Zaviranje agregacije amiloida beta in odlaganje vodnega ekstrakta Cistanche Tubulosa

1. Uvod

Demenca je ena najpogostejših kroničnih bolezni staranja. Leta 2015 je Svetovno poročilo o Alzheimerjevi bolezni ocenilo, da je približno 46,8 milijona ljudi zbolelo za demenco, leta 2030 pa naj bi jih bilo 74,7 milijona, leta 2050 pa 131,5 milijona. Svetovna populacija demenc bo iz leta v leto naraščala in bo v prihodnosti ušla izpod nadzora. . Svetovni zdravstveni izdatki za zdravljenje demence so leta 2010 znašali skoraj 604 milijarde ameriških dolarjev, leta 2030 pa naj bi ta znesek znašal 1000 milijard. Bolniki z demenco imajo večje tveganje za naključno smrt in zato potrebujejo več zdravstvene oskrbe. To je veliko breme za družinske negovalce bolnikov z demenco. Vpliv demence na negovalce, družino in družbo lahko povzroči velik fizični, psihološki, življenjski in ekonomski stres. Obstajata dve glavni obliki demence, Alzheimerjeva bolezen (AD) in vaskularna demenca. AD je najpogostejša demenca in je ireverzibilna in progresivna nevrodegenerativna motnja. AD je bil leta 2015 šesti najpogostejši vzrok smrti v Združenih državah.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPREČEVANJE AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nedavne študije potrjujejo, da je toksičnost za nevrone, ki jo povzroči agregacija amiloidnega peptida (A ) (plaki) in proteina tau (zapletki), tesno povezana s patogenezo AD. Kopičenje A in proteina tau v možganih lahko povzroči poškodbe nevronov in izgubo spomina. Netopni oligomeri A se kopičijo v zunajceličnih plakih in naj bi povzročili sinaptično disfunkcijo, toksičnost za nevrone in celično smrt. Na žalost zaenkrat ni na voljo učinkovitega zdravljenja za čiščenje A in proteina tau, zaviranje tvorbe ali oligomerizacije A ter začasno ali ozdravljeno nepopravljivo poškodbo nevronov. Sedanja terapevtska sredstva, kot sta galantamin in donepezil, ki sta zaviralca acetilholinesteraze, lahko samo začasno ublažijo izgubo spomina s povišanjem ravni nevrotransmiterjev. Leta 2012 nobeno kandidatno zdravilo ni moglo zmanjšati učinka A v velikih kliničnih študijah bolnikov z AD. Zato so nujno potrebne raziskave za novo zdravljenje za zatiranje razširjenosti Alzheimerjeve bolezni. Kovinski ioni so nedavno veljali za ključni dejavnik, ki je tesno povezan z agregacijo A. Kelatorji kovin, ki veljajo za potencialne spojine svinca, zagotavljajo popolnoma novo strategijo za pristop proti AD.

Posušeno steblo Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, se pogosto nabira v puščavi Xhinjang na Kitajskem. Je pomembna tradicionalna kitajska medicina, ki spada v tonično kitajsko medicino, ki je navedena v Kitajski farmakopeji in se že tisočletja uporablja za zdravljenje telesne oslabelosti, odpovedi ledvic, neplodnosti, pozabljivosti, impotence in senilnega zaprtja.C. tubulosa vodni izvleček (CTE)kapsule so bile na Kitajskem odobrene kot botanično zdravilo za vaskularno demenco. Glede na klinično preskušanje pri 18 bolnikih z diagnozo blage do zmerne AD so kapsule CTE bolnikom zagotovile stabilnejše stanje spomina v primerjavi z zaviralci acetilholinesteraze. V naši prejšnji študiji je CTE zmanjšal odlaganje amiloidnega peptida (A) in izboljšal izgubo spomina pri podganah, podobnih Alzheimerjevi bolezni. Feniletanoidni glikozidi, ehinakozid (1), akteozid (2) in izoakteozid (3) veljajo za glavne sestavine CTE. Spojina 1 deluje nevroprotektivno proti toksičnosti 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), 1-metil{{13 }}fenilpiridinijev ion (MPP+) in 6-hidroksidopamin (6-OHDA). Naše prejšnje poročilo je pokazalo, da je 1 zaviral oligomerizacijo in toksičnost A v študiji in vitro ter zaviral odlaganje A, izboljšal oslabljen spomin in kognitivno disfunkcijo pri podganah, ki jih povzroča A. Spojini 2 in 3 sta povečali razgradnjo A in zmanjšali oligomerizacijo A in vitro. Spojina 3 je zmanjšala odlaganje A pri podganah, induciranih z A. Na podlagi teh študij je C. tubulosa že dokazala, da ima potencial za zdravljenje AD. CTE je tesno povezan z agregacijo in odlaganjem anti-A. Da bi bolje razumeli mehanizem CTE, moramo imeti priročno in učinkovito metodo za identifikacijo aktivne komponente, pa tudi vsebine v vzorcih možganskega tkiva. Večina študij je bila zasnovana za kvantitativno določanjeehinakozid, akteozid in izoakteozid v zeliščihali živil s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), vendar sta bili samo dve študiji za določanje v serumu ali tkivih. Vendar pa ni poročila o sočasni analizi 1–3 v možganskih tkivih po peroralni uporabi CTE. Poleg tega iz nedavnih študij še vedno ni jasno, ali so aktivne komponente CTE ali njihovi metaboliti uspešno prešli skozi krvno-možgansko pregrado in delovali na možganske nevrone. Zato ta raziskava zagotavlja napredno in občutljivo metodo s prepričljivimi dokazi, ki jasno prikazujejo osnovni mehanizem CTE proti agregaciji in odlaganju A.

