Cistancheima tudi funkcijospodbujanje proizvodnje kolagena, ki lahko poveča elastičnost in sijaj kože ter pomagaobnoviti poškodovane kožne celice. CistancheFeniletanolni glikozidiimajo pomemben zaviralen učinek na aktivnost tirozinaze, učinek na tirozinazo pa je kompetitivna in reverzibilna inhibicija, kar lahko zagotovi znanstveno podlago za razvoj in uporabo belilnih sestavin v Cistancheju. Zato ima cistanča ključno vlogo v kožibeljenje. Lahkozavirajo proizvodnjo melaninaza zmanjšanje razbarvanja in motnosti; in spodbuja proizvodnjo kolagena za izboljšanje elastičnosti in sijaja kože. Zaradi splošnega priznanja teh učinkov cistanche so številni izdelki za beljenje kože začeli vsebovati zeliščne sestavine, kot je cistanche, da bi zadovoljili povpraševanje potrošnikov, s čimer se je povečala komercialna vrednost cistanche v izdelkih za beljenje kože. Če povzamemo, je vloga cistanche pri beljenju kože ključna. Njegovoantioksidantučinek inučinek na proizvodnjo kolagenalahko zmanjša razbarvanje in otopelost, izboljša elastičnost in sijaj kože ter tako doseže učinek beljenja. Poleg tega široka uporaba Cistanche v izdelkih za beljenje kože dokazuje, da njene vloge pri komercialni vrednosti ni mogoče podcenjevati.

Kliknite Organic Cistanche za beljenje

Za več informacij:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Tirozinaza je encim, ki omejuje hitrost proizvodnje melanina in je zato najpomembnejša tarča za zaviranje hiperpigmentacije. Ugotovljeni so bili številni zaviralci tirozinaze, vendar večina od njih nima klinične učinkovitosti, ker so bili identificirani z uporabo gobje tirozinaze kot tarče. Zato smo uporabili rekombinantno humano tirozinazo za pregled knjižnice 50,000 spojin in primerjali aktivne rezultate presejanja z dobro znanimi belilnimi sestavinami. Hidrokinon in njegov derivat arbutin sta le šibko zavirala humano tirozinazo s polovično največjo inhibitorno koncentracijo (IC50) v milimolarnem območju, kojična kislina pa je pokazala šibko učinkovitost (IC50 > 500 mmol/L). Najmočnejši zaviralci človeške tirozinaze, identificirani v tem pregledu, so bili derivati ​​resorcinol-tiazola, zlasti na novo identificirani Thiamidol (Beiersdorf AG, Hamburg, Nemčija) (izobutil amido tiazolil resorcinol), ki je imel IC50 1,1 mmol/L. Nasprotno pa je tiamidol le šibko zaviral gobjo tirozinazo (IC50 =108 mmol/l). V kulturah melanocitov je tiamidol močno, a reverzibilno zaviral nastajanje melanina (IC50 =0.9 mmol/L), medtem ko je hidrokinon ireverzibilno zaviral melanogenezo (IC50 = 16.3 mmol/L). Klinično je Thiamidol vidno zmanjšal videz starostnih peg v 4 tednih in po 12 tednih nekaterih starostnih peg ni bilo več mogoče razlikovati od normalne sosednje kože. Celoten potencial tiamidola za zmanjšanje hiperpigmentacije človeške kože je treba raziskati v prihodnjih študijah.

UVOD

Melazma, aktinični in senilni lentigini ter postinflamatorna hiperpigmentacija so glavne kozmetične težave, zaradi katerih mnogi bolniki poiščejo zdravniško pomoč. Na splošno te motnje pogosteje in resneje prizadenejo populacije s temnejšo poltjo (Stratigos in Katsambas, 2004). Za zdravljenje hiperpigmentiranih motenj je na voljo veliko lokalnih izdelkov, ki vsebujejo različne aktivne sestavine za zmanjšanje proizvodnje in/ali porazdelitve melanina. Čeprav je mogoče hiperpigmentacijo kože zmanjšati z različnimi mehanizmi (Briganti et al., 2003), je tirozinaza, encim, ki omejuje hitrost proizvodnje melanina, očitna tarča zaviralcev hiperpigmentacije (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014; Ramsden in Riley, 2014). Številne snovi so bile v literaturi opisane kot zaviralci tirozinaze, vendar večina od njih ni klinično učinkovita in le nekaj spojin se trenutno uporablja v lokalnih dermatoloških izdelkih (Chang, 2009; Kim in Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002). ). Med njimi so najpogostejši kojična kislina, hidrokinon in arbutin (Solano et al., 2006).

