MikroRNA-2478, pridobljena iz mlečnih eksosomov, zavira melanogenezo po poti Akt-GSK3

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

In-Seon Bae in Sang Hoon Kim

Povzetek:Eksosomi sodelujejo pri medcelični komunikaciji s prenosom molekul iz donorskih v prejemne celice. Eksosome najdemo v različnih telesnih tekočinah, vključno s krvjo, urinom, cerebrospinalno tekočino in mlekom. Eksosomi mleka vsebujejo veliko endogenih molekul mikroRNK. MikroRNA so majhne nekodirajoče RNA in imajo pomembno vlogo v bioloških procesih. Specifične biološke funkcije mlečnih eksosomov niso dobro razumljene. V tej študiji smo raziskovali učinkemlečni eksosomina proizvodnjo melanina v melanomskih celicah in melanocitih. To smo ugotovilieksosomi mleka so se zmanjšalivsebnost melanina, aktivnost tirozinaze in izražanje z melanogenezo povezanih genov v melanomskih celicah in melanocitih. Za govedo specifičen miR-2478 v eksosomih je zaviral proizvodnjo melanina. Ugotovili smo, da je Rap1a neposredni ciljni gen miR-2478 v melanomskih celicah in melanocitih. Prekomerna ekspresija MiR-2478 je zmanjšala ekspresijo Rap1a, kar je vodilo do znižane proizvodnje melanina in ekspresije genov, povezanih z melanogenezo. Inhibicija izražanja Rap1a se je zmanjšalamelanogenezapreko signalne poti Akt-GSK3. Ti rezultati podpirajo vlogo miR-2478, pridobljenega iz eksosomov mleka, kot regulatorjamelanogenezaz neposrednim ciljanjem na Rap1a. Ti rezultati kažejo, da so eksosomi mleka lahko koristne kozmecevtske sestavine za izboljšanjebeljenje.

Ključne besede: melanogeneza;mlečni eksosom; miR-2478; Rap1a

herba cistanchesje sestavina, ki zavira melanin

1. Uvod

Kozmecevtika je sestavljena beseda, ki združuje kozmetično in farmacevtsko in se nanaša na kozmetiko s funkcionalnimi sestavinami, ki imajo medicinske učinke [1]. V preteklosti so kožo izboljševali z dermatološkimi postopki, v zadnjem času pa se zanimanje za kozmetiko povečuje zaradi želje potrošnikov po doseganju teh učinkov s kozmetiko. Tudi kozmetična industrija v zadnjih letih kaže povečano zanimanje za uporabo novih kozmecevtskih sestavin [ 2]. Funkcionalna kozmetika vključuje izdelke, ki pomagajo pri beljenju kože tako, da preprečujejo odlaganje melanina na kožo.

Melanin, pomemben element, ki določa barvo kože in las, ščiti kožo pred ultravijoličnimi žarki [3]. Vendar pa prekomerna tvorba melanina povzroči neenakomeren ton kože, npr. madeže in pege [4]. Transkripcijski faktor mikroftalmije (MITF) je glavni regulator razvoja melanocitov. Tirozinaza (TYR) je najpomembnejši encim za sintezo melanina. Proces sinteze melanina inducira aktivacija TYR preko MITF, ki je pomemben encim, vključen v začetni fazi procesa sinteze melanina in uporablja L-obliko tirozina ali DOPA kot substrat za tvorbo melanina [5].

MikroRNA (miR) so kratke nekodirajoče RNA, ki sodelujejo v številnih bioloških procesih z nadzorovanjem posttranskripcijske ekspresije genov [6]. Študije so odkrile tudi nadzor biosinteze melanina z mikroRNA. Poročali so na primer, da miR-143-5p cilja na gen Tak1 in zmanjša izražanje MITF ter tako zavira sintezo melanina [7]. MiR-125b, negativni regulatormelanogenezadokazano uravnava pigmentacijski gen SH3BP4 [8], miR-675 v eksosomih, izločenih iz keratinocitov, zaviramelanogenezas ciljanjem na MITF [9].

