APOVZETEK

Ozadje:Bisresorcinol je bil izoliran kot glavna sestavina debla Heliciopsis terminalov (Proteaceae). V zadnjem času se resorcinol uporablja kot aktivno belilno sredstvo v različnih kozmetičnih izdelkih. Zaradi strukturnega posnemanja resorcinola so bile v tej študiji dokazane koristi bis resorcinola kot antagonista encima staranja.

Glede na ustrezne študije je cistanča pogosta rastlina, ki je znana kot "čudežna rastlina, ki podaljšuje življenje". Njegova glavna sestavina je cistanozid, ki ima različne učinke, kot so antioksidativni, protivnetni in spodbujanje imunske funkcije. Mehanizem med cistanho in beljenjem kože je v antioksidativnem učinku cistanche glikozidov. Melanin v človeški koži nastane z oksidacijo tirozina, ki jo katalizira tirozinaza, oksidacijska reakcija pa zahteva sodelovanje kisika, zato radikali brez kisika v telesu postanejo pomemben dejavnik, ki vpliva na proizvodnjo melanina. Cistanche vsebuje cistanozid, ki je antioksidant in lahko zmanjša nastajanje prostih radikalov v telesu ter tako zavira nastajanje melanina.

Kliknite na Cistanche Tubulosa za beljenje

Za več informacij:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Metode:Bis resorcinol smo očistili iz surovega etanolnega ekstrakta debla H. terminalov z ekstrakcijo s topilom oziroma preparativno kromatografijo. Inhibitorno aktivnost spojine na kolagenazo, elastazo in tirozinazo so raziskali z uporabo druge spektroskopske tehnike. Izvedeno je bilo molekularno spajanje, da bi se napovedale možne interakcije snovi okoli aktivnih mest encimov.

Rezultati:Vrednosti IC50 za kolagenazo bis resorcinola in kofeinske kisline so bile 156,7 ± 0,7 oziroma 308,9 ± 1,6 µmol L-1. Za aktivnost elastaze so določili IC50 33,2 ± 0,5 oziroma 34,3 ± 0,3 µmol L-1 za bis resorcinol in ursolno kislino. Bis resorcinol je zaviral tirozinazo, tako da je pokazal IC50 22,8 µmol L-1, za -arbutin pa 78,4 µmol L-1. Bis resorcinol se je vezal na kolagenazo, elastazo in tirozinazo z ustreznimi vezavnimi energijami -5,89, -5,69 in -6,57 kcal mol-1. Te vezavne energije so bile v istih območjih kot testirani inhibitorji. Aromatične fenolne skupine v strukturi so bile odgovorne za načelo in podpiranje vezavnih interakcij z encimi. Vezava vodika zaradi hidroksilnih skupin in s π povezanih privlačnih sil iz aromatskih obročev je zagotovila vsestranskost vezave bis resorcinolu.

Zaključek:Bisresorcinol, prečiščen iz H. terminalov, bi lahko bil koristen za vključitev v kozmetične izdelke kot antagonist encimov staranja.

Predmeti Biokemija, bioinformatika, celična biologija, dermatologija, podatkovno rudarjenje in strojno učenje

Ključne besedeHeliciopsis terminali, bisresorcinol, kolagenaza, elastaza, tirozinaza, lastnost proti staranju, molekularno spajanje, zaviranje encimov