Nezadovoljiva klinična učinkovitost trenutno uporabljenih zaviralcev tirozinaze je velika, ker so bile te spojine testirane samo s tirozinazo, izolirano iz gobe Agaricus bisporus (mTyr) (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005), ki je edina aktivna tirozinaza, komercialno dostopna. Katalitske aktivnosti in specifičnosti substrata mTyr se znatno razlikujejo od encima sesalcev (Hearing et al., 1980). Nedavno so bile razrešene tridimenzionalne strukture več tirozinaz, med njimi strukture mTyr (Ismaya et al., 2011) in dveh bakterijskih encimov iz Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba et al., 2006) in Bacillus megaterium (Sendovski et al. , 2011). Nasprotno pa je za človeško tirozinazo (hTyr) na voljo zelo malo kinetičnih ali strukturnih informacij, predvsem zaradi znatnih težav pri pridobivanju zadostnih količin hTyr iz naravnih virov ali s heterologno ekspresijo. hTyr je bil začasno izražen v različnih živalskih celičnih linijah (Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt, 2006), vendar so bili donosi vedno prenizki za podrobno karakterizacijo nastalega hTyr pripravki. Pred kratkim je več skupin razvilo učinkovitejše ekspresijske sisteme za hTyr (Cordes et al., 2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016), vendar podatki o tridimenzionalni strukturi hTyr ali kinetični podatki Zaviralci hTyr še vedno manjkajo.

REZULTATI

Zaviranje hTyr

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1200 mmol/l (slika 2a).

Podrobna kinetična analiza inhibicije hTyr s tiamidolom je dala strogo kompetitivno vrsto inhibicije s konstanto inhibitorja (Ki) 0,25 mmol/L (slika 2b, tabela 1). Ta vrednost se ujema z vrednostjo IC50, ocenjeno iz krivulj odmerek-odziv (1,1 mmol/L) (prim. sliko 2a), ki bi morala biti za konkurenčno inhibicijo približno 3-krat višja od Ki. Tudi vrednosti Ki za 4-butil resorcinol (9 mmol/L), 4-heksilresorcinol (39 mmol/L) in 4- feniletilresorcinol (24 mmol/L) so bile izrazito višje od Ki vrednost tiamidola (tabela 1). Ti podatki kažejo, da tiazolil amidni del tiamidola prenaša veliko boljšo inhibicijo hTyr kot stranske verige ogljikovodikov, ki so prisotne v treh drugih derivatih resorcinola (4-butil-, 4-heksil- in {{ 21}}fenil etil resorcinol). Kot smo že omenili, je učinkovitost izrazito drugačna pri mTyr, kjer so 4-butil resorcinol, 4-heksilresorcinol in 4-feniletilresorcinol ter celo kojična kislina pri zaviranju encima boljši od tiamidola (tabela 1). Tako tiamidol ne bi bil opredeljen kot pozitiven pri presejanju z uporabo mTyr, učinkovitost 4-feniletilresorcinola pa bi bila močno precenjena.

Garcia-Jimenez et al. (2016) je pred kratkim poročal, da mTyr počasi oksidira nekatere resorcinole, pod pogojem, da se prevladujoča met-oblika encima predhodno pretvori v oksi- ali deoksi-obliko z dodatki, kot sta H2O2 in askorbat, in da reakcijo vzdržujejo o-difenoli . Zato smo uporabili kvantitativno analizo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (Ito in Wakamatsu, 2015), da bi ugotovili, ali je Thiamidol lahko tudi substrat hTyr. V naših običajnih preskusnih pogojih (tj. v odsotnosti dodatkov, ki so jih omenili Garcia-Jimenez et al., 2016) v nekaj urah po inkubaciji s hTyr ni prišlo do zaznavne oksidacije tiamidola, medtem ko je bil rododendron v tem časovnem okviru zlahka oksidiran. (glej dodatno sliko S1 na spletu). Tako domnevamo, da je reakcija, ki so jo opisali Garcia-Jimenez et al. ni pomemben za tiamidol in hTyr v fizioloških pogojih.

Zaviranje proizvodnje melanina

Nato smo testirali potencialne zaviralne učinke teh spojin z uporabo tridimenzionalnega modela za človeško kožo. Kot so opazili pri prečiščenem hTyr, je arbutin pokazal le zanemarljivo učinkovitost pri zaviranju proizvodnje melanina v kožnih modelih MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) (IC50 > 4,000 mmol/L) (slika 2c) . Kojična kislina je zavirala nastajanje melanina z IC50 w400 mmol/L, kar je pokazalo presenetljivo strmo krivuljo odziva na odmerek, pri čemer so koncentracije pod 200 mmol/L le rahlo zavirale nastajanje melanina (tj. za 5 odstotkov pri 150 mmol/L). Rhododendron je pokazal le obrobne učinke na melanogenezo, z navideznim IC50 za inhibicijo w1200 mmol/L. Hidrokinon je zaviral nastajanje melanina na kožnih modelih MelanoDerm z IC50 15 mmol/L, kar nakazuje, da ima mehanizem, ki ni zaviranje tirozinaze. 4-Butilrezorcinol je zaviral sintezo melanina z IC50 13,5 mmol/L. Ponovno je bil Thiamidol daleč najmočnejši zaviralec proizvodnje melanina v kožnih modelih MelanoDerm z IC50 0,9 mmol/L, v enoplastnih kulturah pa je Thiamidol vidno zmanjšal tvorbo melanina (slika 3a).

