Intramuskularno povečanje s HIFN-alfa 2b izboljša zaščito, ki jo povzroča BCGphipps, pri mišjem modelu gobavosti

Povzetek:

Imunost gostitelja na Mycobacterium leprae zajema spekter mehanizmov, ki segajo od zaščite, ki jo poganja celična imunost, do poškodb, povezanih s humoralno imunostjo, kot pri reakcijah gobavosti tipa -2. Čeprav interferoni tipa I (IFN) sodelujejo pri odpravljanju intracelularnih patogenov, njihov prispevek k tvorbi protiteles in CD3 plus FOXP3 plus regulatornih celic T (Tregs) pri zaščiti pri gobavosti, posredovani s cepivom BCG, ni znan. Priprava BCGphipps (BCGph), ki ji je sledila intramuskularna spodbuda hIFN- 2b, je znatno zmanjšala velikost lezije in rast Mycobacterium lepraemurium v ​​koži. Folikularne regulacijske celice T (TFR), podmnožica Tregov, induciranih z imunizacijo ali okužbo, se nahajajo v zarodnih centrih (GC) in modulirajo proizvodnjo protiteles.

Ugotovili smo oslabljeno indukcijo Treg in izboljšane GC v dreniranih bezgavkah miši, ki so bile pripravljene z BCGph, in miši, okrepljene s hIFN{0}}b. Poleg tega so te miši izzvale znatne količine IL-4 in IL-10 v serumu. Tako naši rezultati podpirajo adjuvantne lastnosti hIFN- 2b v kontekstu priprave BCGph za izboljšanje zaščitne imunosti proti kožni gobavosti.

Zaščitna imunost se nanaša na sposobnost telesa, da se brani pred nalezljivimi patogeni s proizvodnjo protiteles, celic T itd., in je eden od pomembnih mehanizmov, da se telo upre boleznim. Imunost se nanaša na sposobnost telesa, da prepozna in se odzove na različne tuje snovi (vključno s patogeni, tujki, tumorskimi celicami itd.), vključno s celično imunostjo in humoralno imunostjo. Zaščitna imunost je del imunosti in oba sta tesno povezana. Dobra imuniteta lahko spodbuja izboljšanje zaščitne imunosti, da bolje prepreči pojav bolezni. Hkrati lahko izboljšanje zaščitne imunosti okrepi tudi imunost, s čimer se telo lažje spopade z različnimi zunanjimi izzivi. Zato je vzdrževanje zdravega imunskega sistema, vključno z dobro zaščitno imunostjo, zelo pomembno za ohranjanje dobrega zdravja. S tega vidika je zelo pomembna tudi imuniteta. Če želimo izboljšati našo imunost, lahko Cistanche bistveno izboljša našo človeško imunost. Polisaharidi v Cistanche lahko uravnavajo imunski odziv človeškega imunskega sistema in izboljšajo imunske celice. Sposobnost stresa, poveča baktericidni učinek imunskih celic.

Kliknite zdravstvene koristi cistanche

Ključne besede:

Mycobacterium lepraemurium; mišja gobavost; interferon alfa; BCGphipps; zarodna središča; regulatorne T celice.

1. Uvod

Mycobacterium leprae in Mycobacterium lepromatosis, etiološki dejavniki gobavosti pri ljudeh [1,2], prizadenejo kožo in periferne živce [3]. Čeprav je zdravljenje z več zdravili (MDT) za gobavost na voljo, ostaja število novih primerov stabilno (700 000 na leto).

Poleg tega pomanjkanje učinkovitega diagnostičnega postopka otežuje sledenje prenosa M. leprae [4–7]. Genetska nagnjenost k zgodnji gobavosti [8] poudarja potrebo po pravočasni diagnozi in razvoju poceni imunoterapij za zmanjšanje incidence gobavosti v razvitih državah [9,10]. Spekter kliničnih manifestacij gobavosti je v korelaciji z vrsto izzvanega imunskega odziva. Na primer, tuberkuloidna gobavost (TT), za katero je značilen dominanten odziv Th1, omejuje rast bacilov preko aktivacije mikrobicidnih funkcij makrofagov, ki jo poganja IFN. Nasprotno pa je bila proizvodnja klasičnih citokinov Th2 (IL-4 in IL-10) povezana z izgubo zaščite in povečano rastjo bakterij pri diseminirani lepromatozni gobavosti (LL) [10]. Obstajajo tudi vmesni podtipi, ki predstavljajo mešanico odzivov Th1 in Th2 [10].

