Interferenca feniletanoidnih glikozidov iz Cistanche Tubulosa s testom MTT

1. Uvod

Parazitska rastlinaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceaedružina) je široko razširjena v severnoafriških, arabskih in azijskih državah [1]. Izhaja izC. tubulosainC. deserticolaso pomembni v tradicionalni kitajski medicini, saj so jih uporabljali za zdravljenje impotence, neplodnosti, lumbaga in zaprtja zaradi vztrajnosti debelega črevesa [2]. Poleg tega je etanolni izvlečekC. tubulosadokazano ima pomemben zaščitni učinek proti cerebralni hipoksiji pri miših [3].

Endotelne celice igrajo ključno vlogo v patogenezi hipoksične pljučne hipertenzije. Endotelna celična linija EA.hy926 je precej podobna primarnim endotelnim celicam. Med našo raziskavo antihipoksičnega učinka etanolnega ekstrakta C. tubulosa na endotelijske celice EA.hy926 smo opazili, da 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{7 }},5-test difeniltetrazolijevega bromida (MTT), ki se običajno uporablja za oceno viabilnosti celic v študijah citotoksičnosti in citostatske aktivnosti, je ustvaril nasprotujoče si rezultate, saj je pokazal povečano viabilnost celic EA.hy926 po zdravljenju.

Natančna ocena viabilnosti celic je bistvena za identifikacijo morebitnih citotoksičnih ali citoprotektivnih učinkov zdravila. Zato smo raziskali, katere komponente, prisotne v etanolnem izvlečku C. tubulosa, so lahko odgovorne za nasprotujoče si rezultate, opažene pri testu MTT. Izolirali smo dve glavnifeniletanoidni glikozidi (PhG)iz etanolnega izvlečka C. tubulosa,ehinakozid (v nadaljevanju spojina 1) in akteozid (v nadaljevanju spojina 2). Njihov vpliv na viabilnost celic EA.hy926 smo ugotavljali z različnimi metodami. Poleg tega smo za dodatno razjasnitev, kateri substituent spojin 1 in 2 je lahko odgovoren za protislovne rezultate, testirali njihove aglikone, kofeinsko kislino (v nadaljevanju spojina 3) in 3,4-dihidroksilfeniletanol (v nadaljevanju spojina 4), na EA .hy926 celično sposobnost preživetja z istimi metodami.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZAVIRANJE APOPTOZE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Rezultati in razprava

2.1. Identifikacija spojin

Strukture dveh spojin, izoliranih izEtanolni ekstrakt C. tubulosaso bili identificirani z analizami jedrske magnetne resonance (NMR) in masne spektrometrije (MS), kot je prikazano na sliki 1. Spojina 1 je bila identificirana kot ehinakozid v primerjavi s prej prijavljenimi NMR (tabela 1) in MS (m/z 785 [M−H ]− ) podatki [4]. NMR spektri spojine 2 so bili zelo podobni spektrom spojine 1, razen odsotnosti -D-glukopiranozilne skupine (tabela 1). Spojino 2 (m/z 623 [M-H]-) smo identificirali kotakteozid[5]. Pomembno je, da imata obe spojini isti aglikon, ki vključuje kofeinsko kislino (spojina 3) in 3,4-dihidroksilfeniletanol (spojina 4).

2.2. Testi viabilnosti celic

Za analizo učinka spojin 1–4 na viabilnost celic EA.hy926 sta bila uporabljena testa MTT in CCK{{0}}. Test MTT je pokazal, da se je sposobnost preživetja celic EA.hy926 znatno povečala po zdravljenju s 25 in 50 μM spojinami 1, 2 ali 3 (166,3 % in 174,1 % za spojino 1, 205,8 % in 224,3 % za spojino 2 in 164,8 % oziroma 189,6 % za spojino 3; p < 0,05) v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 2A). Poleg tega je morfološki pregled celic ugotovil, da je zdravljenje s 50 μM spojine 1, 2 ali 3 povečalo tvorbo vijoličnih kristalov formazana, ki so neposreden pokazatelj deleža živih celic (slika 3). Nasprotno pa je test CCK-8 pokazal, da se je viabilnost celic znatno zmanjšala po zdravljenju z 12,5, 25 in 50 μM spojine 1, 2 ali 3 (75,5 %, 45,1 % in 43,7 % za spojino 1, 85,5 %, 51,8 % in 34,3 % za spojino 2 oziroma 64,5 %, 48,2 % oziroma 36,4 % za spojino 3; p < 0,05) v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 2B). Spojina 4 ni vplivala na viabilnost celic niti v testu MTT niti v CCK-8. Neskladje med rezultati, dobljenimi z obema testoma, nakazuje, da eden od obeh testov morda ne odraža natančno učinkov spojin 1 in 2 na sposobnost preživetja celic EA.hy926.