Hidrokinon in tiamidol sta bila nato testirana v dolgotrajnih enoplastnih kulturah melanocitov, da bi preverili potencialno reverzibilnost inhibicije. Čeprav je 1 mmol/l tiamidola po 2 tednih zmanjšal proizvodnjo melanina na manj kot 60 odstotkov, je 1 mmol/l hidrokinona zmanjšal proizvodnjo melanina le na približno 85 odstotkov (slika 3b). Vendar pa so po nadaljnjem gojenju brez aktivnih spojin melanociti, ki jih je zaviral tiamidol, hitro ponovno začeli proizvajati melanin in dosegli raven pred obdelavo v 1 tednu. V nasprotju s tem celice, obdelane s hidrokinonom, niso obnovile svoje polne zmogljivosti za proizvodnjo melanina v 2-tedenskem obdobju gojenja in proizvodnja melanina se je nadaljevala pri 85 odstotkih ravni pred obdelavo.

Molekularno modeliranje

Možni načini vezave tiamidola na hTyr so bili preučeni z virtualnimi študijami priklopa. Slika 4a prikazuje aktivno mesto homološkega modela hTyr v met-obliki, s priklopljenim tiamidolnim ligandom v konformaciji z najnižjo energijo. Na levi je vidno di-bakrovo središče z premostitvenim kisikom. Prikazani so samo aminokislinski ostanki, ki mejijo neposredno na vezani inhibitor. (Številčenje ostankov vključuje signalni peptid). Notranja površina veznega žepa je obarvana glede na hidrofobnost na lestvici od modre za hidrofilno do rjave za hidrofobno. Čeprav je okolje di-bakrovega središča izrazito hidrofilno, močno hidrofoben podžep tvorijo predvsem stranske verige I368, V377 in F347. V prikazani prostorski orientaciji ima 1-hidroksilna skupina aromatskega obroča liganda obsežne stike z di-bakrovim središčem, 3-hidroksilna skupina pa je vključena v vodikove vezi s stransko verigo S380 in ogrodje karbonila M374. Tiazolilni obroč držijo na mestu hidrofobne interakcije z nepolarnim žepom (slika 4b), ki ga tvorijo stranske verige aminokislin, od katerih se večina med mTyr in hTyr razlikuje (slika 4c).

Primerljivi rezultati so bili pridobljeni, ko je bil Thiamidol spojen z nedavno objavljeno rentgensko strukturo strukturno podobnega TRP1, melanogenega encima, ki vsebuje Zn2þ in ima še neznano funkcijo pri ljudeh (Ghanem in Fabrice, 2011; Lai et al., 2017), kar kaže na da tiamidol zavira tudi encim TYRP1 (glejte dodatno sliko S2 na spletu).

Klinične študije

Učinkovitost tiamidola in vivo je bila nato raziskana v kliničnih študijah, kjer so starejši subjekti zdravili starostne pege na svoji koži dvakrat na dan s formulo, ki je vsebovala {{0}}.2 odstotka tiamidola ali samo z vehiklom kot kontrolo. Že po 4 tednih zdravljenja so bile zdravljene starostne pege bistveno svetlejše od nezdravljenih kontrolnih starostnih peg (slika 5a). Izboljšanje se je nadaljevalo skozi celotno obdobje zdravljenja in po 12 tednih nekaterih starostnih peg ni bilo več mogoče razlikovati od okoliške normalno pigmentirane kože (slika 5b). Fotografije EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) so pokazale vidno izboljšanje videza starostnih peg, nezdravljene kontrolne starostne pege pa so ostale nespremenjene (ni prikazano). Nadaljnja študija je pokazala, da koncentracije tiamidola, vse do 0,1 odstotka, učinkovito zmanjšajo vidnost starostnih peg (glejte dodatno sliko S3 na spletu).