Okužba miši z M. lepraemurium (MLM) [11,12] je bila uporabljena za preučevanje imunoloških mehanizmov človeške gobavosti [11–13], čeprav MLM ne kaže tropizma za periferne živce [11,13] kot M. leprae naredi [14]. Kljub temu obeh mikobakterij ni mogoče gojiti in počasi rasteta v gostitelju ter podvojita svoje število v 1–3 tednih.

Eksperimentalna podkožna okužba z majhnimi odmerki bakterij zelo posnema naravno bolezen, ki se običajno pojavi, ko motnje pregrad olajšajo kolonizacijo mikobakterij in sprožijo imunsko reakcijo na periferni ravni [13,15–17]. Medtem ko je celično posredovana imunost (CMI) oslabljena, humoralna imunost pri človeški in mišji gobavosti praktično ni prizadeta [18]. Poleg tega celice Th1- ali Th2-, drugi limfociti T, oblikujejo imunost gostitelja na okužbo z M. leprae [18,19].

Zanimivo je, kako M. leprae vpliva na imunost gostitelja pri različnih podtipih mikobakterijske bolezni. Ena od hipotez je, da patogen zmanjša humoralno in celično imunost gostitelja, da okuži kožo in periferne živce [3,14,15]. Obstajajo tudi dokazi, da bacil oslabi aktivacijo makrofagov. Prav tako zmanjša izražanje TNF-alfa in molekul, kot so prostaglandini, ki inducirajo proizvodnjo IL-1 in reaktivnih kisikovih in dušikovih intermediatov (ROI in RNI), ki so kritični pri mikobaktericidnih funkcijah makrofagov [20–22].

Humoralni odzivi, ki nastanejo v GC sekundarnih in terciarnih limfoidnih tkiv, sodelujejo pri zaščitni imunosti proti patogenom [23–26]. Nedavno poročilo o gobavosti je poudarilo kritično vlogo Tregs pri zaviranju odzivov celic Th1 in Th17 [19]. Pravzaprav ravnovesje med temi podskupinami celic T na GC [27–29] narekuje zaščitne ali patološke izide nalezljivih in avtoimunskih bolezni [30, 31] in je ključnega pomena za razvoj terapij za spodbujanje zaščitne imunosti [26, 27]. ].

Zlasti T-pomožne folikularne celice (TFH) in zlasti T-folikularne regulatorne celice (TFR) modulirajo odziv GC, da inducirajo dolgotrajne humoralne imunske odzive, hkrati pa preprečujejo nastajanje avtoprotiteles [32,33]. Glede na to, da je IFN tipa I povezan z nastajanjem tako TFH kot Tregs, se kaže kot obetaven adjuvans za spodbujanje odzivov TFH v GC v okviru cepljenja z BCG [34].

Sluznično dajanje IFN tipa I inducira zorenje dendritičnih celic in nastajanje CXCR5 plus CD4 plus TFH, kar olajša razvoj GC in proizvodnjo protiteles z visoko afiniteto v bezgavkah [34]. V nasprotju s tem IFN-ji tipa I odpravijo imunost gostitelja pri človeški tuberkulozi tako, da zavirajo nastajanje inducibilne sintaze dušikovega oksida (iNOS), IL-12p40, IL-1A in IL-1, medtem ko inducirajo IL-10 in IL-1R antagonisti [35–38]. Tako je sodelovanje IFN tipa I odvisno od konteksta [38–42]. Interferoni tipa I nastajajo na stalni ravni, toda ko znotrajcelični patogen vdre v gostitelja, se inducira več heterogenih in kompleksnih protivirusnih ali protibakterijskih prirojenih odzivov [43–48], vključno s preklopom razreda protiteles, somatsko hipermutacijo in okrepitvijo. razpoložljivosti antigena v GC, kar bo vodilo do močnih in učinkovitih odzivov protiteles [34,49].

Prej smo poročali o zaščiti, pridobljeni z zaporedno intramuskularno krepitvijo IFN pri miših, cepljenih z Mycobacterium bovis BCG in izzvanih z MLM [42] ali proti aerosolizirani okužbi z M. tuberculosis [41]. Pri miših, ki so bile izzvane z MLM, je bila zaščita povezana s povečano proizvodnjo iNOS, dušikovega oksida in protiteles IgG3 [42]. V okviru izziva M. tuberculosis so zaščitene miši izzvale odziv Th1 [41].