UVOD

A bis resorcinol, (8′Z)-3,5-dihidroksi-1-[16′-(3″, 5″-dihidroksi fenil)-8′-heksadecen{{ 11}}′-il] benzen, je bil izoliran kot obilna sestavina iz debla Heliciopsis terminals (Kurz) Sleumer, ki je rastlina iz družine Proteaceae in so jo etnični ljudje v Vietnamu uporabljali za hepatoprotektivni učinek. Do danes so bile medicinske koristi te spojine kot protivnetnega sredstva, zaviranja proizvodnje malondialdehida (MDA) in hepatoprotekcije pojasnjene in vitro in in vivo (Giang et al., 2019). Očitno je, da molekula bis resorcinola vsebuje dve molekuli resorcinola (EC št. 203-585-2), povezani skupaj z meta-C7H14C=CC7H14 vezjo (slika 1A). Resorcinol se nedavno uporablja v obliki obraznega koncentriranega seruma za belo terapijo. Na podlagi Znanstvenega odbora za varstvo potrošnikov, Bruselj, Belgija (SCCS 1270/09, Evropska komisija, Znanstveni odbor za varstvo potrošnikov, 2010) je resorcinol reguliran kot oksidant v izdelkih za barvanje trepalnic v koncentracijah do 1,25 odstotka. ali v losjonih za lase in šamponih v koncentracijah do 0,5 odstotka. Kozmetične uporabe resorcinola so torej raznolike. Za belilna sredstva se domneva, da melanociti, ki se nahajajo v bazalni celični plasti povrhnjice, zavirajo sintezo melanina. Tirozinaza (EC 1.14.18.1) je ključni encim za kataliziranje melanogeneze, pri kateri se kot substrat uporablja L-tirozin. Čeprav melanin pomaga zaščititi kožo pred poškodbami zaradi UV žarkov, lahko prekomerna proizvodnja melanina povzroči hiperpigmentacijo, pege in starostne pege. Poleg resorcinola je bilo dokazano, da različne sintetične in naravne spojine z različnimi kemijskimi strukturami izkazujejo antitirozinazno aktivnost (Dobos et al., 2015).

UV-sevanje je glavni zunanji dejavnik, ki povzroča staranje kože. Namesto tega se lahko koža sčasoma stara zaradi reaktivnih kisikovih vrst (ROS) in lipidnih peroksidov, ki nastanejo v notranjosti po izpostavljenosti UV žarkom. Sekundarni produkti presnove lipidnega peroksida lahko poškodujejo elastinska in kolagenska vlakna zunajceličnih matriksov (ECM). Posledica izpostavljenosti UV-žarkom je torej lahko dehidracija, izguba elastičnosti in gube kože. Kolikor nam je znano, se ECM občasno preoblikujejo, da se ohranijo normalne tkivne strukture, hkrati pa tkivne beljakovine s pretečenim rokom uporabe pravilno razgradijo matrične metaloproteinaze, kot so kolagenaze, in serinske proteaze, kot so elastaze (Thring, Hili & Naughton, 2009). Poleg tega sta se zaradi oksidativnega stresa povečali tako količine kot aktivnosti starajočih se encimov, kar je povzročilo obsežno razgradnjo ECM in progresivno staranje (Sherratt et al., 2019). Zato se pričakuje, da spojine, ki lahko tvorijo komplekse s kovinskimi ioni, ustrezno zavirajo kolagenaze, elastaze in tirozinazo (Selvaraj et al., 2014). Namen tega projekta je določiti biološke učinke bis resorcinola na tirozinazo, kolagenazo in elastazo in vitro, izvedena pa je bila tehnika priklopa, da se razjasnijo njihove interakcije na molekularni ravni. Upati je, da bi z bisresorcinolom upočasnili proces staranja in izboljšali videz kože.

MATERIALI IN METODE

Kemikalije in instrumenti

Čiščenje spojine, identifikacija in ratifikacija

Surovi ekstrakt v etanolu iz debla H. terminals je bil velikodušno pridobljen od profesorja PM Gianga, Fakulteta za kemijo, Vietnamska nacionalna univerza, Hanoj, Vietnam, s številko vzorca kupona HNIP-18473. Nato smo jo trikrat porazdelili v metanol/n-heksan. Metanolno plast smo uparili do skoraj suhega in nato porazdelili v etil acetat/1-butan. Plast etil acetata smo uparjali, dokler se njen volumen ni zmanjšal za 80 odstotkov. Nastalo viskozno tekočino smo nato očistili na koloni s silikagelom z eluiranjem z gradientom kloroform/metanol, kot sledi: 100 % kloroform, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2 in 2:1 kloroforma/metanola oziroma 100 % metanola. Eluent iz mešanega topila 5:1 smo zbrali in uparili do ene četrtine volumna, čemur je sledilo ločevanje na ODS koloni z uporabo gradientne elucije metanola in acetona. Želeno spojino, tj. bis resorcinol (slika 1), smo pridobili iz eluentov, ki so vsebovali 70 odstotkov acetona, in jo potrdili z MS, NMR in IR spektroskopijo v zvezi s podatki instrumentalne knjižnice. Za oceno njegove čistosti smo uporabili tankoplastno kromatografijo.

