plast koncentriramo pod znižanim tlakom, da dobimo plasti EtOAc (415 g), n-BuOH (147 g) in H2O (896 g). Nato smo posušeno etil acetatno plast (25{{100}} g) zmešali s 375 g silikagela in naložili na kondicionirano odprto kolono, napolnjeno s 3550 g silikagela, in eluirali v koraku -wise gradientna metoda z mešanicami n-heksana, etil acetata in metanola. Vsakih 500 mL smo zbrali za eno frakcijo in analizirali s TLC. Nato smo vse frakcije združili v osem obrokov I–VIII glede na rezultate analiz TLC, ki smo jih ponovno raztopili v najmanjši prostornini mešanic n-heksana in etil acetata, uporabljenih v naslednjem sistemu HPLC. Del II, eluiran z n-heksan-etil acetatom (95:5), smo očistili s polpreparativno HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-etil acetata (96:4) kot eluenta pri hitrosti pretoka 3 ml/min, da dobimo 6(4,2 mg, tR=19,8 min), 3 (6,1 mg, tR=21,2 min), 5 (32 mg, tR=23 .5 min) in 7 (79 mg, tR=28.0 min). Isti delež smo očistili s semi-preparativno HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-etil acetata (99 :1) kot eluent pri hitrosti pretoka 3 mL/min, da dobimo 4 (36 mg, tR=32.5 min). Delež III, eluiran z n-heksan-etil acetatom (90:10), smo očistili z semi-preparativna HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-acetona (95:5) kot eluenta pri pretoku 3 ml/min, da dobimo 8 (1,7 g, tR=19). 3 min). Del IV, eluiran z n-heksan-etil acetatom (80:20), smo očistili s polpreparativno HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-etil acetata (85:15) kot eluenta pri hitrosti pretoka 3 ml/min, da dobimo 15 (19 mg, tR=24.4 min), 12 (11 mg, tR=26.9 min), 9 (25 mg, tR=33 0,8 min), 10 (31 mg, tR=37.0 min), 11 (24 mg, tR=42.5 min). Isti delež smo očistili z isto kolono z uporabo n-heksan-etil acetata (78:22) kot eluenta pri pretoku 3 ml/min, da smo dobili 14 (10 mg, tR=20.1 min) in 13 ( 22 mg, tR=24,6 min). Isti delež smo očistili z isto kolono z uporabo n-heksana-etil acetata-acetona (80:10:10) kot eluenta pri pretoku 3 ml/min, da smo dobili 20 (25 mg, tR=13.2 min ), 17 (15 mg, tR=16,3 min), 18 (28 mg, tR=18,5 min), 16 (132 mg, tR=21,8 min) in 19 (39 mg, tR=25.6 min). Del V, eluiran z n-heksan-etil acetatom (60:40), smo očistili s polpreparativno HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-etilacetat-acetona (68:27:5) kot eluenta pri hitrosti pretoka 3 ml/min, da dobimo 21 (5,3 g, tR=10.2 min), 23 (63 mg, tR=20.0 min), 22 (84 mg, tR { {164}}.0 min) in 24 (33 mg, tR=26.5 min). Isti delež smo očistili s semi-preparativno HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-etilacetata (72:28) kot eluenta pri hitrosti pretoka 3 ml/min, da smo dobili 2 (24 mg, tR=24.3 min). Del VI, eluiran z n-heksan-etil acetatom (40:60), smo očistili s polpreparativno HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) z uporabo n-heksan-etil acetata (53:47) kot eluenta pri hitrosti pretoka 3 ml/min, da dobimo 1 (47 mg, tR=13.2 min).