2.3. Hoechstova ocena apoptoze

Barvanje Hoechst 33342 je za celice prepusten DNA madež, ki ga vzbuja ultravijolična svetloba in oddaja modro fluorescenco pri 460 do 490 nm. Kondenzirani kromatin apoptotičnih celic se obarva svetlejše kot kromatin normalnih celic [6]. Medtem ko so kontrolne celice pokazale enakomerno razpršen kromatin, normalne organele in nedotaknjene celične membrane, so celice, inkubirane s 50 μM spojin 1, 2 ali 3 48 ur, pokazale tipično obarvanje apoptotičnih celic (slika 4A). Nasprotno pa izpostavljenost celic 50 μM spojine 4 ni povečala števila apoptotičnih jeder v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem.

2.4. Pretočna citometrična analiza apoptotičnih celic

Test dvojnega obarvanja z aneksinom V-FITC/PI identificira apoptotične celice z visoko afinitetno vezavo aneksina V-FITC na fosfatidilserin, ki se eksternalizira v celicah, ki so podvržene apoptozi [7]. V tem testu se preživete celice ne vežejo niti na aneksin V niti na PI in zato niso obarvane (spodnji levi kvadrant), zgodnje apoptotične celice so obarvane zeleno z vezavo aneksina V-FITC (spodnji desni kvadrant) in pozne apoptotične celice se obarvajo zeleno in rdeče zaradi vezave aneksina V-FITC na fosfatidilserin oziroma PI na nekrotične celice (zgornji desni kvadrant). Kot je prikazano na sliki 4B, se je v celicah, inkubiranih s 50 μM spojin 1, 2 ali 3 48 ur, odstotek apoptotičnih celic povečal s 3,74 % (kontrolne celice) na 10,32 %, 12,95 % oziroma 11,30 %. V primerjavi s kontrolnimi celicami spojina 4 ni povečala odstotka apoptotičnih celic EA.hy926.

V skladu z rezultati, pridobljenimi s testom CCK-8 in barvanjem s Hoechst 33342, je test s pretočno citometrijo pokazal, da spojine 1, 2 in 3 inducirajo apoptozo v celicah EA.hy926. Ta opažanja skupaj kažejo, da je povečanje viabilnosti celic EA.hy926, opaženo s testom MTT po zdravljenju s spojinami 1–3, predstavljalo lažno pozitiven rezultat.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA KREPANJE IMUNNOSTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Diskusija

Leta 1983 je Mosmann razvil kolorimetrični test MTT na mikroploščici za merjenje celične proliferacije in citotoksičnosti [8]. Ta preprosti test in njegove modifikacije se zdaj v veliki meri uporabljajo v laboratorijih celične biologije po vsem svetu. Študije frakcioniranja v celicah sesalcev so pokazale, da je reducirani piridinski nukleotidni kofaktor, NADH, odgovoren za večino zmanjšanja MTT. To so podprle študije s celimi celicami [9]. Zmanjšanje MTT je torej povezano s presnovno aktivnimi celicami in ni povezano samo z mitohondrijskim dihanjem, ampak tudi s citoplazmo in nemitohondrijskimi membranami, vključno z endosomsko/lizosomsko komoro in plazemsko membrano [10]. Neto pozitivni naboj na molekuli MTT je primarni dejavnik za njen celični privzem preko potenciala plazemske membrane.