DISKUSIJA

Najvarnejši in najučinkovitejši način za zdravljenje kožne hiperpigmentacije je zmanjšanje proizvodnje melanina z zaviranjem aktivnosti tirozinaze. Vendar večina zaviralcev tirozinaze, opisanih v literaturi, nima klinične učinkovitosti, če so vključeni v topikalne izdelke. Skoraj vsi so bili testirani samo proti mTyr (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005) in so se tako, čeprav učinkoviti proti mTyr, izkazali za slabe zaviralce hTyr. Komercialno dostopen mTyr ni homogen pripravek, ampak je mešanica več izoencimov tirozinaze in majhnih količin dodatnih encimskih aktivnosti, ki lahko na nepredvidljive načine vplivajo na študije inhibicije (Pretzler et al., 2017). Izoencima AbPPO3 in AbPPO4, glavni komponenti komercialno dostopnega mTyr, imata aminokislinska zaporedja v regiji aktivnega mesta, ki se bistveno razlikujejo od hTyr (slika 4c). Oba izoencima mTyr vsebujeta dodatne zanke med Asn371 (eno od mest glikozilacije hTyr) in Gly372. Več ostankov, ki medsebojno delujejo s tiamidolom v hTyr (prim. sliko 4b), ni ohranjenih v mTyr, na primer Ile368, Ser375 in Ser380. Phe207 je strukturno ohranjen v mTyr, medtem ko Phe347 ni. Ker imajo lahko celo majhne spremembe v interakcijah encim-ligand dramatične učinke na vezavne afinitete, različni inhibicijski profili hTyr in mTyr (povzeti v tabeli 1) niso bili presenečenje.

Glavni cilj te študije je bil primerjati učinke arbutina, hidrokinona in kojične kisline z različnimi derivati ​​resorcinola na katalitično funkcijo hTyr in na proizvodnjo melanina in vivo. Razen tiamidola so bile vse testirane snovi opisane kot zaviralci tirozinaze (Kim et al., 2012); vendar so njihove poročane inhibitorne aktivnosti zelo različne. V medicinski literaturi velja hidrokinon za merilo standarda za zdravljenje hiperpigmentacije kože, čeprav obstajajo resni pomisleki glede njegove varnosti. Hidrokinon je v Evropski uniji prepovedan za uporabo v kozmetiki, vendar se v Združenih državah še vedno prodaja kot zdravilo brez recepta v formulacijah, ki vsebujejo do 2 odstotka hidrokinona. Pred kratkim je ameriška uprava za hrano in zdravila (2006) izrazila zaskrbljenost glede hidrokinona; vendar pravnomočna sodba še ni sprejeta. Objavljene vrednosti IC50 za zaviranje mTyr s hidrokinonom pokrivajo razpon od 1,1 mmol/L (Kang et al., 2003) do 680 mmol/L (Abu Ubeid et al., 2009). V naši analizi je bil hidrokinon izjemno neučinkovit proti hTyr, saj ga je le rahlo zaviral in dosegel le 50-odstotno inhibicijo pri približno 4,000 mmol/L. Čeprav je hidrokinon veljal za zaviralca tirozinaze od zgodnjih 1990-ih (Palumbo et al., 1991), naši rezultati kažejo, da so njegove citotoksične lastnosti pomembnejše, ne samo zaradi njegovih škodljivih učinkov na melanocite, temveč tudi zaradi njegove učinkovitosti kot zaviralca melanogeneze. (Jimbow et al., 1974; Penney et al., 1984; Smith et al., 1988). To mnenje potrjujejo ne le naši rezultati s hTyr in dejstvo, da je hidrokinon znatno zmanjšal proizvodnjo melanina v kožnih modelih, ampak tudi naši poskusi s kulturami melanocitov. Tu je hidrokinon zmanjšal proizvodnjo melanina, vendar obdelane celice niso ponovno pridobile polne zmogljivosti za proizvodnjo melanina po odstranitvi aktivne snovi.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) za arbutin s prečiščenim hTyr in modelom kože MelanoDerm. Objavljeni so podatki o učinkovitosti tako a-arbutina kot b-arbutina (Garcia-Jimenez et al., 2017). Vendar sta obe spojini predzdravili hidrokinona, pri čemer je njuna biološka aktivnost odvisna od sproščanja hidrokinona iz molekule (Briganti et al., 2003). Znanstveni odbor Evropske unije za potrošniške izdelke (2008) je objavil kritično mnenje o arbutinu. Glede na sproščanje hidrokinona iz molekule je uporaba arbutina v kozmetičnih izdelkih nevarna.