2. Rezultati

2.1. Izolacija in identifikacija treh glavnih spojin (1–3)

Posušena stebla C. tubulosa smo ekstrahirali s 75 % EtOH pri sobni temperaturi. Kondenzirani 75-odstotni ekstrakt EtOH smo izpostavili kolonski kromatografiji na smoli in C18, da smo dobili tri glavne spojine, ehinakozid (1),akteozid (2) in izoakteozid(3). Njihove strukture so bile pojasnjene z analizo NMR (jedrske magnetne resonance) spektroskopije in ESI-MS (elektrospray ionizacijske mase) ter s primerjavo z literaturnimi podatki (slika 1, dodatni materiali, slike S3–S11).

2.2. Test vsebnosti feniletanoidnih glikozidov (1–3) iz CTE

Testna metoda je bila validirana za analizo feniletanoidnih glikozidov. Spojine 1–3 (5.0 mg) smo natančno stehtali in zmešali s 50% metanolom (40 ml). Mešanice so bile sonicirane 5 minut. Standardna raztopina treh feniletanoidnih glikozidov (1–3) je bila zmešana kot standardna osnovna raztopina (100 ug/mL). Standardno osnovno raztopino smo uporabili za pripravo petih različnih koncentracij (5, 10, 25, 50 in 100 ug/mL) navedenih raztopin z redčenjem s serijskimi volumni 50 % metanola. Krivulje feniletanoidnih glikozidov (1–3) so bile določene s tekočinsko kromatografijo z ultrazmogljivostjo (UPLC) od 5–100 ug/mL in so bile linearne (1, r2= 0.9999; 2, r{{25} }.9999; r2= 0.9998). Natančnost znotraj dneva in med dnevi [% RSD (relativni standardni odklon) je bil od 0,1 do 1,8 %] in natančnost (95,6–104,2 %) sta bili sprejemljivi z UPLC za 1–3. UPLC je kvantificiral vsebnosti CTE 1, 2 in 3 na 254, 38 oziroma 41 mg/g (slika S2).

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE BOLNIKOV Z AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. Validacija UPLC/MS/MS

Feniletanoidne glikozide (1–3) smo zmešali in dodali homogenatu možganskega tkiva podgan ter analizirali s tandemskim masnim spektrometrom s tekočinsko kromatografijo Ultra zmogljivosti (UPLC/MS/MS) z ekstrakcijo v trdni fazi. Spodnja meja zaznave (LLOQ) 1–3 je bila 0,2 ng/mL. Izkoristek feniletanoidnih glikozidov s homogenatom možganskega tkiva (10 ng/mL) je bil 91,39 % za 1, 89,54 % za 2 oziroma 96,81 % za 3 (slika 2).

