In vivo uporaba črevesnih bakterijskih konzorcijev posnema metabotipa A in B urolitina v podganjem modelu, ki ne proizvaja urolitinaⅠ

Desetletja je bilo uživanje elagitaninov (ET) in elagične kisline (EA) povezano s številnimi biološkimi učinki, vključno z antioksidativnimi, protirakavimi, protivnetnimi, protibakterijskimi in aktivnostmi proti replikaciji HIV.1 Vendar sta absorpcija in biološka uporabnost ET in EA so zelo slabe. Prejšnje študije na ljudeh so pokazale, da je izločanje EA in EA-O-glukuronida z urinom manj kot 1 % vnosa. 2,3 Kljub temu, da sta absorpcija ET in EA nizka, ju mikrobiota debelega črevesa nadalje presnavlja v urolitine (Uros), ki so vsaj delno odgovorni za blagodejne učinke živil, bogatih z ET in (ali) EA.1,4

Kliknite na odvajalo

Najprej se EA sprosti s hidrolizo estrskih vezi ET z encimom, znanim kot elagitanaza.5 EA je podvržen nadaljnji razgradnji, pri čemer nastanejo derivati ​​6H-dibenzo[b,d]piran-6-on, imenovani Uros. Ta kaskada reakcij se začne s cepitvijo laktonskega obroča z encimom laktonazo, kar povzroči luteinsko kislino, ki se nato dekarboksilira v pentahidroksi-Uro (Uro-M5). Zaporedna dehidroksilacija jo pretvori v tetrahidroksi-Uros (Uro-D, Uro-E in Uro-M6) in trihidroksi-Uros (Uro-C, UroM7 in Uro-G), da končno dobimo dihidroksi-Uros (Uro-A in isoUro-A) in monohidroksi-Uro (Uro-B), pri čemer se slednji običajno zazna ko nastane tudi izoUro-A.1

Široka raznolikost presnovnih profilov Uro, odkritih pri ljudeh po zaužitju živil, bogatih z ET, kaže na medindividualne razlike v mikrobioti debelega črevesa, ki je odgovorna za razgradnjo ET. )fenoli.6,9 Ta dvosmerna interakcija med črevesno mikrobioto in (poli)fenoli je spodbudila znanstveno skupnost, da je populacijo združila v skupine na podlagipresnovni fenotip (vrsta kovine), da bi pojasnili razlike v učinkih polifenolov.10,11 Natančneje, glede na presnovo ET in EA lahko posameznike stratificiramo v urometabotipe (UM), povezane s sestavo in funkcionalnostjo črevesnega mikrobioma.7,8,12

V zahodnih in vzhodnih populacijah so bili opisani trije človeški UM (UM-A, UM-B in UM-0), povezani s tremi različnimi profili proizvodnje Uro.13–15 V zvezi s tem posamezniki metabotipa A (UM-A) na koncu mikrobne katabolne poti proizvede več vmesnih Uro, vendar samo urolitin A (Uro-A), glavni absorbirani Uro v tem UM. Posamezniki z metabotipom B (UM-B) proizvajajo nekaj vmesnih Uro in tri končne Uro, tj. urolitin B (Uro-B), urolitin A (IsoUro-A) in Uro-A, ki so glavni absorbirani Uro v UM-B. Zato bi lahko vmesni Uro deloval predvsem v črevesju, medtem ko bi lahko imel končni Uro lokalne in sistemske učinke.6 Nasprotno pa posamezniki s kovinskim tipom 0 (UM-0) ne morejo proizvesti teh končnih Uro (le do sedaj so odkrili prekurzor urolitin-M5, ki se v črevesju ne absorbira).