Objavljene vrednosti IC50 za inhibicijo tirozinaze s kojično kislino segajo od 6 mmol/L (Curto et al., 1999) do več kot 100 mmol/L (Jeon et al., 2005). Kot zaviralec hTyr je kojična kislina veliko manj učinkovita, z IC50 približno 500 mmol/L. Kojična kislina ima mešano vrsto inhibicije s Ki 145 mmol/L, kar kaže, da se veže na deoksi obliko tirozinaze (Sun et al., 2014). Pri uporabi za zdravljenje modela MelanoDerm, kojična kislina kaže izjemno strmo krivuljo odziva na odmerek, pri čemer se relativna inhibicija poveča s 5 odstotkov pri 150 mmol/L na več kot 75-odstotno inhibicijo pri 900 mmol/L (glejte sliko 2c). To dejstvo je lahko glavni razlog za zelo omejeno učinkovitost kojične kisline in vivo. V zvezi z varnostjo kojične kisline Evropski znanstveni odbor za varstvo potrošnikov (2012) zdaj meni, da je kojična kislina v koncentracijah do 1,0 odstotka varna za kozmetične izdelke, kadar se nanašajo na zdravo kožo, s čimer se strinja tudi strokovna komisija za pregled kozmetičnih sestavin ( Burnett et al., 2010).

Rhododendron je leta 2008 na Japonskem dobil status kvazidroge in se je uporabljal kot belilna sestavina v kozmetičnih izdelkih. Domnevali so, da je konkurenčni zaviralec tirozinaze. Vendar pa so bili leta 2013 izdelki, ki vsebujejo rododendron, odpoklicani v 10 azijskih državah, ko se je pri skoraj 20000 potrošnikih po uporabi izdelkov razvila levkoderma. Pokazalo se je, da rododendron ni le zaviralec, ampak je tudi substrat tako hTyr (Ito et al., 2014a) kot mTyr (Ito et al., 2014b). Od tirozinaze odvisno kopičenje stresa endoplazmatskega retikuluma in/ali aktivacija apoptotične poti lahko prispeva k melanocitni citotoksičnosti rododendrona (Sasaki et al., 2014).

Motiv 4-substituiranega resorcinola je že nekaj časa znan kot učinkovit kemični del, ki zavira tirozinazo (Khatib et al., 2005). Številne naravne spojine, ki so bile identificirane kot belilna sredstva, predvsem flavonoidi, vsebujejo ta motiv (Shimizu et al., 2000, 2011). Ker je biološka uporabnost flavonoidov na splošno nizka, je bil naš cilj identificirati derivate resorcinola z boljšo učinkovitostjo in biološko uporabnostjo. 4-Butilresorcinol je bil že identificiran kot zaviralec mišje in človeške tirozinaze (Kim et al., 2005; Kolbe et al., 2013) in aktivnosti dihidroksi indol karboksilne kisline oksidaze mišjega TYRP1 (Katagiri et al. , 2001), komercialno pa je na voljo za medicinsko in kozmetično zdravljenje hiperpigmentacije (Bohnsack et al., 2012; Jimenez in Garcia-Carmona, 1997; Kim et al., 2005). Kljub temu še vedno manjkajo podrobni kinetični podatki o 4-butil resorcinolu. V testu hTyr smo ugotovili strogo kompetitivno vrsto inhibicije s 4-butil resorcinolom s Ki 9,1 mmol/L, kar se odlično ujema z ugotovljeno vrednostjo IC50 (tabela 1).

V naših poskusih in vitro je bil Thiamidol z IC50 1,1 mmol/L v encimskem testu hTyr in 0,9 mmol/L v modelu kože MelanoDerm daleč najučinkovitejši od vseh testiranih snovi. Nadaljnji poskusi so potrdili, da je tiamidol strogo konkurenčen zaviralec (slika 2b) in ne substrat za tirozinazo (glej dodatno sliko S1), zato se tiamidol ne pretvori v toksičen kinon, ki bi lahko povzročil levkodermo. Zato je bil Thiamidol izbran za klinične študije za oceno njegove učinkovitosti in vivo. Študija tiamidola z uporabo točkovnega aplikatorja je pokazala stalno izboljšanje videza starostnih peg v celotnem 12-tedenskem obdobju zdravljenja, ki je doseglo statistično pomembnost že po 4 tednih. Ti rezultati kažejo močno učinkovitost testnega izdelka Thiamidol pri zmanjševanju pigmenta in jasno klinično korist pri obvladovanju kožne hiperpigmentacije.

MATERIALI IN METODE

Človeška tirozinaza

Skrajšana oblika hTyr (hTyr-DHis), označena s Hisom, ki obsega katalitično domeno hTyr, je bila izražena v celicah HEK 293 in prečiščena s kovinsko afinitetno kromatografijo na Ni2þ-Sepharose (GE Healthcare, München, Nemčija), kot je opisano drugje ( Cordes et al., 2013). Nastali pripravek je imel enake katalitične lastnosti kot divji tip hTyr.