V novejši študiji so IFN tipa I modulirali avtofagijo in presnovo pri gobavosti [50]. V tej študiji smo se odločili nadalje raziskati zaščito pred mišjo gobavostjo, povzročeno s cepljenjem z M. bovis BCGphipps (BCGph) in farmacevtsko obliko humanega IFN- 2b [51]. V nedavnih študijah je bil za uspešno zdravljenje raka mehurja uporabljen rekombinantni BCG, ki izraža humani IFN- 2b [51–55]. V skladu s temi podatki je bil naš cilj v tej študiji analizirati zaščito, povzročeno s pripravo BCGph in okrepitvijo hIFN- 2b v mišjem modelu gobavosti. Skupaj naši rezultati predvidevajo potencial podkožnega pripravka BCGph in intramuskularnega povečanja hIFN- 2b za induciranje zaščitne imunosti proti človeški gobavosti.

2. Material in metode

2.1. Živali

Specifične miši Balb/c brez patogenov so bile vzrejene in nameščene v objektih za živali Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional v Mexico Cityju.

Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni po odobritvi (7. marca 2014) s strani Odbora za institucionalno oskrbo in upravljanje živali (CIE-ENCB ZOO 016/2014).

2.2. Mikroorganizmi

Sev BCG Phipps (ATCC® 35744™) (BCGph) je različica seva BCG, ki je izgubil regijo RD1, ki kodira ESAT-6 in CFP10, z najmanjšim številom epitopov celic T , 316, v primerjavi z BCG Tokyo, 359, in BCG Pasteur, 331, (Zhang et al., 2013) [51] in ga je zagotovil dr. Hernández-Pando (INCMNSZ, Mexico City, MX). Suspenzije cepiva so bile nato do uporabe shranjene pri –80 ◦C. Nekultivirani sev Mycobacterium lepraemurium (MLM) je bil izoliran iz vranice miši, ki so nosile štirimesečno okužbo, s postopkom, ki so ga opisali Prabhakaran et al., 1976 [56], čemur je sledilo čiščenje z osebnim postopkom izolacije, ki ga je opisal Draper P. , 1980 [57]. Na kratko, 4 g vraničnega tkiva smo suspendirali v 20 ml 0,2 M saharoze in zmleli v steklenem homogenizatorju tipa Potter-Elvehjem. Nastalo suspenzijo smo centrifugirali 20 minut pri 150 × g, da smo odstranili ostanke celic (Sorvall RV5B, rotor HB4) (Sorvall Instruments, Wilmington, DE, ZDA). Nato smo 9 mL supernatanta prekrili z 12 mL 0,3 M saharoze in epruvete centrifugirali pri 3500 × g 10 minut pri 4–10 ◦C (Sorvall RC5B). Nastalo peleto, bogato z bacili, smo resuspendirali v 20 ml 0,2 M saharoze in alikvote po 9 ml smo prekrili z 12 ml 1,5 M KCl.

Nato smo epruveto centrifugirali pri 4 ◦C 10 min pri 3500× g. Bacile smo zbrali, trikrat sprali s fosfatnim pufrom (PBS) (0,01 M Na/K fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,4) in ponovno suspendirali v 40 ml raztopine, ki je vsebovala mešanico Percoll (3 deli) in 0,1 odstotka Tween 80 (7 delov). Suspenzijo smo centrifugirali pri 23,000× g. Baktilne pelete smo zbrali in petkrat sprali s PBS, dokler niso odstranili Percoll. Čistost bacilarnega pripravka je bila potrjena z barvanjem po Ziehl–Neelsenu. Očiščeno bacilarno suspenzijo smo pripravili v sintetičnem mediju 7H9 Middlebrook brothOADC (DIFCO, Detroit, MI, ZDA) (medij 7H9-OADC) in kvantificirali preko nefelometrične referenčne krivulje, pripravljene z znanimi količinami bakterij. Baktilno suspenzijo smo alikvotirali in zamrznili pri –20 ◦C, dokler ni bila pripravljena za uporabo.