Razlike v uroprofilih so opazili med UM in vzdolž debelega črevesa, kar kaže na prevladujočo proizvodnjo uro v distalnem delu kolona.16–19 Zanimivo je, da je odstotek UM-0 pri zdravih prostovoljcih iz Španije in Kitajske približno 10 % in bi lahko bil še višji pri populaciji ZDA.13–15 Za roda bakterij Gordonibacter in Ellagibacter je bilo ugotovljeno, da lahko presnavljajo EA v nekaj Uros.20–23 Vendar je bilo ugotovljeno, da nekateri intermediati (na primer Uro-D, Uro-E, Uro- M7 in Uro-G) in končni Uros (Uro-A in Uro-B) se ne proizvajajo v čistih kulturah teh bakterij, kar pomeni, da morajo druge bakterije dokončati nabor Urosov, ki konfigurirajo tako UM-A kot UM-B. . Pred kratkim so bili in vitro identificirani konzorciji črevesnih bakterij, ki sodelujejo pri presnovi EA, da nastanejo metabotipi, ki proizvajajo uro (UM-A in UM-B).

Bakterijski konzorciji, ki vsebujejo rodove Gordonibacter plus Enterocloster in Ellagibacter plus Enterocloster, so proizvedli in vitro urolitine, povezane z UM-A oziroma UM-B. 25 Vendar pa je sposobnost teh bakterijskih konzorcijev, da posnemajo človeške Uro profile, povezane z UM-A in UM-B in vivo je še vedno neznana. Poleg tega je varnost uživanja teh bakterij, ki proizvajajo sečne kisline, kot novih probiotikov, še vedno negotova, saj še niso bili testirani na živalih ali ljudeh. V tej študiji so zgornji bakterijski konzorciji ocenili glede na njihovo zmožnost koloniziranja črevesja podgan, ki ne proizvajajo ura (UM-0-podobnih), in njihove pretvorbe v uroproizvajalce, ki posnemajo UM-A oziroma UM-B. Ocenjena je bila tudi varnost teh bakterijskih konzorcijev. Poleg tega sta bila razvita dva nova postopka kvantitativne PCR v realnem času (qPCR) za odkrivanje in kvantifikacijo Ellagibacter in Enterocloster v vzorcih blata.

Materiali in metode

Kemikalije in reagenti

Uros je kemično sintetiziral in prečistil VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Španija). EA je bil kupljen pri Sigma-Aldrich (St Louis, MO, ZDA). Fosfatni pufer (PBS) je bil pridobljen pri FisherScientific (ZDA), metanol, etanol in mravljična kislina pa pri Panreac Química (Barcelona, ​​Španija). Topila za tekočinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (LC-MS) so bila kupljena pri JT Baker (Deventer, Nizozemska). V celotni študiji je bila uporabljena voda UltrapureMillipore (Bedford, MA, ZDA). Vse kemikalije in reagenti so bili analitske kakovosti.

Priprava bakterijskih konzorcijev

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T in Enterocloster bolted CEBASS4A9, vsi izolirani in identificirani v našem laboratoriju (CEBAS-CSIC, Španija), smo anaerobno gojili v 5 ml Wilkins -Epruvete z anaerobnim medijem Chalgren (WAM, Oxoid) pri 37 stopinjah 48 ur v anaerobni komori Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Južni Wales, Združeno kraljestvo) in resuspendirane v PBS z dodatkom 10 % glicerola in 0,05 % L-cistein hidroklorida (PanReac). Química, Barcelona, ​​Španija). Po anaerobni inkubaciji so bili pripravljeni konzorciji.24,25 Na kratko, "bakterijski konzorcij A" je vseboval G. sevi urolithinfaciens in E. bolteae; "bakterijski konzorcijB" je vseboval kulturi E. isourolithinifaciens in E. bolteae; in "kontrolni koktajl" je vseboval sterilni PBS z 10 % glicerola in 0,05 % L-cistein hidroklorida. Pred dajanjem smo vse koktajle porazdelili v 3,5 ml alikvote in hranili pri -80 stopinjah.