Viri inhibitorjev

Iz knjižnice spojin Evotec (Evotec, Hamburg, Nemčija) je bilo izbranih 50 000 spojin, ki pokrivajo širok kemijski prostor, za izvedbo HTS za zaviralce hTyr, ocenjeno s testom Tyr, opisanim v naslednjem razdelku. Derivati ​​obetavnih svinčevih spojin so bili nato sintetizirani za nadaljnjo optimizacijo. Drugi zaviralci so bili kupljeni od različnih dobaviteljev (za podrobnosti si oglejte dodatne materiale na spletu).

Test tirozina in postopek HTS

Vse podrobnosti o aktivnosti L-dopa oksidaze in uporabljenih postopkih presejanja HTS so na voljo v dodatnem materialu.

Molekularno modeliranje

Priključitev in silico je temeljila na novem modelu homologije hTyr, opisanem drugje (Mann et al., 2017). Simulacije so bile izvedene z uporabo Molegro Virtual Docker (Molegro, Aarhus, Danska). Za vizualno analizo in predstavitev podatkov je bil uporabljen Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA). Sekvence so bile vzete iz baze UniProt (UniProt Consortium, 2017).

Testi kožnega modela

Vse podrobnosti o tkivih MelanoDerm, ki se uporabljajo kot model kože, in količino n njihove vsebnosti melanina lahko najdete v Dodatnih materialih.

Kulture melanocitov

Vse podrobnosti o kulturah melanocitov in kvantitativno določanje njihove vsebnosti melanina najdete v Dodatnih materialih.

Klinične študije

Izvedeni sta bili dve randomizirani študiji in vivo (slepo za preskusne izdelke, odprto za netretirano kontrolo). V eno študijo je bilo vključenih 18 preiskovank (starih 56-71 let), pri čemer jih je 17 zaključilo študijo. Druga študija je bila izvedena z 19 subjekti (18 žensk, 1 moški; 58e7{{10}} let), pri čemer je vseh 19 subjektov zaključilo študijo. Vsak preiskovanec je s točkovnim aplikatorjem dvakrat na dan nanesel dve različni formulaciji na starostne pege na volarnih podlakteh. Formulacije so se razlikovale le v aktivni sestavini: 0,2 odstotka tiamidola v primerjavi z vehiklom v prvi študiji in 0,1 odstotka tiamidola v primerjavi z vehiklom v drugi študiji. Ena starostna pega na osebo je bila zdravljena s formulo, ki je vsebovala aktivno sestavino, kontrolna pega pa je bila tretirana samo z vehiklom. Pigmentacija starostnih peg je bila analizirana, kot je opisano v dopolnilnih materialih. Študije in vivo so bile izvedene v skladu s priporočili trenutne različice Helsinške deklaracije in smernic Mednarodne konference o usklajevanju dobre klinične prakse. Vsi udeleženci v teh študijah so dali pisno informirano soglasje. Poleg tega je študije odobril in odobril institucionalni revizijski odbor Beiersdorf AG (Hamburg, Nemčija).

NASPROTJE INTERESOV

DODATNO GRADIVO

Dodatno gradivo je povezano s spletno različico prispevka.

REFERENCE

1. Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Oligopeptidi kratkega zaporedja z inhibitornim delovanjem proti gobji in človeški tirozinazi. J Invest Dermatol 2009; 129: 2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Učinkovitost in prenašanje šestih novih formulacij za nego obraza, ki vsebujejo 4-n-butil resorcinol, za zmanjšanje pigmentacije, poster št. P864. Poster, predstavljen na 21. kongresu EADV, september 27-30, 2012; Praga, Češka.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Kemični in instrumentalni pristopi k zdravljenju hiperpigmentacije. Pigment Cell Res 2003; 16: 101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC, et al. Končno poročilo o oceni varnosti kojične kisline, ki se uporablja v kozmetiki. Int J Toxicol 2010; 29 (6 dodatkov). 244Se73.

5. Spremeni TS. Posodobljen pregled zaviralcev tirozinaze. Int J Mol Sci 2009; 10: 2440e75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. Inhibitorni učinki heksilresorcinola in dodecil resorcinola na tirozinazo gob (Agaricus bisporus). Protein J 2004; 23: 135e41.

7. Cordes P, Sun W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨hm KH. Izražanje v nemelanogenih sistemih in čiščenje topnih variant humane tirozinaze. Biol Chem 2013;394:685e93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer H, Glatt H, Santis C, Virador V, et al. Inhibitorji melanocitne tirozinaze sesalcev: in vitro primerjave alkilnih estrov gentizinske kisline z drugimi domnevnimi inhibitorji. Biochem Pharmacol 1999;57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert MA, Garcia-Ruiz PA, Tudela J, et al. Kinetična karakterizacija substratne specifičnosti in mehanizma gobove tirozinaze. Eur J Biochem 2000; 267: 1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Človeška tirozinaza, proizvedena v celicah žuželk: mejnik za presejanje novih zdravil, ki obravnavajo njeno dejavnost. Mol Biotechnol 2015;57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Delovanje tirozinaze na alfa in beta-arbutin: kinetična študija. PLoS One 2017; 12: e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. Karakterizacija delovanja tirozinaze na resorcinole. Bioorg Med Chem 2016; 24: 4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F, et al. Gobova tirozinaza: aktivnost katalaze, inhibicija in samomorilna inaktivacija. J Agric Food Chem 2005; 53: 3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. S tirozinazo povezan protein 1 (tyrp1/gp75) pri človeškem kožnem melanomu. Mol Oncol 2011; 5: 150e5.