2.3. Imunizacije

Skupine osem tednov starih miši Balb/c (n=6) so bile subkutano imunizirane z 8 × 103 enotami, ki tvorijo kolonije (CFU) BCGphipps v 200 µL sterilnega PBS. En mesec pozneje je bila vsaka skupina miši intramuskularno okrepljena v treh zaporednih dneh (30, 31 in 32 dni po cepljenju) s 100 µL PBS ali s 100, 200 ali 300 mednarodnimi enotami (IU) hIFN{{14} }b (Urifron, Probiomed, Azcapotzalco, Mexico City, Mehika).

2.4. M. lepraemurium Izziv

Za izzivalne poskuse smo miši intradermalno inokulirali z 2 × 106 živih MLM v 20 µL PBS. Nato so bile miši nameščene v standardnih pogojih in oskrbljene s prečiščeno vodo in čipsom za hrano za glodavce Purina (Cuautitlan Izcalli, Mehika) ad libitum. Okužene miši so spremljali osem tednov, časovne točke, ko so bile lezije očitne na koži okuženih živali. Napredovanje bolezni je bilo pri miših spremenljivo in v korelaciji z eksperimentalnimi terapijami (PBS, BCGph ali hIFN- 2b).

2.5. Encimski imunosorbentni testi (ELISA)

Protitelesa v serumih miši, okuženih z MLM, so merili z indirektnimi encimsko-imunskimi testi (ELISA). Na kratko, 96-plošče z vdolbinicami (Nunc, Rochester, NY, ZDA) so bile čez noč pri 4 ◦C prevlečene z 1.0 µg peptidoglikolipidov, raztopljenih v etanolu [38]. Po izhlapevanju etanola pri sobni temperaturi [37] je bila nespecifična vezava blokirana s 3 odstotki nemastnega mleka v PBS od 2 do 3 ur. Ko smo zavrgli raztopino za blokiranje, smo v jamice dodali 0.1 ml seruma, razredčenega (1:100) v 1 odstotku nemastnega mleka v PBS, in inkubirali čez noč pri 4 ◦C.

Nato smo plošče izdatno sprali s PBS in vezana protitelesa odkrili z {{0}}.1 ml protimišjega IgG (1:4000, BD 550487, BD Pharmingen, San Diego, CA, ZDA), IgG1-HRP (1:2500, ab 97240, Abcam, Cambridge, MA, ZDA), IgG2a-HRP (1:2500, ab97245, Abcam), IgG2b-HRP (1: 2500, ab97250, Abcam) ali IgG3-HRP (1:2500, ab97260, Abcam) ali z biotinom konjugirano podganje protimišje monoklonsko protitelo IgA (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen), ki mu sledi podganje anti-mišje Ig protitelo, konjugirano s hrenovo peroksidazo (HRP) (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen) ali avidin-HRP (ab 59653, abcam) Kromogeni substrat, tetrametil-benzidin v 0,05 M citrat-fosfatnem pufru (pH 5.2), dopolnjen z 0,01 odstotka vodikovega peroksida (H2O2), smo dodali v vdolbinice za razvoj barve. Reakcijo smo ustavili z 1 M H3PO4. Optične gostote so bile izmerjene pri 450 nm v bralniku mikroplošč ELISA (LabSystems Multiskan Plus, LabX, Midland, ON, Kanada). IFN-, IL-4, IL-17, IL-6, TNF- in IL-10 so bili izmerjeni v serumu s posebnimi sendvič kompleti ELISA (PEPROTEC Inc., Cranbury , NJ, ZDA). po navodilih proizvajalca.

2.6. Meritve NO v serumu miši

Na kratko, serume smo obdelali z etanolom (1:1), da oborimo beljakovine in druge moteče dejavnike. Po 20-minutnem centrifugiranju pri 3000 obratih na minuto smo 20 µL pridobljenega seruma dali v vdolbinice plošče ELISA skupaj s 100 µL Griessovega reagenta in 80 µL destilirane vode. Griessov reagent je zmes raztopine A (2 odstotka sulfanilamida v 5 odstotkih fosforne kisline) in raztopine B (0,1 odstotka N-(1-naftil) etilendiamin, dihidroklorid. Po 30 minutah inkubacije pri 25 ◦ C je bila razvita rožnata barva registrirana v bralniku ELISA pri 595 nm Vrednosti so bile ekstrapolirane na standardno krivuljo natrijevega nitrita v območju 1–100 µM.