Živali, prehrana in načrtovanje eksperimentov

Eksperimentalni protokol (referenca 624/2020) so odobrili lokalna vlada, Odbor za bioetiko Španskega nacionalnega raziskovalnega sveta (Madrid, Španija) in Odbor za etiko poskusov na živalih z Univerze v Murcii (Španija). Poskusi so sledili priporočilom Evropske unije glede poskusov na živalih (Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in sveta o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene). Podgane Wistar (n=18; 9 samic in 9 samcev), ki tehtajo 240 ± 31 g, so bile pridobljene iz Enviga (Barcelona, ​​Španija). Ta podganji model je bil izbran na podlagi njegove nezmožnosti proizvajanja Urosa, opaženega v naših preliminarnih študijah, v katerih so testirali fekalne vzorce iz različnih modelov podgan. Tri skupine (A, B in C) smo oblikovali tako, da smo vsakič naključno dodelili 6 živali (3 samice in 3 podganje samce). ) na skupino (slika 1).

Vsaka skupina podgan je bila nameščena v dveh različnih kletkah, razdeljenih po spolu, v prostoru s temperaturno nadzorovanim okoljem (22 ± 2 stopinji) s 55 ± 10 % relativno vlažnostjo in nadzorovanim ciklom svetlobe in teme (12 h). Podgane so prejele standardno hrano (Teklad, Barcelona, ​​Španija), ki je vsebovala (%/100 g sveže teže) 14,3 % beljakovin (zdrob iz koruznega glutena), 48 % ogljikovih hidratov (pšenična zmečka, mleta pšenica, mleta koruza) in 4 % maščobe (sojino olje). ), energijsko gostoto 2,9 kcal g−1 in 4,1 % surovih vlaknin, dopolnjenih z EA v prahu Čistost večja ali enaka 95 % (3,6 mg na 100 g žvečilne hrane). EA smo homogeno zmešali z zmleto standardno krmo, ponovno peletirali in liofilizirali. Dieta, obogatena z EA, je bila shranjena stran od vlage in svetlobe. Odmerek EA, danpodgan v prehrani je bil približno 0.72 mg na podgano na dan (EA1× dieta), človeški ekvivalentni odmerek 41 mg na dan−1.26 Vse skupine so bile ves čas poskusa hranjene z dieto EA 1× in vodo iz pipe ad libitum ( 5 tednov). Ker je bila EA, odkrita v vzorcih blata, v prvem tednu nizka, je bilo v naslednjih dneh dodanih nekaj dodatnih EA. V 3. tednu so živalim peroralno dajali dodatni odmerek 1,5 mgEA na podgano na dan, raztopljenega v vodi, z gavažo (skupna dieta=EA 3 ×), ki so ga dajali samo 1 teden. Nazadnje smo v 4. tednu dodali ≈5 g orehov na podgano na dan (drug vir EA) prehrani EA 1× in jih vzdrževali do konca študije, da bi ocenili vpliv EA, ki vsebuje živilski matriks, na sposobnost bakterij izdelati Uroša. Teža, vnos hrane in vode so bili merjeni vsak dan. Konzorcije črevesnih bakterij so dajali peroralno z gavažo. Skupina A je prejela 500 µL bakterijskega koktajla A, skupina B je prejela 500 µL bakterijskega koktajla B in skupina C (kontrola) je prejela 500 µL PBS. Peroralno dajanje so izvajali vsaka 2 dni v prvih dveh tednih in vsak dan v naslednjih 2 tednih. V zadnjem tednu (28. do 32. dan) so živali nadaljevale z isto dieto, dopolnjeno z EA in orehi, vendar brez oralnega dajanja bakterij. Na koncu študije so bile živali žrtvovane v komori s CO2.