Predvsem test MTT morda občasno ne odraža natančno dejanskega učinka, ki ga ima testirana spojina na določene celice. Vendar kemične strukture ali skupine, ki bi lahko povzročile nasprotujoče si rezultate v testu MTT, niso bile identificirane. Nedavne študije so pokazale, da bi lahko test MTT podcenjeval antiproliferativni učinek (-)-epigalokatehin-3-galata, najpogostejšega polifenola v zelenem čaju [11]. V študijah z uporabo testa MTT za odkrivanje kemosenzitivnosti tumorja so kemoterapevtiki proti raku, kot so epirubicin, paklitaksel, docetaksel in imatinib mezilat (Gleevec), pokazali povečano sposobnost preživetja celic [12,13]. Poleg tega je več študij poročalo, da bi nekateri rastlinski izvlečki in redoks-aktivni polifenoli lahko motili test MTT, saj neposredno zmanjšajo tetrazolijevo sol MTT v odsotnosti celic [14].

Potreba po raztapljanju kristalov formazana MTT pred spektrofotometrično analizo v bralniku mikroplošč in inherentna narava končne točke reakcije omejujejo uporabo testa MTT na določene aplikacije. To je vodilo do razvoja analogov tetrazolija, v katerih so bili fenilni deli okrašeni z negativno nabitimi sulfonatnimi skupinami, kot je 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolijev-5-karboksanilid (XTT), negativno nabita notranja sol [15] in 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolij (MTS), šibko kisla notranja sol, tesno povezana z MTT [16] . Te modifikacije so povzročile proizvodnjo produktov formazana, topnih v gojišču kulture, ki so odpravili zahtevo po koraku solubilizacije pred kvantitacijo. Skladno s tem, ker je povečan negativni naboj na teh molekulah zmanjšal njihovo sposobnost premikanja skozi celične membrane [17], so se pojavili vmesni akceptorji elektronov (IEA), kot je 1-metoksi-5-metil fenazin metil sulfat ({{25 }}metoksi PMS) so bili potrebni za olajšanje redukcije tetrazolnega barvila ali za povečanje stopnje redukcije.

Nedavno je bila razvita nova generacija vodotopnih tetrazolijevih soli, katerih prototip je WST-1 [18]. WST-1, negativno nabita disulfonirana notranja sol, ki vsebuje ostanek joda, je stabilnejša od XTT in MTS v prisotnosti 1-metoksi PMS, to je obvezno IEA. To je vodilo do trženja WST-1/1-metoksi PMS kot priročnega kompleta za celično proliferacijo z enim reagentom. Razvitih je bilo več drugih tetrazolijevih soli v seriji WST, od katerih je morda najbolj uporabna WST-8 [19]. Zdi se, da ima WST-8 zelo podobne lastnosti celične redukcije kot WST-1 in se trži neodvisno kot test CCK-8. WST-8 je celično neprepusten in se zato reducira zunajcelično, s transportom elektronov iz intracelularnega NADH v WST-8 preko plazemske membrane, ki ga posreduje 1-metoksi PMS. Čeprav zmanjšanje MTT in WST-8/1-metoksi PMS poganja znotrajcelični NADH, se zdi, da se vir NADH razlikuje znotraj teh dveh metod. WST-8/1-metoksi PMS zmanjšanje je bolj odvisno od malat/aspartat shuttle, ki povezuje mitohondrijski cikel trikarboksilne kisline-NADH z ekstramitohondrijskim prostorom [20].

V preliminarnih poskusih smo potrdili, da spojine 1, 2, 3 in 4 ne morejo neposredno reducirati tetrazolijeve soli MTT (ni prikazano). V tej študiji je bil neposredni vpliv samih spojin z reagentom izločen s skrbnim izpiranjem mikroplošč s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS), preden smo dodali raztopino MTT ali CCK-8, kot je navedeno v protokolih proizvajalca. Kljub temu so bili rezultati, dobljeni z uporabo obeh metod, še vedno protislovni (slika 2). Kot je bilo pričakovano, je inkubacija celic s spojinami 1, 2 in 3 povečala redukcijo tetrazolijeve soli v vijolični formazan v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3), kar nakazuje, da je zgolj redukcija tetrazolijeve soli v prisotnosti specifične spojine ne zadostuje za presojo sposobnosti spojine, da vpliva na test MTT.

Da bi ugotovili, ali lahko spojine 1, 2, 3 in 4 inducirajo apoptozo v celicah EA.hy926, so bile ocenjene celične morfološke spremembe in eksternalizacija fosfatidilserina. Skladno z zmanjšanjem celične sposobnosti preživetja, opaženim s testom CCK-8, so rezultati Hoechstovega barvanja in analize pretočne citometrije z uporabo aneksina V-FITC/PI pokazali, da je zaviranje rasti, opaženo po zdravljenju s spojino 1, 2 in 3, vsaj deloma zaradi apoptoze celic EA.hy926. Naši rezultati so podprli tudi idejo, da je kafeilna skupina, prisotna v obeh spojinah 1 in 2, odgovorna za protislovne rezultate, dobljene s testom MTT.