15. Zaslišanje VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. Tirozinaza sesalcev. Stehiometrija in merjenje reakcijskih produktov. Biochim Biophys Acta 1980; 611: 251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Kristalna struktura tirozinaze gobe Agaricus bisporus: identiteta tetramernih podenot in interakcija s tropolonom. Biokemija 2011;50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika M, Wakamatsu K. Človeška tirozinaza lahko oksidira oba enantiomera rododendrona. Melanoma pigmentnih celic Res 2014a;27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. Oksidacija rododendrona, katalizirana s tirozinazo, povzroči 2-metilkroman-6,7-dion, domnevni končni toksični metabolit: posledice za toksičnost za melanocite . Melanoma pigmentnih celic Res 2014b; 27: 744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Priročna presejalna metoda za razlikovanje fenolnih zaviralcev tirozinaze za beljenje kože od fenolov, ki povzročajo levkodermo. J Dermatol Sci 2015; 80: 18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. Inhibitorni učinki l-Dopa oksidacije tirozinaze s sredstvi za beljenje kože. Bull Korean Chem Soc 2005; 26: 1135e7.

21. Jimbow K, Obata H, Pathak MA, Fitzpatrick TB. Mehanizem depigmentacije s hidrokinonom. J Invest Dermatol 1974; 62: 436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-substituirani resorcinoli (sulfitne alternative) kot inhibitorji počasne vezave aktivnosti kateholaze tirozinaze. J Agric Food Chem 1997; 45: 2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Depigmentacijska aktivnost in nizka citotoksičnost alkoksi benzoatov ali alkoksi cinamata v gojenih melanocitih. Chem Pharm Bull (Tokio) 2003;51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Korelacije med strukturo in funkcijo v tirozinazah. Prot Sci 2015; 24: 1360e9.

25. Katagiri T, Okubo T, Oyobikawa M, Futaki K, Shaku M, Kawai M, et al. Inhibitorno delovanje 4-n-butil resorcinola na melanogenezo in njegov učinek beljenja kože. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001;35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Halkoni kot močni inhibitorji tirozinaze: pomen 2,4-substituiranega rezorcinolnega dela. Bioorg Med Chem 2005; 13: 433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK, et al. Zaviralni učinki 4-n-butil resorcinola na aktivnost tirozinaze in sintezo melanina. Biol Pharm Bull 2005;28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Park KC. Lokalna hipopigmentirana sredstva za pigmentne motnje in njihovi mehanizmi delovanja. Ann Dermatol 2012; 24: 1e6.

29. Kim YJ, Uyama H. ​​Zaviralci tirozinaze iz naravnih in sintetičnih virov, struktura, inhibicijski mehanizem in perspektiva za prihodnost. Cell Mol Life Sci 2005; 62: 1707e23.

30. Kolbe L, Mann T, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C, et al. 4-n-butil resorcinol, zelo učinkovit zaviralec tirozinaze za lokalno zdravljenje hiperpigmentacije. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013; 27: 19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez M, Wichers HJ, Dijkstra BW. Obsežna rekombinantna ekspresija in čiščenje humane tirozinaze, primerne za strukturne študije. PLoS One 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW. Struktura proteina 1, povezanega s človeško tirozinazo, razkriva binuklearno aktivno mesto cinka, pomembno za melanogenezo. Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56: 9812e5.

33. Lee SY, Baek N, Nam TG. Naravni, polsintetični in sintetični zaviralci tirozinaze. J Enzyme Inhib Med Chem 2014; 31: 1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Izobutilamido tiazolil resorcinol nov močan zaviralec človeške tirozinaze. Melanoma pigmentnih celic Res 2017:e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Kristalografski dokazi, da je dvojedrni bakrov center tirozinaze med katalizo FL prožen. J Biol Chem 2006; 281: 8981e90.