2.7. Imunofluorescenca

Primarna protitelesa so bila pridobljena od naslednjih podjetij: kozja protitelesa proti iNOS (klon M-19, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ZDA), kunčja protitelesa proti nitrotirozinu (AB 5411, EMD, Millipore, Burlington, MA, ZDA ), biotinska podgana Ly6C/Ly6G (klon RB6-8C5, BD Pharmingen), kozji anti-CD3 epsilon (klon M-20, Santa Cruz Biotechnology), podganji protimišji FoxP3 (klon FJK{{12} }s, eBioscience, San Diego, CA, ZDA), kozji antiproliferacijski celični jedrski antigen (klon C-20, Santa Cruz Biotechnology), FITC-arašidov aglutinin (L7381- 1MG, SIGMA, St Louis, MO, ZDA) in APC-podganji protimišji CD45R (klon RA3-6B2, BD Pharmingen).

Primarna protitelesa so bila odkrita z naslednjimi sekundarnimi protitelesi: Alexa Fluor 568 oslovski IgG proti kozam (A11057, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), Alexa Fluor 488 oslovski IgG proti kuncem (711-546, Jackson ImmunoResearch Laboratories , West Grove, PA, ZDA) in Alexa Fluor 680 streptavidin (S32358, Thermo Fisher Scientific).

Parafinizirane reze s petimi µm, fiksirane s formalinom, smo inkubirali pri 60 ◦C čez noč za deparafinizacijo. Odrezke tkiv smo hitro prenesli v ksilene (247642-2.5L, SIGMA) in hidrirali z zaporednim potapljanjem stekelcev v absolutni alkohol, 96-odstotni alkohol, 70-odstotni alkohol in vodo. Predmetna stekelca smo potopili v raztopino za pridobivanje antigena, kuhali 30 minut in ohlajali 10 minut pri sobni temperaturi (RT). Predmetna stekelca smo večkrat splaknili z vodo in prenesli v PBS. Nespecifična vezava je bila blokirana s 5 odstotki normalnega oslovskega seruma v PBS, ki je vseboval 0,1 odstotka Tween 20 in 0,1 odstotka Triton-X-100, 30 minut pri sobni temperaturi v vlažni komori. Primarna protitelesa so bila dodana stekelcem in inkubirana čez noč v vlažni komori pri sobni temperaturi. Predmetna stekelca smo nežno sprali v PBS in fluorescentno označena sekundarna protitelesa inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi ali čez noč v vlažni komori.

Nazadnje smo stekelca spirali 1 uro v PBS in namestili z Vectashield antifade pritrdilnim medijem z DAPI (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, ZDA). Slike so bile posnete z mikroskopom Zeiss Axioplan. Vse zarodne centre (GC) v odseku bezgavk smo izmerili z avtomatiziranim orodjem mikroskopa Carl Zeiss, povprečno velikost GC pa smo izračunali s programsko opremo Prism. CD3 plus FoxP3 plus Tregs smo prešteli v 5 naključnih 200 × poljih na tkivo, da bi izračunali povprečno število pozitivnih celic na polje.

2.8. Statistična analiza

Statistično pomembne razlike med skupinami so bile izračunane z enosmerno ANOVA, Newman–Keuls večkratnimi primerjavami, neparnim/parnim dvostranskim Studentovim t-testom in vrednosti P < 0.05 so veljale za statistično pomembne. Statistične razlike so bile izračunane z Graph Pad Prism.

3. Rezultati

3.1. Priprava BCGphipps (BCGph), ki ji sledi zaporedna intramuskularna krepitev hIFN- 2b, ščiti miši Balb/c pred intradermalnim izzivom z M. lepraemurium.

Pred tem smo razvili protokol za prvo okrepitev, ki temelji na zaporednem intramuskularnem povečanju IFN po BCG cepljenju miši [42] z obetajočimi rezultati zaščite. Nedavne študije so za zdravljenje raka mehurja uporabile rekombinant BCG, ki izraža humani IFN- 2b [51, 53]. Zato je bil naš cilj v tej študiji analizirati zaščito, povzročeno s pripravo BCGph, ki ji je sledilo povečanje hIFN- 2b v mišjem modelu gobavosti, po shemi, prikazani na sliki 1.