Eksosomi so z membrano omejeni vezikli velikosti 30–200 nm in vsebujejo DNA, RNA in peptide [10]. Notranje komponente eksosomov lahko varno prenašajo informacije sosednjim ali oddaljenim celicam, ne da bi jih razgradili encimi v bioloških tekočinah in tako vplivali na mikrookolje okoli različnih celic [11].Mlečni eksosomiso zunajcelični vezikli, pridobljeni iz mleka, ki so stabilni v človeških prebavnih procesih [12]. Eksosomi, ekstrahirani iz govejega mleka, ne vsebujejo le več beljakovin, kot sta kazein in laktoglobulin, ampak tudi mikroRNA, ki delujejo kot tovor [13–15]. Goveje mleko vsebuje imunsko povezane mikroRNA, kot so miR-15b, miR-27b, miR-34a in miR-10. Teh mikroRNA je še posebej veliko v kolostrumu [16].

Nekatere študije so pokazale, da sestavine mleka zavirajomelanogenezav melanocitih; na primer beljakovine, kot sta -laktoglobulin in κ-kazein v mleku, uravnavajo melanogenezo [17,18]. Ugotovljeno je bilo, da supernatant fermentiranega mleka Lactobacillus helveticus NS8- zavira UV-poškodbe in hiperpigmentacijo kože [19]. Vendar še ni poročila o tem, ali so mikroRNA v govejem mleku vpletene v kožobeljenje, čeprav obstaja 79 mikroRNAmlečni eksosomi[13]. Zato smo v tej študiji raziskali, ali mlečni eksosomi, ki vsebujejo mikroRNA, zavirajo sintezo melanina v mišjih in človeških melanomskih celicah in melanocitih.

2. Materiali in metode

2.1. Celična kultura

Celice mišjega melanoma B16F10 smo gojili v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM, Hyclone, Logan, UT, ZDA). Celice človeškega melanoma MNT-1 so bile gojene v minimalnem esencialnem mediju (MEM, Hyclone). Vsi mediji so bili dopolnjeni z 10 odstotki fetalbovine seruma (FBS, Hyclone, ZDA) in 1 odstotkom raztopine penicilin-streptomicin. Normalni človeški epidermalni melanociti (NHEM, PromoCell, Heidelberg, Nemčija) pri prehodu številka 5 ali 6 so bili vzdrževani v mediju za rast melanocitov (PromoCell). Te celice so bile inkubirane pri 37 ◦C v pogojih vlažne atmosfere, ki je vsebovala 5 odstotkov CO2.

2.2. Čiščenje eksosomov

Komercialno mleko (1 ml) smo centrifugirali pri 2000× g 10 minuto, nato smo supernatant centrifugirali pri 10,000× g 10 minut. Mlečni supernatant smo spustili skozi 0,45 µm filter in nato 0,2 µm filter. Nastalo raztopino (300 µL) smo zmešali s fosfatno pufrano fiziološko raztopino (PBS) in 300 µL raztopine za obarjanje eksosomov Exoquick (Systems Biosciences, Palo Alto, CA, ZDA) in inkubirali 30 minut. Zmes smo centrifugirali pri 10.000 × g 30 minut, da smo dobili eksosomsko peleto, ki smo jo nato resuspendirali v PBS. Porazdelitev velikosti eksosomov je bila določena na Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Almelo, Francija). Eksosome smo shranili pri –80 ◦C za nadaljnjo uporabo.