3.4. Spektroskopski podatki

{{0}}[3-(4-Hidroksi-3-metoksifenil)alil]ferulna kislina (1): brezbarvno olje; []25D plus 5,6◦(c 0.12, CH3OH); IR (čist) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; pozitivno ESI-MS m/z 357,2 [M plus H] plus ; pozitivno HRESI-MS m/z 357,1331 [M plus H] plus (izrač. za C20H21O6, 357,1333); Podatki 1H in 13C NMR glej tabelo 1. Cis-4-pentilcikloheks-3-en-1,2-diol (2): brezbarvno olje; []22D-20.3◦(c 0,20, CH3OH); IR (čist) νmax 3445, 2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [M plus H] plus; HRESI-MS m/z 185,1501 [M plus H] plus (izrač. za C11H21O2, 185,1541); 1H in 13C NMR podatki glej tabelo 2.

3.5. HPLC-DAD analiza

Kromatografske analize so bile izvedene na sistemu Hitachi HPLC, sestavljenem iz L{{0}}črpalke, L-7200 samodejnega vzorčevalnika, L-7455 detektorja in D-7000 sistemske programske opreme za zajemanje podatkov , na koloni XBridgeTM C18 (dolžina 250 mm, notranji premer 4,6 mm, velikost delcev 5 um; Waters). Mobilna faza je bila sestavljena iz H2O (topilo A) in CH3CN (topilo B). Hitrost pretoka je bila 1,0 ml/min. Program eluiranja je bil naslednji: izokrat z 2 odstotki B (0–5 min), 2–20 % B (5–25 min), 20–90 % B (25–30 min). ) in izokratsko z 90 odstotki B (30–35 min). Volumen injekcije je bil 10 L. UV-vidni spektri so bili posneti pri 240 nm.

3.6. Celična kultura

Celice mišjega melanoma B16-F10 (CRL6475) so bile kupljene pri Inštitutu za raziskave in razvoj živilske industrije (FIRDI, Hsinchu, Tajvan). Celice so bile gojene v 90-odstotnem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), dopolnjenem z 10-odstotnim fetalnim govejim serumom (FBS, Sigma, St. Louis, MO, ZDA) in 1-odstotnim fetalnim govejim serumom. raztopino penicilina in streptomicina v steklenicah za gojenje v CO2 inkubatorju z vlažno atmosfero, ki vsebuje 5 odstotkov CO2 v zraku pri 37 ◦C. Gojišče smo zamenjali vsaka dva dni. Celice so bile pobrane s tripsinizacijo, ko so bile približno 85-odstotne konfluentne, preštete s hemocitometrom (Neubauer Improved., Marienfeld, Nemčija) in zasejane v ustreznem številu v vdolbinice plošč celične kulture za nadaljnje poskuse.

3.7. Test viabilnosti celic

Za določitev varnosti različnih izvlečkov je bila sposobnost preživetja celic po zdravljenju z izvlečki določena s testom MTT. Ta metoda temelji na redukciji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijevega bromida (MTT) v formazan z mitohondrijskimi encimi v živih celicah [57]. Količina nastalega formazana je sorazmerna s številom prisotnih živih celic in jo je mogoče izmeriti spektrofotometrično. Na kratko, celice, predhodno obdelane s 100 nM -melanocite stimulirajočim hormonom (-MSH), zasejane z gostoto 1 × 104 celic/vdolbino v 12-ploščo z vdolbinicami, smo pustili, da se prilepijo čez noč. V vsako vdolbinico smo nato dodali čiste izolate ali arbutin in inkubirali nadaljnjih 72 ur. Nato smo obdelane celice 3 ure označili z MTT barvnim reagentom (Applichem, Danska) v PBS (2 mg/mL). Oborino formazana smo raztopili z DMSO in koncentracije izmerili pri 570 nm v bralniku mikroplošč. Viabilnost celic je bila izračunana z naslednjo formulo: viabilnost celic (v odstotkih)=(vzorec/kontrola A) × 100, kjer sta vzorec in kontrola A absorbanci zmesi z ali brez dodatka preskusnega vzorca, oz.