Postopki vzorčenja

Med študijo so bili zbrani vzorci fekalij za analizo Uro z UPLC-ESI-QTOF-MS/MS in črevesne mikrobiote s sekvenciranjem gena 16S rRNA in qPCR. Kri so odvzeli ob različnih časovnih točkah (izhodišče, 28. dan in konec študije) za hematološke in biokemične analize seruma. Vzorci krvi so bili pridobljeni iz repne vene (≈500 µL) in zbrani v epruvete, ki vsebujejo heparin, na začetku ter 28. in 32. dan (slika 1). Ločitev plazme je bila izvedena takoj s centrifugiranjem pri 3000 g 10 minut pri 4 stopinjah in zamrznjena pri - 80 stopinj do nadaljnjega določanja serobiokemičnih spremenljivk. Jetra, ledvice in vranico so zbrali, stehtali in pregledali, da bi odkrili morebitne morfološke razlike pri žrtvovanju.

Oblikovanje in optimizacija primerjev in sonde za kvantifikacijo Ellagibacter in Enterocloster s qPCR

Zaporedja genov 16S rRNA Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T in E. bolted CEBAS S4A9 so bila pridobljena iz baze podatkov GenBank (baza EMBL). Sekvence so bile usklajene s filogenetsko podobnimi bakterijskimi generacijami z uporabo programske opreme Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 11) in pregledane za regije ohranjenih in spremenljivih sekvenc, da bi oblikovali primerje in sonde za odkrivanje in kvantificiranje Ellagibacter in Enterocloster (tabela 1). Primerska sonda je bila zasnovana in potrjena z orodji Primer Questand Oligo Analyzer (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgija). Sonda TaqMan je bila na 5' in 3' koncu označena s 6-karboksi-fluoresceinsko skupino (6FAM) oziroma dušilec robid (BBQ). qPCR je bil izveden z uporabo sistema za odkrivanje zaporedja ABI 7500. Končne koncentracije vsakega primerja in sonde so bile 300 in 375 nM za Ellagibacter ter 200 in 500 nM za Enterocloster. Izveden je bil običajen protokol qPCR za pomnoževanje DNK Ellagibacter inEnterocloster oz. Profil povečevanja za amplifikacijo Ellagibactera je bil 1 cikel pri 95 stopinjah za 5 minut, čemur je sledilo 45 ciklov pri 95 stopinjah za 15 s, 50 stopinjah za 40 s in 72 stopinjah za 31 s. Nazadnje je bil dodan 1 cikel pri 72 stopinjah za 5 minut . Profil povečanja za pomnoževanje Enterocloster je bil 1 cikel pri 95 stopinjah za 5 minut, ki mu je sledilo 40 ciklov 95 stopinj za 15 s, 65 stopinj za 40 s in 72 stopinj za 31 s. Na koncu je bil dodan 1 cikel pri 72 stopinjah za 5 minut.

Ekstrakcija fekalne DNK in analize črevesnih mikrobov

Ekstrakcijo DNK iz fekalnih vzorcev smo izvedli s kompletom za čiščenje tkivne DNK NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Nemčija), po navodilih proizvajalca z nekaj modifikacijami. DNA je bila kvantificirana s fluorimetrijo (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK), čistost pa je bila izmerjena iz razmerja absorbance pri valovni dolžini 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK). ). Sestava črevesne mikrobiote je bila določena s sekvenciranjem variabilnih regij V3 in V4 gena 16S rRNA po protokolih Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, ZDA) z dolžino branja 2 × 300 bp seznanjenega konca (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Metagenomsko sekvenciranje je bilo izvedeno na platformi MiSeq-Illumina (FISABIO sequencingservice, Španija). Obdelava podatkov, odstranitev himernega zaporedja, poravnava zaporedja in združevanje zaporedja gena 16S rRNA so bili izvedeni, kot je opisano drugje, da bi dobili taksonomsko razvrstitev.8,27 Pomnoževanje DNK Gordonibacterja je bilo doseženo v sistemu ABI 7500 qPCR, kot je opisano prej.19,28 Enterocloster in Ellagibacter- specifični primerji in sonde, zasnovani v tej študiji, so bili uporabljeni po zgoraj opisanem protokolu qPCR. Za kvantifikacijo so bile uporabljene standardne krivulje genomske DNK Gordonibacter, Enterocloster in Ellagibacter. Vsi vzorci blata so bili analizirani v treh izvodih.