2.3. Krioelektronska mikroskopija

3 µL alikvot sveže suspenzije eksosomov je bil adsorbiran na žarilno razelektreno, perforirano mrežo, prevlečeno z ogljikom (2/2-3 C C-flat; Protochips, Morrisville, NC, ZDA), ki je bila nato blotirana 3 s pri 4 ◦C in potopno zamrznjeno z uporabo Vitrobota Mark IV (Thermo FisherScientific, Lafayette, CO, ZDA). Mreže so bile shranjene v tekočem dušiku, nato pa prenesene v držalo za krio vzorce Gatan 626 (Gatan, Pleasanton, CA, ZDA). Vzorci so bili posneti z nominalno povečavo 29,000× v krioelektronskem mikroskopu (FEI Tecnai F20 TEM,FEI, Hillsboro, Oregon, ZDA), opremljenem s standardno pištolo za emisijo polja (s-FEG) in kamero K2Summit (Gatan) pri pospeševalni napetosti 200 kV.

2.4. Test viabilnosti celic (test WST)

Celice melanoma (B16F10, MNT-1) in humani melanociti (NHEM) so bile posejane po 4 × 103 celic/vdolbinico v 96-plošče z vdolbinicami in obdelane zmlečni eksosomi(20 in 50 µg/mL) ali imitator mikroRNA (dvoverižni oligonukleotidi RNA) za vsak poskus. V navedenih časovnih točkah je bila viabilnost celic izmerjena z uporabo kompleta za izboljšano preživetje celic EZ-CyTox (Daeil Lab Service, Seul, Koreja) v skladu z navodili proizvajalca. Absorbanco smo izmerili pri 450 nm na spektrofotometru za mikroploščo Vmax (Molecular Devices, San Jose, CA, ZDA).

2.5. Merjenje vsebnosti melanina

Melanomske celice in melanocite smo zdravili zmlečni eksosomi(20 in 50 µg/mL) 48 ur. Po dvakratnem izpiranju z ledeno mrzlim PBS smo celice centrifugirali pri 2500 × g 10 minut. Celične pelete smo resuspendirali pri 90 ◦C 30 minut v 1 N NaOH, ki je vseboval 10 odstotkov dimetil sulfoksida. Celotno vsebnost melanina smo izmerili na spektrofotometru za mikroploščo Vmax (Molecular Devices) pri 405 nm.

2.6. Test aktivnosti tirozinaze

Melanomske celice in melanocite smo inkubirali zmlečni eksosomiza 48 h. Celice smo dvakrat sprali s PBS in lizirali s PBS, ki je vseboval 1 odstotek Tritona X-100 in 0.1 mMfenilmetansulfonil fluorida. Po centrifugiranju smo supernatant zbrali in prenesli na 96-ploščo z vdolbinicami. Po dodatku 0.1 ML-3,4-dihidroksifenilalanina smo vzorce inkubirali pri 37 ◦C 1 uro. Aktivnost tirozinaze smo izmerili na podlagi absorbance pri 475 nm z uporabo mikroploščnega spektrofotometra (Molecular Devices).

herba cistanches

2.7. Človeška kožna tkiva

Epidermalni ekvivalenti, ki vsebujejo melanocite (MelanoDerm, MEL-300B), so bili pridobljeni pri MatTek (Ashland, MA, ZDA) in so bili vzdrževani v mediju EPI-100-NMM-113-.Mlečni eksosomiso nanesli na tkiva MelanoDerm 1., 3., 7., 9. in 12. dan. PBS je bil uporabljen kot negativna kontrola. Tkiva so bila fotografirana 3., 7., 9., 12. in 14. dan. Pigmentacijo smo izmerili s primerjavo sprememb vrednosti L (Adobe PhotoshopCC 2015). Vsebnost melanina v tkivu človeške kože je bila izmerjena 14. dan s testom Solvablemelanin. Na kratko, tkiva MelanoDerm so bila solubilizirana z uporabo Solvable (PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA) in inkubirana čez noč pri 60 ◦C. Vzorci so bili vrtinčeni in nato centrifugirani pri 16.500 × g 5 minut. Supernatant smo prenesli v vdolbinice 96-plošče z vdolbinicami in odčitali pri 490 nm s spektrofotometrom.