2.4. Analiza AD-podobnih možganskih tkiv podgan

Po 14 dneh peroralnega dajanja CTE (200 mg/kg/dan) so AD-podobna možganska tkiva podgan zbrali in razdelili na dva dela, hipokampus in striatum, in oba homogenizirali. Ker je bilo homogenatov hipokampusa in striatuma iz vsake podgane premajhno, da bi jih naložili v ekstrakcijo v trdni fazi in da bi se izognili pretiranim eksperimentalnim napakam, smo homogenate hipokampusa in striatuma iz štirih posameznih podgan zmešali v analizirani vzorec za UPLC/MS/MS z uporabo trdne snovi. metoda fazne ekstrakcije (slika 3A, B). Feniletanoidne glikozide (1–3) so opazili v hipokampusu (slika 3A) in striatumu (slika 3B). V praznih možganskih tkivih ni bilo pomembnega vrha (slika 3C). V hipokampusu je bila vsebnost ehinakozida 11,97 ± 0,34 ng/mL, vsebnost akteozida 1,25 ± 0,16 ng/mL in vsebnost izoakteozida 1,38 ± 0,08 ng / ml. V striatumu je bila vsebnost ehinakozida 22,60 ± 1,69 ng/mL, vsebnost akteozida 2,03 ± 0,61 ng/mL in vsebnost izoakteozida 4,90 ± 0,64 ng/mL. Kot je prikazano na sliki 4, bi CTE prešel skozi krvno-možgansko pregrado v skladu s pomembnimi zaznavnimi količinami 1–3 v hipokampusu in striatumu. Vsebnost 1 je veliko višja od 2 in 3 v CTE z analizo UPLC (slika S2). Zato je smiselno opaziti, da je 1 najvišji v možganskem tkivu po peroralni uporabi CTE.

2.5. Feniletanoidni glikozidi (1–3) Kelatna aktivnost kovin

V literaturi je bilo določanje spojin brez spojin in njihovih kovinskih kompleksov izvedeno s HPLC. Merilo kelacijske aktivnosti je v tej študiji analiziral UPLC. 50 µg/mL raztopine vsakega od feniletanoidnih glikozidov (1–3) smo dodali v 10 µg/mL raztopino bakra (Cu), kalcija (Ca), magnezija (Mg), cinka (Zn), železa (Fe). ) oziroma podganji serum. Vsako spojino z vsako kovinsko raztopino ali serumom smo analizirali z UPLC. Feniletanoidni glikozidi (1–3) so pokazali aktivnost kelatiranja kovin z železom in serumom (slika 5, slika S1 dodatnega materiala).

2.6. Analiza ehinakozida (1) v serumu podgan in vivo

Da bi razumeli porazdelitev ehinakozida v serumu podgan, smo serum zbrali od začetnega časa do 720 minut po peroralnem dajanju ehinakozida (1) (100 mg/kg) in analizirali z UPLC. Slika 6 prikazuje profile koncentracije ehinakozida v serumu podgan v odvisnosti od časa.

3. Razprava

Demenca, zlasti AD, je nepopravljivo staranje in kronična bolezen, ki vodi v gordijski vozel vprašanj. Ta nepremagljiva bolezen vodi v resne gospodarske težave z velikim in naraščajočim finančnim bremenom. Po vsem svetu so raziskovalci AD vložili veliko truda v raziskovanjenova zdravila proti ADvendar ni uspelo v več velikih kliničnih preskušanjih, ki so ciljala na A leta 2012. Razen neposrednega ciljanja na A se homeostaza kovinskih ionov v možganih šteje za ključni razlog, povezan z agregacijo in odlaganjem A, ki vodi do nastanka AD. Zato imajo kovinski ioni bistveno vlogo v patogenezi AD, hipoteza o kelaciji kovin pa je postala pomembna raziskovalna smer.