Slika 1. Protokol glavnega povečanja za oceno zaščite miši pred intradermalnim izzivom z M. lepraemurium. Skupine miši Balb/c (n=6) so bile subkutano cepljene z nizkim odmerkom BCGph (8 × 103 CFU). Miši iz vsake skupine so bile zaporedne dni (30, 31 in 32 dni po cepljenju) intramuskularno okrepljene s PBS ali hIFN- 2b. Miši smo izzvali z 2 × 106 preživetja MLM osem tednov po zadnji okrepitvi. Po tem so miši žrtvovali in biovzorce zbrali osem tednov po izzivu. Razvoj kožnih lezij smo spremljali in merili, kot je opisano v Materialu in metodah.

Na kratko, miši so bile intradermalno izzvane z MLM, osem tednov po tretji okrepitvi s 300 ie hIFN- 2b. V naslednjih osmih tednih so spremljali napredovanje bolezni. Ob koncu tega obdobja smo zbrali dimeljske bezgavke, da bi odkrili GC in ošteli Tregs in druge celične populacije z imunofluorescenco. Uporabili smo tudi imunofluorescenco za vizualizacijo proizvodnje iNOS z aktiviranimi makrofagi, lokacijo ostankov nitrotirozina (NT) in kopičenje Gr-1 plus mieloidnih celic v koži naših poskusnih miši. Poleg tega smo zbrali serum za merjenje citokinov in protiteles proti glikolipidom MLM z ELISA (slika 1).

Prvič, da bi ocenili zaščitni učinek priprave BCGph in povečanja hIFN{{0}}b proti intradermalnemu izzivu miši z MLM, smo izmerili kožne lezije in vizualizirali kolonizacijo kože z bacili z barvanjem po Ziehl–Neelsenu (Slika 2A–E). Koža miši brez pripravka, ki so prejele samo vehikel (PBS), brez izziva MLM, ni pokazala nobenih bacilov (slika 2A). Miši, inokulirane z vehiklom in izzvane z MLM, so pokazale obsežne količine bacilov MLM v koži (slika 2B), medtem ko je primarno miši z BCGph povzročilo zmanjšanje rasti mikobakterij (slika 2C). Zaporedno dajanje hIFN- 2b je zmanjšalo tudi rast mikobakterij v koži v primerjavi z mišmi, ki so bile izzvane z MLM (slika 2D). Miši, napolnjene z BCGph in okrepljene s hIFN- 2b, so imele najnižjo rast mikobakterij (slika 2E). V skladu s temi podatki so zdrave miši, ki so bile izzvane z MLM in so prejele samo nosilec (PBS), razvile najobsežnejše kožne lezije (35 ± 9,9 mm2), medtem ko so imele miši, ki so bile napolnjene z BCGph, kožne lezije podobne velikosti kot tiste, ki so se razvile v miši, inokulirane z vehiklom in izzvane z MLM (13,5 ± 4,24 mm2) (slika 2F). Miši, ki so jim subkutano injicirali hIFN- 2b, so pokazale manjše kožne lezije (20 ± 1,77 µm2). Omeniti velja, da so miši, ki so bile pripravljene z BCGph in okrepljene s hIFN- 2b, pokazale znatno zmanjšanje velikosti kožnih lezij (5 ± 7,07 mm2) (p < 0,05) (slika 2F).

\

Slika 2. Kožne lezije in rast mikobakterij pri Balb/c, okuženih z M. lepraemurium. Zaščito miši so ocenili z razvojem kožnih lezij in vizualizacijo mikobakterijske rasti v kožni leziji osem tednov po izzivu z MLM. Kožne lezije so bile obarvane z Ziehl–Neelsenom. Reprezentativne 400× povečave slik (A) neosnovanih in neizzvanih miši; (B) miši, inokulirane s PBS in izzvane z MLM; (C) miši, napolnjene z BCGph in izzvane z MLM; (D) miši, intramuskularno inokulirane s hIFN- 2b in izzvane z MLM; (E) miši, napolnjene z BCGph, okrepljene s hIFN- 2b in izzvane z MLM; (F) Učinkovita zaščita je enakovredna odsotnosti kožnih lezij ali znatnemu zmanjšanju velikosti kožnih lezij, izraženo v mm2, n=6 miši/skupino. * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 je veljalo za statistično pomembno.