3. Rezultati

3.1. Karakterizacija eksosomov, izoliranih iz mleka

Da bi raziskali značilnosti eksosomov, pridobljenih iz kravjega mleka, smo najprej izmerili velikost eksosomov z dinamičnim sipanjem svetlobe. Kot rezultat je bilo ugotovljeno, da imajo eksosomi, ekstrahirani iz mleka, premer 80–190 nm (slika 1A). ZamilkexosomePri čiščenju smo zmes Exoquick-mlečni supernatant centrifugirali, da smo dobili pelet mlečnega eksosoma. Ekspresija CD9, TSG101 in HSP70 kot eksosomskih markerjev je bila odkrita v peletih, vendar ti proteini niso bili prisotni v supernatantu (slika 1A). Poleg tega je bila sferična morfologija in velikost eksosomov potrjena s krioelektronsko mikroskopijo (slika 1). 1B). Ugotovljeno je bilo, da imajo eksosomi okroglo obliko s premerom do 200 nm. Nato smo raziskali, ali so eksosome, ekstrahirane iz mleka, prevzele celice. Mišje celice B16F10 smo inkubirali zmlečni eksosomioznačen z lipofilnim fluorescenčnim barvilom PKH26. Kot rezultat smo opazili, da so bili označeni eksosomi prisotni v celicah (slika S1).

3.2. Dejavnost tirozinaze in proizvodnja melanina, zatrta z eksosomi mleka v celicah B16F10

Nato smo preučili učinek ekstrahiranih eksosomov na sposobnost preživetja celic. Kot je prikazano na sliki 2A, smo razkrili, da ni pomembne razlike v viabilnosti celic, ne glede na koncentracijo eksosoma.

Da bi raziskali morebitne kožne celice,beljenjeučinekmlečni eksosomi, so bile celice obdelane z mlečnimi eksosomi. Ugotovili smo, da se je aktivnost tirozinaze v celicah, izpostavljenih mlečnim eksosomom pri koncentracijah 20 ali 50 µg/mL, zmanjšala za 43 oziroma 59 odstotkov (slika 2B). Ker lahko zmanjšanje aktivnosti encima tirozinaze zavre biosintezo melanina, so vsebnost melanina izmerili po zdravljenju z eksosomi mleka. Opazili smo zaviranje sinteze melanina v celicah, ki so bile izpostavljenemlečni eksosomi(20 ali 50 µg/mL) za 45 oziroma 55 odstotkov (slika 2C). Poleg tega se je izražanje mRNA MITF zmanjšalo, ko se je povečala koncentracija mlečnih eksosomov. Raven MITF mRNA se je zmanjšala za 59 odstotkov v celicah, zdravljenih z eksosomi 20 µg/mL, oziroma za 84 odstotkov v celicah, zdravljenih z eksosomi 50 µg/mL (slika 2D). Izražanje mRNA tirozinaze (TYR) se je prav tako zmanjšalo za 49 odstotkov in 76 odstotkov v celicah, izpostavljenih tem koncentracijam eksosomov (slika 2D). Ravni beljakovin MITF in tirozinaze so se prav tako zmanjšale kot koncentracija mlekaeksosomipovečala (slika 2E). Ti rezultati kažejo, da mlečni eksosomi zavirajo melanogenezo v mišjih celicah B16F10.

3.3. MiR-2478, specifičen za govedo, iz eksosomov mleka zavira melanogenezo

Da bi ugotovili, ali miR-2478 izhaja izmlečni eksosomineposredno vpliva na melanogenezo, je bil zaviralec miR-2478 transfektiran v celice, izpostavljene mlečnim eksosomom (50 µg/mL). V prisotnosti mlečnih eksosomov so celice B16F10, transficirane z zaviralcem themiR-2478, pokazale znatno večjo aktivnost tirozinaze v primerjavi s tisto v kontroli (slika 4A). Vsebnost melanina je bila prav tako višja v celicah, zdravljenih z zaviralcem miR-2478, kot v kontrolnih celicah (slika 4B). Ekspresija mRNA MITF je bila –2.{10}}krat večja v celicah, zdravljenih z zaviralcem miR 2478, kot v kontrolnih celicah, ekspresija mRNA TYR pa je bila –{13}}krat večja, ko je bil miR-2478 inhibiran (slika 4C ). V celicah, ki so bile izpostavljene, so se obnovile tudi ravni beljakovin MITF in TYRmlečni eksosomipotem ko so bile te celice transfektirane z zaviralcem miR-2478 (slika 4D). Ti rezultati kažejo, da je miR-2478, pridobljen iz eksosomov mleka, neposredno zaviral melanogenezo v celicah mišjega melanoma.