Podobno kot naše ugotovitve, Rottlerin, močan odpirač kalijevih kanalov z veliko prevodnostjo, ni pokazal reaktivnosti proti MTT in vitro. Vendar pa je močno povečal tvorbo kristalov formazana v celicah, rezultat, ki je bil v očitnem nasprotju z Rottlerinovo inhibicijo NF-κB in celično proliferacijo, opaženo z analizo vključitve [3H]-timidina v DNK [21]. Mehanizem, s katerim je Rottlerin povečal zmanjšanje MTT, je bil pripisan njegovemu učinku ločevanja mitohondrijev [22]. Rottlerin ima skupino substituentov cinamoilne kisline. V primerjavi s cinamoilno kislino ima spojina 3 dva dodatna hidroksilna ostanka, ki se nahajata pri C-3 in C-4. Zato špekuliramo, da je mehanizem, s katerim spojini 1 in 2 povzročita nasprotujoče si rezultate v testu MTT, lahko povezan tudi z njihovimi učinki ločevanja mitohondrijev. Za preizkušanje te hipoteze so potrebne primerjalne študije med spojinama 1 in 2 ter kemičnim ločilnikom, kot je trifluorokarbonilcianid fenilhidrazon (FCCP).

 NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Eksperimentalni odsek

3.1. Reagenti in kemikalije

Spojina 3 (kafeinska kislina v prahu, čistost=98.6%) je bila kupljena pri Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). Spojino 4 (3,4-dihidroksilfeniletanol–olje, čistost=98.5%) smo pridobili pri Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). MTT in dimetil sulfoksid (DMSO) sta bila pridobljena pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Test CCK-8 je bil kupljen pri Dojin Laboratories (Kumamoto, Japonska). Kompleti za odkrivanje apoptoze Hoechst 33342 in aneksin V-FITC/PI so bili kupljeni pri Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kitajska).

3.2. Rastlinski material

C. tubulosastebla so bila zbrana v prefekturi Yutian, avtonomna regija Xinjiang Uygur, Kitajska. Vzorci vavčerjev so bili deponirani v Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Kitajska) in jih je overil Yi Zhang z Univerze tradicionalne kitajske medicine Chengdu (Chengdu, Kitajska).

3.3. Ekstrakcija in izolacija rastlinskega materiala

Na zraku posušena stebla C. tubulosa (0.6 kg) so bila zdrobljena v prah in ekstrahirana s 50% etanolom 2 uri pri 70 stopinjah. Po odstranitvi topila pod znižanim tlakom smo etanolni ekstrakt (212,5 g) raztopili in suspendirali v vodi (2 L) ter ekstrahirali z n-butanolom (2 L × 3). Ekstrakt n-butanola (110 g) kromatografiramo na poliamidni koloni in eluiramo z etanolom/vodo (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), pri čemer dobimo pet frakcij (A–E) . Frakcijo B (65 g) smo frakcionirali na ODS koloni; eluiranje z etanolom:voda (1:9) loči spojino 1 (3 g). Frakcijo D (10,5 g) smo frakcionirali na ODS koloni; eluiranje z etanolom/vodo (1:4) loči spojino 2 (1 g).

NMR spektri so bili posneti na spektrometru Bruker Avance 600 v CD3OD s tetrametilsilanom (TMS) kot internim standardom. Masni spektri so bili izvedeni na masnem spektrometru BioTOF-Q.

3.4. Celična kultura

Celične linije EA.hy926 so bile pridobljene iz American Type Culture Collection (Manassas, VA, ZDA). Celice smo gojili v mediju RPMI 1640, dopolnjenem z 10 % (v/v) fetalnega govejega seruma in 1 % (v/v) penicilin-streptomicina v vlažnem okolju s 5 % CO2 pri 37 stopinjah.

3.5. Viabilnost celic

Preživetje celic je bilo ocenjeno z uporabo testov MTT in CCK{{0}}. Spojini 1 in 2 ter njuni aglikoni, kofeinska kislina (3) in 3,4-dihidroksilfeniletanol (4) smo raztopili v DMSO do končne koncentracije DMSO < 0,1 % (v/v) v gojišču.