Glede na naše prejšnje študije,CTE je pokazal potencialno aktivnost proti demenci. Celo v kliničnih študijah pri ljudeh po 1 letu zdravljenja s kapsulami CTE pri bolnikih z zmernim AD rezultat na lestvici za ocenjevanje Alzheimerjeve bolezni – kognitivna podlestvica (ADAS-cog) ne bi pokazal pomembnega poslabšanja v primerjavi s pred zdravljenjem. CTE je ohranil rezultat ADAS-cog bolnikov z AD stabilen, druga zdravila na recept pa ne. Edina izbira zdravil na recept z dovoljenjem zazdravljenje ADso zaviralci acetilholinesteraze (AChEI), kot sta donepezil in galantamin, ki kratkoročno izboljšajo simptome AD, poslabšanje pa nastopi po 1 letu zdravljenja. Na podlagi kliničnih študij ima CTE možnost, da postane potencialno zdravilo za razvoj sredstev proti AD. Na podlagi naših prejšnjih poročil bi ehinakozid (1), akteozid (2) in izoakteozid (3) ščitili nevrone pred poškodbami z A , zmanjšali oligomerizacijo A in vitro in znatno izboljšali kognitivno disfunkcijo, ki jo povzroča A in vivo. Študija in vitro je pokazala, da so bili aktivni odmerki 1–3 do 5{{10}} µg/mL. Vendar so prejšnje študije menile, da je bila peroralna biološka uporabnost 1 in 2 pri podganah zelo nizka (0,83 % za 1 in 0,12 % za 2). Spojine 1 ni bilo mogoče niti identificirati v človeškem serumu po peroralni uporabi tablete ehinaceje. Trenutne študije kažejo, da je imelo 1–3 slabo prepustnost membrane in absorpcijo v črevesnih celicah, večina 1 pa bi se presnovila v prebavnih kanalih. Vsebnost spojine 2 v serumu podgan je bila le približno 4,5 µg/mL po 15 minutah intravenske injekcije z odmerkom 10 mg/kg akteozida. Vendar pa ta študija kaže, da bi 1–3 odkrili v hipokampusu in striatumu možganskih tkiv podgan po peroralnem dajanju CTE (sliki 3 in 4). Poleg tega je slika 6 pokazala, da se je vsebnost spojine 1 v serumu podgan povečala približno 5-krat od 15 minut do 720 minut po peroralnem dajanju spojine 1 (100 mg/kg). Menili smo, da bi feniletanoidni glikozidi CTE prešli skozi krvno-možgansko pregrado in da bi prišlo do kelacijskega delovanja med CTE in kovino. Kelacija je reverzibilna kemična reakcija. Železo je bistveni element v serumu in možganih [10,40]. Slika 5 prikazuje, da bi imeli trije feniletanoidni glikozidi aktivnost keliranja kovin z železom in serumom. Železo in serum spremenita največje območje zadrževalnega časa treh feniletanoidnih glikozidov. Kelacija železa je lahko ključni razlog, ki vodi do napačne identifikacije zelo nizke biološke uporabnosti feniletanoidnih glikozidov. Zato je treba pri analizi krvnega seruma in možganov treh CTE feniletanoidnih glikozidov upoštevati aktivnost kelatiranja kovin, da se povrne dejanska biološka uporabnost in farmakokinetika. Poleg tega so rezultati pokazali, da bi trije feniletanoidni glikozidi (1–3) prešli skozi krvno-možgansko pregrado in prispeli v možganska tkiva skozi krvni obtok. Ta študija je razvila najhitrejšo in občutljivo metodo za analizo 1–3 z uporabo UPLC/MS/MS in zagotovila močne dokaze, ki dokazujejo, da so feniletanoidni glikozidi (1–3) glavne bioaktivne sestavine CTE.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPREČEVANJE ALZHEIMERJEVE BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materiali in metode

4.1. Rastlinski material

Stebla C. tubulosa so bila zbrana maja 2016 v mestu Hangzhou na Kitajskem. Rastlina je bila identificirana z vzorci Dr. Lin HC Voucher (št. 20016CT), ki so bili deponirani pri Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kitajska.

4.2. Izolacija in čiščenje

Posušeno steblo C. tubulosa smo zmleli v prah in nato petkrat ekstrahirali s 75 % EtOH. Po uparjenju topila pod znižanim tlakom smo surovi ekstrakt izpostavili kolonski kromatografiji z makroporozno smolo AB-8 z gradientnimi sistemi topil H2O/EtOH od 20 % EtOH do 100 % EtOH. Glede na tankoplastno kromatografijo smo zbrali štiri frakcije (Fr.1~Fr.4) za nadaljnje ločevanje. Fr. 2 smo podvrgli preparativni tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti (HPLC) na koloni COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm × 20 mm id, 5 µm) z uporabo 18 % acetonitrila kot sistema mobilne faze. Hitrost pretoka je bila 15 ml/min. Selektivno so bili zbrani trije glavni vrhovi zanimanja. Frakcije, ki vsebujejo ciljne spojine, smo nadalje kondenzirali do suhega in proizvedli 1, 2 oziroma 3.