3.2. Minimalna kožna patologija pri miših, napolnjenih z BCGphipps in okrepljenih s hIFNa 2b, je v korelaciji z zmanjšanim kopičenjem nitrotirozina in oslabljeno infiltracijo nevtrofilcev

Dušikov oksid je ključnega pomena za ubijanje znotrajceličnih patogenov. Vendar prekomerna proizvodnja dušikovega oksida, superoksidnega radikala (O,- in vodikovega peroksida vodi do nastanka toksičnega in nestabilnega peroksinitrita, molekule, ki reagira z ostanki tirozina na beljakovinah, da tvori stabilno NT 56-601. Čeprav peroksinitrit ubija mikobakterije, poškoduje tudi imunske celice [57-59].

Zato smo se odločili, da z imunofluorescenco poiščemo celice, ki proizvajajo iNOS, in nevtrofilce v koži naših poskusnih miši. Videli smo signale ozadja za iNOS in NT ter zelo malo celic Gr-1 plus v koži miši, ki so prejemale samo PBS (slika 3A). Povečana mikobakterijska obremenitev in povečane nekrotične lezije na koži so bile povezane z kopičenjem ostankov NT v nekrotičnem predelu kože (58, 59 necepljenih (slika 3B) in miši, predhodno zdravljenih z BCGph, ki so bile izzvane z MLM (slika 3C) v skladu z bolj uravnoteženim lokalnim vnetnim odzivom in izboljšanje kožne patologije sta se infiltracija NT in nevtrofilcev zmanjšala pri miših, ki so prejemale zaporedne inokulacije s hIFN- 2b (slika 3D) ali miših, ki so bile napolnjene in okrepljene s hIFN 2b (slika 3E). Oslabljena infiltracija z Gr{{11 }} plus nevtrofilci in zmanjšana območja NT so sovpadala z najmanjšim vnetnim območjem v histoloških odsekih kože miši, ki so bile napolnjene z BCGph in okrepljene s hIFN- 2b (slika 3F).

Slika 3. Zaščita je povezana z zmanjšanim kopičenjem nitrotirozina, oslabljenim kopičenjem nevtrofilcev in izboljšanim vnetjem kože. Odseki kožnih lezij so bili obarvani s kombinacijo protiteles, specifičnih za iNOs (rdeče), NT (zeleno) in Gr-1 (belo). Reprezentativne 200× slike iz (A) kože miši, ki niso bile pripravljene in niso bile izzvane, (B) miši, inokulirane s PBS in izzvane z MLM, (C) miši, ki so bile napolnjene z BCGphipps in izzvane z MLM, ( D) miši, intramuskularno inokulirane s hIFN- 2b in izzvane z MLM in (E) miši, napolnjene z BCGph, okrepljene s hIFN- 2b in izzvane z MLM; (F, G) kvantifikacija vnetnega področja z avtomatiziranimi orodji mikroskopa Zeiss Axioplan, kožne lezije so bile zbrane osem tednov po izzivu z MLM, grafika prikazuje povprečno površino, ki jo zasedajo vnetne celice v kožnih lezijah gobavosti, izraženo v µm2. Lestvica=100 µm. n=6 miši/skupina * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 je veljalo za statistično pomembno.

Proizvodnja NO ni bila statistično značilna v primerjavi z drugimi poskusnimi skupinami, vendar je bila v skupini miši, ki so bile primarno z BCGph in okrepljene s hIFN- 2b, koncentracija NO višja (68,28 µM/L ± 0 0,889) kot v skupinah PBS in MLM (62,79 µM/L ± 1.04), BCGph (63,37 µM/L ± 0,225), hIFN- 2b (62,57 µM/L ± 1,028 ) (slika 3G).