Testi biološke aktivnosti

In vitro so bili izvedeni poskusi, ki so sestavljali encimsko-inhibitorne teste na kolagenazo, elastazo in tirozinazo za bis resorcinol in znane inhibitorje, kot sledi.

Zaviranje kolagenaze

Nedavni test proti kolagenazi je bil spremenjen iz tistega, ki so ga prej opisali Widyowati et al. (2016). Na kratko, 50 mmol L-1 tricinskega pufra pH 7,5, dopolnjenega s 400 mmol L-1 NaCl in 10 mmol L-1 CaCl2, smo uporabili kot pufersko razredčilo. Kolagenazo iz Clostridium histolyticum (EC.3.4.24.3) smo raztopili v pufru do koncentracije 1 mg L-1. Encimski substrat MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2 smo predhodno raztopili v DMSO in nato razredčili v pufru do koncentracije 1 mmol L-1. Vzorec, raztopljen v DMSO, smo s pufrom razredčili na različne koncentracije. Raztopino vzorca 2-µl smo 10 minut inkubirali s 100 µl raztopine encima pri 37 ○C. Nato smo dodali 50-µl substrata in temeljito premešali. Emisija fluorescence (F) pri 405 nm je bila takoj zabeležena in neprekinjeno spremljana 30 minut z uporabo valovne dolžine 320 nm za vzbujanje. Kofeinska kislina je bila uporabljena kot kontrola položaja (slika 1). Negativno kontrolo smo izvedli z vodo. Odstotek inhibicije (%) je bil izračunan iz spodnje enačbe:

odstotek inhibicije {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

Zaviranje elastaze

Test v skladu z Abhijit & Manjushree (2010) je bil uporabljen z nekaj spremembami. Na kratko, puferski sistem je bil 0.2 mM Tris-HCl pufer (pH 8,0). Raztopino 1 µg mL-1 prašičje pankreasne elastaze (EC.3.4.21.36) smo pripravili v sterilni vodi. Encimski substrat, N-Sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (SANA), smo raztopili v pufru do koncentracije 80 mmol L-1. Vzorec, raztopljen v DMSO, smo s pufrom razredčili na različne koncentracije. 100-µl raztopine vzorca smo zmešali s 50 µl raztopine encima in inkubirali 15 minut. Nato smo dodali 50 µl raztopine encimskega substrata in temeljito premešali. OD410 smo izmerili takoj (0 min) in po inkubaciji čez noč (o/n) pri 37 stopinjah z uporabo bralnika mikroplošč. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili ursolno kislino (slika 1), kot negativno kontrolo pa vodo. Odstotek inhibicije (%) je bil izračunan z naslednjo enačbo:

odstotek inhibicije {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

Inhibicija tirozinaze

Uporabljeni inhibitorni test tirozinaze je bil prilagojen iz predhodno opisane metode (Jiratchayamaethasakul et al., 2020). Na kratko, test je bil izveden v 0.05 mol L-1 fosfatnega pufra pH 6,8. Gobja tirozinaza (EC.1.14.18.1) je bila raztopljena v pufru do koncentracije 100 enot mL-1. L-tirozin, encimski substrat, smo pripravili do koncentracije 0,25 mg mL-1 v pufru. Testno spojino, raztopljeno v DMSO, smo razredčili do koncentracij v območju med 0,625 in 10 mg ml-1. V vdolbino 96-plošč z vdolbinicami smo zmešali 10 µl vzorca in 40 µl raztopine L-tirozina in inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi. Nato smo inokulirali 50 µl encimske raztopine in temeljito premešali. Reakcijo smo nato ustavili z inkubacijo na ledu 1 minuto. OD475 je bil izmerjen z bralnikom mikroplošč. -Arbutin in voda sta bila uporabljena kot pozitivna kontrola (slika 1) in negativna protipostavka. Odstotek inhibicije (%) je bil izračunan z enačbo, kot sledi:

ŠTUDIJA MOLEKULARNEGA DOCKINGA

Priprava ligandov in receptorjev

Tridimenzionalne (3D) strukture bis resorcinola (CID 8917124) in referenčnih spojin, vključno s substrati in inhibitorji, so bile prenesene iz zbirke podatkov PubChem za študijo molekularnega priklopa. Struktura liganda je bila pripravljena v datoteki formata Protein Data Bank (PDB) z uporabo spletnega prevajalnika SMILES in generatorja strukturnih datotek. Kristalne strukture encimov, kot so kolagenaza (PDB ID 2Y6I), elastaza (PDB ID 1BRU) in tirozinaza (PDB ID 2Y9X), so bile pridobljene iz podatkovne baze beljakovin RCSB. Voda in pritrjene molekule so bile secirane iz vseh izbranih beljakovinskih struktur. Medtem je AutoDockTools 1.5.6 dodal polarne vodikove atome kristaliziranim proteinskim strukturam. Datoteke ciljnih proteinov in drugih uporabljenih spojin so bile shranjene v formatu PDBQT pred izvedbo molekularnega spajanja.

Izbira ostankov aktivnih mest in molekularno priklop

Mrežni in priklopni protokoli napovedi aktivnega mesta so bili pripravljeni z uporabo AutoDockTools 1.5.6. Mesta mreže so bila nastavljena z razmikom 0,375 Å. Dimenzije xyz so bile nastavljene na 126-135-160 Å3 za kolagenazo, 130-120-126 Å3 za elastazo in 80-80-80 Å3 za tirozinazo. Središča mrežnega polja (z vrednostmi zamika v AutoDockTools) so bila 31.869 (5.000), −19,41 (−25.{{20}}) in 17,815 za kolagenazo , 30.048 (-0,972), 51,253 (-2,722), 17,6 za elastazo in -8,407 (-1.000), -23,795 (-0,250), -36,019 (-3,500) ) za tirozinazo oz. Proteinska struktura je bila uporabljena kot toga entiteta, medtem ko je bila spojina liganda nastavljena kot prožna molekula. Študija priklopa je bila izvedena z uporabo Lamarckovega genetskega algoritma (GA), ki ga izvaja AutoDock4 različica 4.2. Število izvajanj GA je bilo 50 s priljubljeno velikostjo 200. Vezavno energijo (ΔGbind) je analiziral ADT. Interakcije so bile vizualizirane z uporabo BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). Molekularno interakcijo med spojino in proteinskim receptorjem smo analizirali in vizualizirali s programsko opremo BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). Struktura spojine na mestu vezave proteina je bila vizualizirana z uporabo paketa Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey, Dalke & Schulten, 1996).

Statistična analiza

REZULTATI

Glavna sestavina je bila uspešno očiščena iz debla H. terminalov z uporabo ekstrakcije s topilom oziroma tehnik HPLC z reverzno fazo. Pridobljene spektre 1H-NMR in 13C-NMR smo primerjali s spektri referenčnih snovi prek SciFinderja (https://scififinder.cas.org/) in ugotovili, da ustrezajo (8′Z)-1,{ {6}}dihidroksi-5- [16′-(3″,5″-dihidroksifenil)-8′-heksadecen-1′-il] benzen (Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02). Uvrščali so ga med bisresorcinole. Ta novejši bis resorcinol je imel molekulsko formulo C28H40O4 z molekulsko maso 463,2819 Daltona. Izkoristek ekstrakcije je bil izračunan na 0,086 odstotka glede na težo posušenega debla. Njegova čistost je bila več kot 98-odstotna glede na pridobljene spektre 1H in 13C-NMR (glej sliki S1 in S2).

Analiza bioaktivnosti in vitro

Antagonistične učinke bisresorcinola na encime staranja, kot so kolagenaza, elastaza in tirozinaza, so določili in vitro z uporabo posebne spektroskopske metode. Rezultati so bili povzeti v tabeli 1 in sliki 2. Za inhibicijo kolagenaze so bili testni vzorci v območju 50–550 µmol L-1 pripravljeni z uporabo MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 kot encimski substrat in kofeinska kislina kot zaviralec encimov. Pokazalo se je, da je bisresorcinol v koncentraciji 156,7 µmol L-1 zmanjšal aktivnost encima za 50 odstotkov (IC50). Namesto tega je bil IC50 kofeinske kisline 308,9 ± 13,7 µmol L-1. Tako je bila antikolagenazna aktivnost bisresorcinola znatno močnejša od kofeinske kisline.

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501