4.3. Eksperimentalna analiza

1H in 13C NMR spektre smo dobili s spektrometri Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, ZDA) s tetrametilsilanom (TMS) kot internim standardom. Pripravljalna HPLC je bila izvedena z uporabo kolone z reverzno fazo (kolona Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm id; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonska) na seriji Shimadzu LC-6AD aparat z detektorji Prominence HPLC UV-Vis (Kyoto, Japonska).

Ehinakozid (1): bel prah; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 5 107 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{ {80}}}.9 Hz, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40), 5,17 (1H, d, J=1.5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H-500 ), 6,94 (1H, dd, J=8.3, 2.0 Hz, H-600 ), 7.05 (1H, d, J=2.0 Hz, H-200 ), δ 7,59 (1H, d, J=15.9 Hz, H-700 ); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}} ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50 ), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20 ), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30 ) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10 ), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200 ), 115,3 (C{{ 189}} ), 116,3 (C-500 ), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}} ), 127,6 (C-100 ), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (slika S3–S5).

Akteozid (2): bel prah; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94 (3H, d, J =5.9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7.8 Hz, H-100), 4,70 (1H, t , J=9.{{160}} Hz, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}}), 6,18 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H{{57} }), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz, H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60) 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 5 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{95}) } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{{110} } ), 71,7 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{170} } ) (slike S6–S8). Izoakteozid (3): bel prah; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 5 1,07 (3H, d, J=6.1 Hz, H-6000), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10.0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H-1000), 6,27 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80 ), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 ,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8.2 Hz, H-60), 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 ( 1H, d, J=15.8 Hz, H-70 ); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 5 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400 ), 70,6 (C-3000 ), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000 ), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9 (C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,6 (C-90 ) (Slike S9–S11).

4.4. Priprava vodnega izvlečka C. Tubulosa (CTE)

Prašek stebla C. tubulosa smo dvakrat ekstrahirali z refluksiranjem z vodo 1,5 ure in raztopino ekstrakta filtrirali. Filtriran vodni ekstrakt (CTE) smo pred uporabo shranili pri 4 ◦C.

4.5. Živalski model in urnik poskusov

Podganji model, podoben AD, in eksperimentalni urnik, uporabljen v tej študiji, sta bila predpisana v naši prejšnji študiji [19]. Po infuziji A 1–42 (300 pmol/dan) v možganski ventrikel vsaj dva tedna ali več so AD-podobnim podganam naslednji dan peroralno dajali CTE (200 mg/mL). Po 14 dneh dajanja so podgane žrtvovali, da so zbrali možganska tkiva. Da bi se izognili prevelikim eksperimentalnim napakam, smo vzorce štirih posameznih podgan združili v en vzorec. Za vsako skupino so bili trije vzorci.

4.6. Kemikalije in reagenti

Metanol (stopnja HPLC) je bil kupljen pri Mercku (Darmstadt, Nemčija). Mravljinčna kislina (98 % za analizo, ACS) je bila kupljena pri Panreac (Barcelona, ​​Španija). Acetonitril (razred HPLC) je bil kupljen pri JT Baker (Phillipsburg, NJ, ZDA). Čisto vodo smo pripravili s sistemom ELGA (Woodridge, UK). Hesperidin je bil kupljen pri Chromadexu in uporabljen kot interni standard (IS) za analizo UPLC.

4.7. UPLC/MS/MS aparat

Za analizo UPLC/MS/MS je bil uporabljen Waters Acquity TQD ultrazmogljivi tekočinski kromatograf (UPLC)/MS/MS System (Milford, MA, ZDA). Kromatografski poskusi so bili izvedeni na koloni Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm, Waters) pri gradientnem eluiranju pri hitrosti pretoka 0,4 ml/min. Mobilna faza je bila sestavljena iz mravljinčna kislina-voda (1:1000, v/v) (A) in mravljinčna kislina-acetonitril (1:1000, v/v) (B). Časovni program je bil naslednji: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) spremenjeno v A–B (62:38, v/v); 5–7 min, AB (62:38, v/v); 7-7.1 min, AB (62:38, v/v) spremenjeno v A–B (92:8, v/v); 7,1–9 min, (92:8, v/v). Volumen injiciranja je bil 5 µL v sistem UPLC/MS/MS z virom ionov z negativno ionizacijo z elektrosprejem (ESI). Skupni ionski kromatogrami (TIC) za 1–3 so bili izvedeni z uporabo načina spremljanja več reakcij (MRM). Masni parametri so bili optimizirani za pridobitev najbolj jasnih signalov visoke intenzivnosti. Najboljša izbira parametrov je bila opisana kot kapilarna napetost 3000 V, napetost stožca 20 V, temperatura vira 125 ◦C, temperatura desolvatacije 400 ◦C, pretok plina v stožcu 50 L/h, pretok plina desolvatacije 900 L/h in trk 38 eV energija. Podatki so bili obdelani s programsko opremo MassLynx 4.1 (Milford, MA, ZDA).