3.4. Eksosomi mleka zavirajo melanogenezo po poti Akt-GSK3

Nato smo preučili, kakomlečni eksosomireguliratimelanogenezaza identifikacijo ustrezne prizadete poti v celicah melanoma. Čeprav ni znano, ali Rap1a neposredno nadzoruje melanogenezo, so poročali, da Rap1a zavira Akt fosforilacijo rakavih celic [20]. Na podlagi teh informacij smo raziskali, ali Rap1a modulira pot Akt za promocijo.

V zvezi z Aktmelanogenezapot, aktivirana Akt inducira fosforilacijo Gsk3 pri Ser9 in ga tako inaktivira; ta sprememba zavira transkripcijsko aktivnost MITF in zniža tirozinazo [21, 22]. V tej študiji smo ovrednotili izražanje Akt in GSK3 v celicah, zdravljenih z Rap1a siRNA. V teh celicah se je povečala aktivacija fosforilacije Akt in povečala se je tudi količina pGSK3 (slika 7A). GSK3 je bil inaktiviran z aktivacijo Akt na način, odvisen od koncentracije, v celicah, obdelanih z 20 ali 50 µg/mlmlečni eksosomi(Slika 7B). Ravni proteinov Akt in GSK3 v celicah, obdelanih z miR-2478mimikom, so bile skladne z zgornjimi rezultati (slika 7C). Nato smo preizkusili, ali miR-2478iz eksosomov mleka vpliva na pot Akt-GSK3. V prisotnosti mlečnih eksosomov je bila fosforilacija proteinov Akt in GSK3 nižja v celicah, zdravljenih z zaviralcem miR-2478 (slika 7D). Poleg tega je zdravljenje z zaviralcem AKT GSK690693 povečalo izražanje genov, povezanih zmelanogenezav celicah, obdelanih z eksosomi mleka. (Slika 7E). Te ugotovitve so pomenile, da miR-2478 vmlečni eksosomizniža Rap1a in zavira melanogenezo prek poti Akt-GSK3.