Celice EA.hy926 smo zasejali na 96-plošče z vdolbinicami pri 4 × 103 celic/vdolbinico. Po 24-urni inkubaciji smo celice 24 ur obdelali s 6,25–50 μM spojine 1, 2, 3 ali 4. Gojišče smo odstranili in celice dvakrat sprali s fosfatno pufrano slanico (PBS). Alikvote (10 μL) osnovne raztopine MTT (5 mg·mL-1) dodamo v vsako vdolbino, ki vsebuje 100 μL medija, in inkubiramo s celicami 4 ure. Po inkubaciji smo medij odstranili in v vsako vdolbinico dodali 150 μL alikvote DMSO, da solubilizirali kristale formazana. Absorbanco smo izmerili pri 490 nm z bralnikom mikroplošč (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, ZDA). Viabilnost celic je bila izražena kot odstotek zmanjšanja MTT, pri čemer je bila 100-odstotna vrednost dodeljena absorbanci kontrolnih celic. Vsi poskusi so bili izvedeni trikrat in predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD).

Test CCK-8 je bil izveden v skladu z literaturo z manjšimi spremembami [23]. Natančneje, celice smo 24 ur obdelali s 6,25–50 μM spojin 1, 2, 3 ali 4 in jih dvakrat sprali s PBS pred dodatkom 10 μL raztopine CCK-8 in 100 μL gojišča. Po inkubaciji mikroplošče pri 37 stopinjah 2 uri smo absorbanco izmerili pri 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Viabilnost celic je bila izražena kot odstotek sposobnih celic glede na kontrolne celice (100 %). Vsi poskusi so bili izvedeni trikrat in izraženi kot povprečje ± SD.

3.6. Ocena apoptoze z barvanjem Hoechst 33342

Apoptotične morfološke spremembe so opazili z barvanjem s Hoechst 33342. Na kratko, celice EA.hy926 smo zasejali na 48-plošče z vdolbinicami (2 × 104 celic/vdolbinico) in jih obdelali s 50 μM spojine 1, 2, 3 ali 4 48 ur pri 37 stopinjah, dvakrat sprali s PBS, in fiksiramo s 4% (v/v) paraformaldehidom 15 minut pri sobni temperaturi. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo celice obarvali s Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) 5 minut pri sobni temperaturi in dvakrat sprali s PBS. Jedra, obarvana s Hoechstom, smo vizualizirali s fluorescenčnim mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonska).

3.7. Analiza apoptoze s pretočno citometrijo

Apoptotične celice so bile odkrite z dvojnim obarvanjem z aneksinom V-FITC/PI in analizo s pretočno citometrijo. Na kratko, po obdelavi s 50 µM spojine 1, 2, 3 ali 4 48 ur smo celice pobrali in resuspendirali v PBS pri 1 × 105 celic · mL-1. Po centrifugiranju pri 500 × g 5 minut pri 25 stopinjah smo dodali 195 μL pufra za vezavo aneksina V-FITC in 5 μL aneksina V-FITC. Po nežnem vrtinčnem mešanju smo zmes inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi v temi. Po centrifugiranju pri 500 × g 5 minut pri 25 stopinjah smo dodali 190 μL FITC-konjugiranega pufra za vezavo aneksina V in 10 μL PI. Po nežnem vrtinčnem mešanju smo vzorce analizirali s pretočnim citometrom FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA) v 30 minutah.

3.8. Statistična analiza

Vsi eksperimentalni podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD. Pomembnost razlik med poskusnimi vzorci in pripadajočo kontrolo smo ocenili z enosmerno analizo variance (ANOVA) s programsko opremo SPSS (verzija 11.5). Statistična značilnost je bila nastavljena na p < 0,05.

4. Sklepi

Naši rezultati kažejo, da bi lahko precenjevanje števila živih celic, opaženih v testu MTT, prikrilo citotoksičnost nekaterih spojin. Zato med postopki presejanja zdravil priporočamo uporabo različnih metod za določanje učinka določene spojine na sposobnost preživetja celic (kot so testi CCK-8 in 3 H-TdR), da se izognete ustvarjanju zavajajočih rezultatov.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA SPODBUJANJE IZLOČANJA TESTOSTERONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%