4.8. Priprava vzorca

Podganje možgansko tkivo je za homogenizacijo uporabilo 50% metanol (1 g tkiva za 5 ml metanola). Homogenat centrifugiramo pri 10,000 obratih na minuto pri 4 ◦C 10 minut. Supernatant (50 µL) z 10 µL IS (100 µg/mL) je dodal čisto vodo v 1 mL. Zmes smo previdno naložili na Oasis HLB (hidrofilno-lipofilno uravnoteženo) kartušo (Waters, Milford, MA, ZDA), ki je bila že eluirana z 1 ml metanola in nato uravnotežena z 1 ml vode pod vakuumskimi pogoji. Potem ko smo za pranje vložka uporabili 1 ml 10 % metanola, smo za eluiranje uporabili 1 ml metanola, da smo dobili analizirani vzorec, ki smo ga prenesli v drugo 1,5 ml Eppendorfovo epruveto z 10 µL 1 % raztopine askorbinske kisline in posušili z izhlapevanjem. Nazadnje smo ostanek iz analiziranega vzorca za analizo raztopili v 200 µL 50 % metanola.

4.9. Priprava kalibracijske standardne krivulje

Spojine 1–3 so bile uporabljene za pripravo umeritvenih standardov, dodanih v homogenat možganskega tkiva in hesperidin kot interni standard, da smo dobili končne koncentracije umeritvenih standardov, ki so bile 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50.0 in 100,0 ng/mL.

4.10. Validacija

Umeritvena standardna krivulja je bila pridobljena s testom linearnosti z uporabo petih različnih koncentracij 1–3 v območjih 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 oziroma 100,0 ng/mL in je veljalo za linearno z več kot 0,99 koeficientom determinacije (R-kvadrat). Spodnja meja zaznave (LLOQ), opredeljena kot ± 20 % koncentracije preskusnega vzorca, je povzročila vrh signala in ne šuma. Verodostojnost in točnost analizne metode sta bili ovrednoteni s testom izkoristka pri 10 ng/mL 1–3.

4.11. Test kelatne aktivnosti kovin

UPLC je bil uporabljen za analizo učinka keliranja kovin z uporabo 50 µg/mL raztopine CTE feniletanoidnih glikozidov 1–3, ki vsebuje 10 µg/mL kovinske raztopine bakra, kalcija, magnezija, cinka, železa ali podganjega seruma. Vsako spojino z vsako kovinsko raztopino ali serumom smo analizirali z UPLC. Učinek keliranja kovin bi spremenil retencijski čas za 1–3 v tekočinski kromatografiji. Odstotek učinka kelatiranja kovin je bil izračunan kot spodaj, podatki pa so predstavljali povprečje ± SD (n=3).

5. Sklepi

Ta študija je pokazala, da so 1–3 aktivne komponente CTE za aktivnost proti AD. Kelacija železa je postala nov koncept za oblikovanje nove generacije zdravil za zdravljenje AD.CTE je potencialno botanično kitajsko zdravilo proti ADciljanje na agregacijo in odlaganje A, povzročeno s kelacijo železa. Poleg tega smo dodatno dokazali, da bi 1–3 doseglo možgane skozi krvno-možgansko pregrado (BBB). Aktivne komponente in potrditev osnovnega mehanizma CTE bodo v prihodnosti močno pripomogli k nadzoru kakovosti in biološki uporabnosti študij izdelkov. Hkrati bo predstavljena napredna in učinkovita analizna metoda uporabna pri določanju 1–3 v rastlinah, hrani, krvi in ​​možganskih tkivih za kemične prstne odtise in farmakokinetične raziskave.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE ALZHEIMERJEVE BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%