cistanche herbabelilni učinek na kožo proti oksidaciji

3.8. Mlečni eksosomi so zavirali melanogenezo v človeških melanomskih celicah, melanocitih in melanodermnem tkivu

Glede na tomlečni eksosomizaviralmelanogenezav mišjih celicah smo nato ugotovili, ali so mlečni eksosomi enako učinkoviti v človeških celicah. Najprej smo pregledali sposobnost preživetja MNT-1 človeških melanomskih celic in NHEM človeških melanocitov po inkubaciji z 20 ali 50 ug/ml eksosomov mleka. Kot je prikazano na sliki 8A, ni bilo razlike v sposobnosti preživetja. Aktivnost tirozinaze je bila zavrta za 43 odstotkov oziroma 85 odstotkov v celicah MNT-1, izpostavljenih 20 ug/mL ali 50 ug/mL mlečnih eksosomov (slika 8B). NHEM se je prav tako zmanjšal za 34 odstotkov oziroma 66 odstotkov z zdravljenjem z 20 ug/mL ali 50 ug/mL mlečnih eksosomov (slika 8B). Poleg tega so izmerili vsebnost melanina v celicah MNT-1 in NHEM, izpostavljenih eksosomom mleka. Posledično se sinteza melanina v celicah MNT-1, izpostavljenih 20 ug/mL ali 50 ug/mLmlečni eksosomije bilo zavirano za 37 odstotkov oziroma 58 odstotkov, v celicah NHEM pa je zdravljenje z eksosomom mleka oviralo sintezo melanina za 36 odstotkov oziroma 62 odstotkov (slika 8C). Poleg tega ima učinek posvetlitve kožemlečni eksosomije bilo dodatno potrjeno s tkivi človeške kože. Po zdravljenju z eksosomi mleka v človeških tkivih relativnibeljenje učinke so opazili 3., 9., 12. in 14. dan. Posledično smo ugotovili, da je bila barva kože v tkivih, izpostavljenih eksosomom mleka, svetlejša od tiste v kontrolnih tkivih (slika 8D). Stopnja pigmentacije je bila izračunana kot vrednost L, ki je vrednost, ki predstavlja svetlost. Pigmentacija je napredovala počasneje v kožnih tkivih, obdelanih z mlečnimi eksosomi, kot v kontrolnih kožnih tkivih (slika 8D). Eksperimentalna skupina, zdravljena zmlečni eksosomipokazala manjšo velikost delcev melanina in nizko količino pigmenta melanina v primerjavi s kontrolno skupino (slika 8E). Kot rezultat merjenja vsebnosti melanina po 14 dneh mleka so eksosomi zavirali sintezo melanina v človeških tkivih (slika 8F). Zato smo zaključili, da mlečni eksosomi zavirajomelanogenezav človeških celicah in tkivih.

4. Razprava

Študije o uravnavanju eksosomovmelanogenezaso poročali, da imajo eksosomi, pridobljeni iz keratinocitov, učinek beljenja. Melanociti in okoliški keratinociti so funkcionalno povezani, da tvorijo melaninske enote v kožni povrhnjici [23,24]. Iz keratinocitov pridobljeni topni faktorji uravnavajo melanogenezo sosednjih melanocitov. Eksosomi, izločeni iz normalnih keratinocitov, spodbujajo melanogenezo z uravnavanjem ekspresijemelanogeneza-sorodnih proteinov [23–25]. Poleg tega v abeljenjeV študiji z uporabo eksosomov, ekstrahiranih iz celic, so nedavno poročali, da so eksosomi, ekstrahirani iz matičnih/stromalnih celic, pridobljenih iz človeškega adipoznega tkiva, pokazali učinkovitost posvetlitve kože v celicah mišjega melanoma [26]. Bilo je tudi poročilo, da imajo eksosomi, ekstrahirani iz rastlin, učinek beljenja. Zunajcelični vezikli, ekstrahirani iz listov in stebel rastline D. morbifera, so pokazali antimelanogene učinke na celice mišjega melanoma in zdravo človeško kožo [27]. V naši študiji smo raziskali učinek beljenja eksosomov, pridobljenih iz mleka.

V primerjavi z eksosomi, ekstrahiranimi iz krvne plazme ali kulturne tekočine, imajo eksosomi, pridobljeni iz mleka, prednost ne le v tem, da imajo velike količine eksosomov, ki jih je mogoče ekstrahirati na enoto volumna, ampak tudi nizko ceno [26, 27]. Kermlečni eksosomiimajo podobno kemično sestavo kot celične membrane, kažejo nižjo imunogenost in citotoksičnost ter imajo visoko biokompatibilnost [28,29]. Nedavno, ko so z mlečnimi eksosomi hranili model kolitisa miši, povzročene z DSS (natrijeva sol dekstran sulfata), se je izražanje provnetnih citokinov IL-6 in TNF zmanjšalo v primerjavi s kontrolno skupino, s čimer se je zmanjšalo vnetje in izboljšal nekrotizirajoči enteritis [30, 31]. Poleg tega je zaužitje mlečnih eksosomov pri mišjem modelu osteoporoze izboljšalo artritis s povečanjem gostote kosti in zmanjšanjem protivnetnih citokinov [32,33]. Doslej so bili učinki mlečnih eksosomov osredotočeni na imunološke pojave, ki zmanjšujejo vnetne citokine, in na razvoj kosti, kot je lajšanje enteritisa in izboljšanje osteoporoze. V tej študiji je poleg načina jemanjamlečni eksosomi, je bilo potrjeno, da je bil pri nanosu na kožo učinkovit pri kožibeljenje. To kaže, da ga je mogoče uporabiti za zdravljenje različnih bolezni z izboljšanjem fiziološke aktivnosti z uporabo mlečnih eksosomov v prihodnosti.