Ekstrakcija, odkrivanje in kvantifikacija urolitinov v vzorcih blata

Fekalne vzorce ({{0}}.2–0.5 g) ekstrahiramo v razmerju 1:10 z raztopino MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), nakisano z 0.1% HCl in homogenizirano z vrtinčenjem 2 minuti in stresanjem pri 1500 obratih na minuto pri sobni temperaturi 10 minut v blok grelniku. Suspenzijo centrifugiramo pri 14 000g pri 4 stopinjah 10 minut in supernatant filtriramo skozi membranski filter PVDF 0,22 µm (Millipore Corp., Bedford, MA) in 3× razredčimo z MeOH (0,1 % mravljinčna kislina). ) pred injiciranjem v sistemu UPLC-ESI-QTOF-MS. Sistem UPLC (Agilent 1290Infinity), povezan s kvadrupolnim sistemom za merjenje časa preleta (QTOF) LC/MS (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Nemčija), je bil uporabljen za analizo fekalnih metabolitov z uporabo metode gradientne elucije, kot je opisano prej .29,30 Na kratko, ločevanje je bilo izvedeno v reverzno-fazni koloni Poroshell 120 EC-C18 z uporabo vode in acetonitrila, oba nakisana z 0,1 % mravljinčne kisline, kot mobilni fazi. Hitrost pretoka je bila 0,4 mL min-1, volumen injekcije pa 5 µL. Za obdelavo podatkov je bila uporabljena programska oprema MassHunter Qualitative Analysis (različica B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Nemčija). Vsi metaboliti so bili identificirani z neposredno primerjavo s standardi in potrjeni z njihovo molekulsko maso. Umeritvene krivulje so bile pridobljene za EA in različne Uros z dobro linearnostjo (R2 > 0,99).

Hematologija in klinična kemija

Hematološke spremenljivke so bile določene v heparinizirani krvi z uporabo avtomatskega hematološkega analizatorja s specifično programsko opremo za vzorce krvi podgan (AVDIA 120, Siemens, München, Nemčija). Analizirane spremenljivke so bile povprečni korpuskularni volumen (MCV), srednji korpuskularni hemoglobin (MCH), srednja koncentracija korpuskularnega hemoglobina (MCHC), porazdelitev eritrocitov (RDW), srednji volumen trombocitov (MPV), trombocitni krit (PCT), širina porazdelitve trombocitov (PDW). , povprečna trombocitna komponenta (MPC), povprečna masa trombocitov (MPM), število trombocitov (PLT), vsebnost retikulocitnega hemoglobina (CHr) in srednji retikulocitni korpuskularni volumen (MCVr). Biokemične spremenljivke plazme, kalcij (Ca) in fosfor (P) so analizirali s kemijskim in toksikološkim analizatorjem Olympus AU400 (Beckman Coulter, Kalifornija, ZDA). Biokemične spremenljivke so bile celotne beljakovine (PROT), albumin (ALBU), globulin (GLOB), kreatinin (CREA), glukoza (GLUC), holesterol (CHOL), trigliceridi (TRIGL), alkalna fosfataza (ALP), gama-glutamil transpeptidaza ( GGT), aspartat aminotransferazo (AST) in alanin aminotransferazo (ALT). Končno so bile ravni tiroksina (T4) analizirane s sistemom IMMULITE® 1000immunoassay (Siemens).