35. Nesterov A, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe P, et al. 1-(2,4- dihidroksi fenil)-3-(2,4-dimetoksi-3-metil fenil)propan, nov inhibitor tirozinaze z močnimi depigmentacijskimi učinki. Chem Pharm Bull (Tokio) 2008;56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikacija ostankov aktivnega mesta, vključenih v vezavo kovinskega kofaktorja in stereospecifično prepoznavanje substrata v tirozinazi pri sesalcih. Posledice katalitskega cikla. Biokemija 2002;41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. Mehanizem inhibicije melanogeneze s hidrokinonom. Biochim Biophys Acta 1991; 1073: 85e90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. Depigmentacijsko delovanje hidrokinona je odvisno od motenj temeljnih celičnih procesov. J Invest Dermatol 1984; 82: 308e10.

39. Pretzler M, Bijelic A, Rompel A. Heterologna ekspresija in karakterizacija funkcionalne gobove tirozinaze (AbPPO4). Sci Rep 2017; 7: 1810.

40. Ramsden CA, Riley PA. Tirozinaza: štiri oksidacijska stanja aktivnega mesta in njihov pomen za encimsko aktivacijo, oksidacijo in inaktivacijo. Bioorg Med Chem 2014; 22: 2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. Inhibicija tirozinaze, splošni in uporabni vidiki. J Enzyme Inhib Med Chem 2002; 17: 207e18.

42. Sasaki M, Kondo M, Sato K, Umeda M, Kawabata K, Takahashi Y, et al. Rododendron, fenolna spojina, ki povzroča depigmentacijo, povzroča citotoksičnost melanocitov preko mehanizma, odvisnega od tirozinaze. Melanoma pigmentnih celic Res 2014; 27: 754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Tridimenzionalni model aktivnega mesta tirozinaze pri sesalcih, ki upošteva izgubo funkcijskih mutacij. Pigment Cell Res 2007; 20: 394e401.

44. Znanstveni odbor za potrošniške izdelke. Mnenje o b-arbutinu; 2008 (dostopano 21. novembra 2017).

45. Znanstveni odbor za varstvo potrošnikov. Mnenje o kojic kislini; 2012 (dostopano 21. novembra 2017).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Prve strukture aktivne bakterijske tirozinaze razkrivajo plastičnost bakra. J Mol Biol 2011; 405: 227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. Inhibicija tirozinaze s flavonoidi, stilbeni in sorodnimi 4-substituiranimi resorcinoli: raziskave strukture in aktivnosti. Planta Med 2000;66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Arau´jo P, et al. Encimska karakterizacija, izolacija in cDNA kloniranje polifenol oksidaze v srcu palme treh komercialno pomembnih vrst. Plant Physiol Biochem 2011; 49: 970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. Selektivna citotoksičnost hidrokinona za celice, ki izvirajo iz melanocitov, je posredovana z aktivnostjo tirozinaze, vendar neodvisno od vsebnosti melanina. Pigment Cell Res 1988; 1: 386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Sredstva za hipopigmentacijo: posodobljen pregled bioloških, kemičnih in kliničnih vidikov. Pigment Cell Res 2006; 19: 550e71.

51. Stratigos AJ, Katsambas AD. Optimalno obvladovanje neposlušnih motenj hiperpigmentacije pri temnopoltih bolnikih. Am J Clin Derm 2004; 5: 161e8.

52. Sugimoto K, Nomura K, Nishimura T, Kiso T, Sugimoto K, Kuriki T. Sinteze a-arbutin-a-glikozidov in njihovi inhibitorni učinki na človeško tirozinazo. J Biosci Bioeng 2005; 99: 272e6.

53. Sun W, Wendt M, Klebe G, Ro¨hm KH. O razlagi kinetike inhibicije tirozinaze. J Enzyme Inhib Med Chem 2014; 29: 92e9.

54. Tripathi RK, sluh VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Mutacijsko kartiranje katalitičnih aktivnosti humane tirozinaze. J Biol Chem 1992; 267: 23707e12.

55.Konzorcij UniProt. UniProt: univerzalna baza znanja o beljakovinah. Nucleic Acids Res 2017; 45: D158e69.

56. Ameriška uprava za hrano in zdravila, Ministrstvo za zdravje in socialne storitve. Zdravila za beljenje kože za ljudi brez recepta; predlagano pravilo. 71 Zvezni register 51146-5115521 (kodificirano v 21 CFR del 310); 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs K, Franke H, Lange S, Herrmann M, et al. 4-(1-fenilmetil)1,3-benzendiol: novo, zelo učinkovito sredstvo za osvetljevanje. Int J Cosmet Sci 2007; 29: 65e6. 58. Wendt M. Rationales design neuer tyrosinase-inhibitoren. dr. diplomsko delo. Marburg, Nemčija: Medicinska fakulteta Univerze v Marburgu; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC, et al. Aloezin in arbutin sinergistično zavirata aktivnost tirozinaze preko drugačnega mehanizma delovanja. Arch Pharm Res 1999; 22: 232e6.

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501