Čeprav je ta študija predlagala, damlečni eksosomizaviratimelanogeneza, je že znano, da imajo beljakovine sirotke, kot so kazein, -laktoglobulin in -laktalbumin, belilni učinek. -laktoglobulin zmanjša aktivnost tirozinaze v človeških melanocitih [18], k-kazein pa zavira melanogenezo v mišjih celicah melanoma B16 [17]. Zanimivo je, da je veliko teh komponent prisotnih tudi v eksosomih mleka. Glede na rezultate proteomer eksosomov mleka se kazein, -laktoglobulin in -laktalbumin porazdelijo v eksosome [15,34,35]. Eksosomi mleka vsebujejo mikroRNA in beljakovine. Kot rezultat mikromrež miRNA z uporabo mlečnih eksosomov Izumija in sodelavcev, miR-2478, miR-1777b,miR-1777a, let-7b in miR{{16 }} so bili zelo porazdeljeni v eksosomih mleka [13]. V tej študiji so z izjemo miR-2478 med temi mikroRNA miR-1777b, miR-1777a,let-7b in miR-1224 ni razlike v aktivnosti tirozinaze od kontrolne skupine (slika S2). miR-2478 je bilo največ vmlečni eksosomiin zmanjšana aktivnost tirozina. Vendar se je izražanje genov MITF in TYR, povezanih z beljenjem, bolj zmanjšalo v celicah, zdravljenih zmlečni eksosomikot v celicah, zdravljenih samo z miR{0}}mimikom. Ti rezultati kažejo, da je več komponent, vključno z mikroRNA v mlečnih eksosomih, vključenih vbeljenjeukrepanje.

Večina mikroRNA v mlečnih eksosomih izvaja biološke funkcije z zaviranjem izražanja ciljnih genov v prejemnih celicah. V tej študiji je miR-2478 zaviral tudi sintezo melanina z usmerjanjem Rap1a kot ciljnega gena. Čeprav niso bile mikroRNA, pridobljene iz mleka, so že poročali o mikroRNA, ki nadzorujejo izražanje genov, povezanih z beljenjem. Ko je bil mimik miR-27a-3p uporabljen na mišjih melanocitih, je zaviral izražanje Wnt3a in s tem zaviral sintezo melanina [36], ektopični miR-218 pa je zaviral aktivnost TYR z zmanjšanjem izražanja MITF v melanocitih mišjega melanoma [37]. miR-203 promoviramelanogenezaprek poti CREB1/MITF/Rab27apathway z ciljanjem na Kif5b pri melanomu [38]. V eksosomih mleka je 79 mikroRNA

mikroRNA vmlečni eksosomipridobljeno iz krav [13]. Zato so potrebne nadaljnje raziskave fiziološke aktivnosti eksosomov mleka.

5. Sklepi

Naše ugotovitve kažejo na tomlečni eksosomiso kandidati za antimelanogene učinkovine, ki zmanjšajo pigmentacijo z zaviranjem izražanja genov, povezanih z melaninom (slika 10). V celicah melanoma in melanocitih so mlečni eksosomi pokazali inhibicijo TYR in zmanjšanje vsebnosti melanina v primerjavi z negativno kontrolo. Poleg tega je te učinke posredoval miR-2478 izmlečni eksosomi. Zato so mlečni eksosomi lahko koristni za razvoj funkcionalnihbeljenjekozmetika z nizko citotoksičnostjo.

cistanchebelilni učinek na kožo proti oksidaciji