Statistična analiza

Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon (SD). Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo SPSS različica 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA), razlike pa s p < 0.05 veljajo za statistično pomembne. Normalnost podatkov je bila ocenjena s testom Shapiro–Wilk. Primerjave med različnimi zdravljenimi skupinami so bile izvedene z uporabo ponovljene izmerjene analize variance (RM ANOVA) s Tukeyjevim ali Dunnettovim post hoc testom T3, odvisno od tega, ali so podatki sledili normalni ali nenormalni porazdelitvi. Razlike med moškimi in ženskami so bile raziskane s pomočjo seznanjenega Studentovega t-testa ali Wilcoxonovega testa signedrank, ko so bili podatki normalno oziroma nenormalno porazdeljeni. Hi-kvadrat linearna diskriminantna analiza effectize (LEfSe) je bila uporabljena za odkrivanje diferencialnih bakterijskih značilnosti med skupinami. Pearsonova korelacija je bila uporabljena za analizo možnih povezav med spremenljivkami v normalno porazdeljenih podatkih, medtem ko je bila Spearmanova korelacija uporabljena v nenormalno porazdeljenih podatkih. Podatkovne ploskve so bile izvedene z uporabo Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, ZDA).

Naravno zeliščno zdravilo za lajšanje zaprtja - Cistanche

Cistanche je rod parazitskih rastlin, ki spada v družino Orobanchaceae. Te rastline so znane po svojih zdravilnih lastnostih in se že stoletja uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini (TCM). Vrste Cistanche najdemo predvsem v sušnih in puščavskih regijah Kitajske, Mongolije in drugih delov Srednje Azije. Za rastline Cistanche so značilna mesnata, rumenkasta stebla in so zelo cenjene zaradi potencialnih koristi za zdravje. V TKM se verjame, da ima Cistanche tonične lastnosti in se običajno uporablja za hranjenje ledvic, povečanje vitalnosti in podporo spolne funkcije. Uporablja se tudi za reševanje težav s staranjem, utrujenostjo in splošnim dobrim počutjem. Čeprav ima Cistanche dolgo zgodovino uporabe v tradicionalni medicini, znanstvene raziskave o njeni učinkovitosti in varnosti še potekajo in so omejene. Vendar pa vsebuje različne bioaktivne spojine, kot so feniletanoidni glikozidi, iridoidi, lignani in polisaharidi, ki lahko prispevajo k njegovim zdravilnim učinkom.

Wecistanchejevacistanche v prahu, cistanche tablete, cistanche kapsule,in drugi izdelki so razviti z uporabopuščavacistanchekot surovine, vse skupaj pa dobro vpliva na lajšanje zaprtja. Specifični mehanizem je naslednji: Cistanche naj bi imel potencialne koristi za lajšanje zaprtja na podlagi tradicionalne uporabe in nekaterih spojin, ki jih vsebuje. Medtem ko so znanstvene raziskave o učinku Cistanche na zaprtje omejene, se domneva, da ima več mehanizmov, ki lahko prispevajo k njegovemu potencialu za lajšanje zaprtja. Odvajalni učinek:Cistanchese že dolgo uporablja v tradicionalni kitajski medicini kot zdravilo za zaprtje. Domneva se, da ima blag odvajalni učinek, ki lahko pomaga spodbujati gibanje črevesja in povzroči zaprtje. Ta učinek je mogoče pripisati različnim spojinam v Cistancheju, kot so feniletanoidni glikozidi in polisaharidi. Vlaženje črevesja: Na podlagi tradicionalne uporabe velja, da ima Cistanche vlažilne lastnosti, posebej usmerjene na črevesje. Spodbujanje hidracije in mazanja črevesja lahko pomaga zmehčati orodja in olajšati lažji prehod ter tako ublažiti zaprtje. Protivnetni učinek: zaprtje je lahko včasih povezano z vnetjem v prebavnem traktu. Cistanche vsebuje določene spojine, vključno s feniletanoidnimi glikozidi in lignani, za katere se verjame, da imajo protivnetne lastnosti. Z zmanjšanjem vnetja v črevesju lahko pomaga izboljšati rednost odvajanja blata in lajša zaprtje.