3.8. Test vsebnosti melanina

Vsebnost melanina je bila izmerjena, kot je opisano prej z rahlimi spremembami [58]. Celice melanoma B16-F10 so bile zasejane z 1 × 104 celic/vdolbino v 3 ml medija v 6-plošče za kulturo vdolbinic in inkubirane čez noč, da so se celice lahko oprijele. Celice smo 72 ur izpostavili različnim koncentracijam (25, 50 in 100 µM) čistih izolatov ali arbutina v prisotnosti 100 nM -MSH. Na koncu obdelave smo celice sprali s PBS in lizirali s 150 µL 1 N NaOH (Merck, Nemčija), ki je vseboval 10 odstotkov DMSO, 1 uro pri 80 °C. Absorbanco pri 405 nm smo izmerili s čitalnikom mikroplošč. Vsebnost melanina v celicah melanoma B16-F10 brez zdravljenja s spojino je bila dodeljena kot 100 odstotkov, vsebnost melanina v celicah, zdravljenih s spojino, pa je bila izračunana glede na kontrolno skupino.

3.9. In Vivo test pigmentacije cebrice

Protokol za uporabo živali je pregledal in odobril institucionalni odbor ali odbor za oskrbo in uporabo živali (IACUC/IACUP) medicinske univerze v Taipeiju (št. LAC-2017-0311). Metode so bile izvedene v skladu z ustreznimi zakoni in odobrene smernice. Zarodki divjega tipa cebrice so bili zbrani iz jedrne ustanove za ribice cebrice Medicinske univerze v Taipeju. Vrednotenje zarodka cebrice na podlagi fenotipa je bilo izvedeno v skladu s prejšnjo študijo z rahlo spremembo [50]. Zarodke smo inkubirali pri 28 ◦C z 1 odstotkom etanola kot kontrolo in različno koncentracijo spojin od 7 hpf (po oploditvi) do 72 hpf. Ocenitiproti melanogeneziučinke melanogenih modulatorjev na razvojni proces cebrice, pigmentacijo cebrice smo analizirali pri 72 hpf. Zarodke smo vgradili v 1-odstotno nizko talilno agarozo (Bioshop Canada, Burlington, ON, Kanada) in posneli slike s stereomikroskopom ZEISS Stemi508 (ZEISS, Oberkochen, Nemčija). Analizo meritev slikovnih pik je izvedel fidžijski paket ImageJ. Analizirali smo kvantifikacijo podatkov o pigmentaciji (območje pod očmi ribe cebrice) in jih primerjali s kontrolno skupino.

3.10. Test sposobnosti preživetja na normalnih človeških epidermalnih keratinocitih

Vse primarne človeške kožne celice zdravih darovalcev, ki jih uporablja Oddelek za dermatologijo Medicinskega centra Univerze v Leidnu, so izolirane iz odvečnega tkiva, zbranega v skladu s členom 467 nizozemskega zakona o sporazumu o zdravljenju in kodeksa za pravilno uporabo človeških tkiv nizozemske zveze za biomedicino Znanstvena društva. Po 467. členu se odvečna tkiva lahko uporabijo, če pacient temu ne nasprotuje. To pomeni, da je pacient, ki bo opravil plastično operacijo, dobro obveščen o raziskavi. Nobeden od avtorjev ni bil vključen v vzorčenje tkiv. Pri delu s človeškimi tkivi so upoštevali načela Helsinške deklaracije.

Sveža odvečna koža zmanjšane mame ene samice je bila uporabljena za izolacijo normalnih človeških epidermalnih keratinocitov (NHEK), kot je opisano prej [59]. NHEK v Leidenepidermalnih modelih (LEM) so bili inkubirani čez noč pod potopljenimi pogoji v keratinocitnem mediju. V štirih dneh so fetalni goveji serum postopoma izpustili in NHEK-je v LEM-jih gojili brez seruma na meji zrak-tekočina sedem dni, medtem ko so gojišče osveževali dvakrat na teden. Teste sposobnosti preživetja smo izvedli z dodajanjem 0.5 ml 1 mg/mL MTT vsakemu od NHEK v LEM za 3 ure po 24-urni izpostavljenosti preskusnim spojinam 1, 8 in DMSO (negativna kontrola). oborjeni produkt modrega formazana smo ekstrahirali iz celic v 2 urah z vdolbinico 0.5 ml izopropanola. Koncentracijo formazana smo izmerili z določanjem OD pri 570 nm z uporabo bralnika mikroplošč aTecan Infinite F50.

3.11. Statistična analiza

Vsi podatki v naši študiji so bili pridobljeni kot povprečja poskusov, ki so bili izvedeni vsaj v treh izvodih in izraženi kot povprečje ± SD (standardni odklon). Statistična analiza je bila izvedena s Studentovim t-testom. Statistična značilnost rezultatov je bila določena na p < 0.05="" (*)="" in="" p="">< 0,01="">

3.12. Molecular Docking Study of B16-Mus Musculus Tirosinase

3.12.1. Homološko modeliranje

Ker trenutno ni na voljo nobenih tridimenzionalnih struktur za tirozinazo Mus musculus, je homološko modeliranje najbolj zanesljiva metoda za napovedovanje tridimenzionalnih struktur neznanega proteina, ki temelji na predpostavki, da je struktura neznanega proteina podobna znanim strukturam neke homologne reference. beljakovine. Pridobili smo aminokislinsko zaporedje Mus musculus tirozinaze iz Nacionalnega centra za biotehnološke informacije. baza proteinskih sekvenc. Predlogo homolognega proteina poizvedbenega proteina Mus musculustyrosinase je identificiral Phyre2 (Protein Homology/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60]. 446 ostankov (81 odstotkov zaporedja Mus musculus ) so bili modelirani s 100,0-odstotno zanesljivostjo z eno samo predlogo z najvišjo oceno kot kodo PDB: c5m8pA je bil izbran kot receptor za študije izračuna priklopa.

3.12.2. Analiza interakcije ligand-protein

Vezivno mesto tirozinaze Mus musculus je bilo določeno na podlagi referenčne humane tirozinaze (PDB 5M8M) šestih aminokislinskih ostankov, vezavni žep pa ima dva bakra. Zato je bila definirana sfera mesta vezave. Nato je bila pripravljena in optimizirana 3D struktura spojine 8 z minimizacijo energije, ki je bila zasidrana v vezni žep Mus musculus tyrosinase z uporabo programa CDOCKER, število zagonov za priklop pa je bilo nastavljeno na 50 za inhibitor. Vsi drugi parametri so bili nastavljeni kot privzeti za analizo interakcije ligand-protein z uporabo BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, ZDA). Nazadnje je bila izmed 50 konformacij priklopa izbrana najvišja z najvišjo energijsko oceno CDOCKER za raziskovanje načina vezave priklopljene spojine na aktivnem mestu tirozinaze Mus musculus.

4. Sklepi

V tej študiji smo sprejeli metodo, vodeno z biološkim preizkusom, z uporabo celic B16-F10 za izolacijo sestavin proti melanogenezi iz izvlečkov L. sinense rhizoma. Ugotovljeno je bilo, da sta aktivni sestavini 5-[3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)alil]ferulna kislina (1) in (3S,3aR)-neoknidilid (8). Glede na analizo HPLC predstavlja vsebnost spojine 8 0,15 odstotka surovega ekstrakta. Theantimelanogenezaaktivnost 8 je bila preverjena s celicami B16-F10 in vitro in testi na cebricah in vivo. Vse te ugotovitve kažejo, da lahko 8 vsaj zagotovi utemeljitev potenciala L. sinense za njegovo visoko moč in količino . Podatki o sposobnosti preživetja celic B16-F10 in NHEK preprosto kažejo, da bi lahko 8 potencialno razvili kot sredstvo proti melanogenezi. Špekulirali so, da je način delovanja 8 na antimelanogenezo zaviranje aktivnosti tirozinaze na podlagi rezultatov molekularnega priklopa; vendar je treba to še dodatno potrditi. Naša ugotovitev je pokazala, da je spojina 8 izpostavljenaproti melanogeneziučinke in varnost s študijami in vitro, in vivo in ex vivo, vendar je treba učinkovitost depigmentacije in biološko varnost na človeški koži oceniti in potrditi s kliničnimi preskušanji v prihodnosti.