3.3. Protivnetni citokini so povečani v serumu miši, napolnjenih z BCGphipps in okrepljenih s hIFN- 2b

Pro- in protivnetne citokine so izmerili v serumu miši Balb/c po izzivu z MLM. V skladu z imunosupresivnim stanjem, ki ga povzroča MLM, so bile koncentracije vnetnih citokinov nizke v serumu miši Balb/c, inokuliranih s PBS in okuženih z MLM (IFN-, 625 ± 442 pg/mL; TNF-, 697 ± 436 pg/ ml; IL-6, 68 ± 48 pg/ml; IL-17, 95 ± 67 pg/ml). Nasprotno pa so imeli zmerne ravni protivnetnih citokinov v serumu (IL-10, 1763 ± 124 pg/mL in IL-4, 1250 ± 173 pg/mL). Čeprav so bile miši zaščitene s pripravo BCGph in zaporednim spodbujanjem s hIFN- 2b, se sistemske količine proinflamatornih citokinov niso statistično razlikovale od tistih pri miših, ki so bile cepljene s PBS in izzvane z MLM. Nepričakovano sta bili koncentraciji IL-4 (1875 ± 352 pg/mL, p < 0,05) in IL-10 (4250 ± 271 pg/mL) v serumu teh miši znatno povečani v primerjavi z z mišmi, inokuliranimi s PBS in izzvanimi z MLM (tabela 1). Ti rezultati kažejo, da naš protokol cepljenja morda aktivira protivnetne poti za preprečevanje poškodb tkiva.

3.4. Oslabljeno kopičenje Treg v odtočnih limfnih vozlih (DLN) miši, ki so bile napolnjene z BCGphipps ali okrepljene s hIFN- 2b

Glede na to, da Tregs proizvajajo IL-10 [61,62], smo se odločili, da kvantificiramo CD3 plus FOXP3 plus Tregs v odtočnih bezgavkah (DLN), ki se nahajajo blizu mesta cepljenja. Pri neokuženih miših (PBS) so bili Tregs še vedno prisotni (113 ± 9,8 CD3 plus FOXP3 plus Treg/200 × polje) (slika 4A). Kot je bilo pričakovano, so se Tregs znatno povečali pri miših, ki so bile izzvane z MLM, ki niso prejele cepiva (BCGph) ali hIFN- 2b (214 ± 30 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × polje) (slika 4B). Skladno so opazili nižje ravni Tregs pri miših, ki so bile napolnjene z BCGph (160 ± 26 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × polje) (slika 4C) in miših, ki so prejele hIFN- 2b (162 ± 33 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × polje) (slika 4D); miši, napolnjene z BCGph in okrepljene s hIFN- 2b (127 ± 16 CD3 plus FOXP3 plus Tregs/200 × polje) (slika 4E), so imele podobno gostoto Tregs kot necepljene miši brez hIFN- 2b krepitev. Vendar pa smo po slepem štetju CD3 plus FOXP3 plus Tregs v DLN-jih naših poskusnih miši ugotovili, da so bili Tregs bistveno zmanjšani v DLN-jih miši po pripravi BCGph (p=0.0013), hIFN- 2 b inokulacijo (p=0.0074) ali kombinirano pripravo BCGph in hIFN- 2b ojačenje (p=0.0013) v primerjavi z mišmi, ki so bile izzvane z MLM (slika 4E).

Slika 4. Oslabljeno kopičenje regulatornih celic T (Tregs) v drenažnih bezgavkah (DLN) miši, ki so bile napolnjene z BCGphipps in okrepljene s hIFN- 2b. Miši so žrtvovali in DLN-je zbrali osem tednov po izzivu z MLM. DLN je bil obarvan s protitelesi, specifičnimi za CD3 (rdeče) in FOXP3 (zelena jedra), da bi z imunofluorescenco odkril CD3 plus FOXP3 plus Tregs. (A) Bazalno kopičenje Tregs v DLN necepljenih miši; (B) Tregi v DLN so se povečali po izzivu z MLM in sorazmerno zmanjšali pri (C) BCGph-primiranih, (D) hIFN- 2b inokuliranih in (E) BCGph-primiranih-hIFN- 2b okrepljene miši; (F) morfometrična analiza kaže znatno zmanjšanje Tregs v DLN miši, napolnjenih z BCGph/hIFN- 2b, okrepljenih. Lestvica=100 µm, n=6 miši/skupina * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p < 0,0005 je veljalo za statistično pomembno.

3.5. Priprava BCGphipps in povečanje hIFN- 2b vplivata na odzive GC v mišjih DLN

Obstajajo posebni Tregs, ki se nahajajo v GC, znani kot T folikularne regulacijske celice (TFR. Modulirajo tako odzive GC in preprečujejo nastajanje avtoreaktivnih plazemskih celic (28, 33). Zmanjšani Tregs v DLN so nakazovali, da bi se odzivi GC lahko sprostili pri miših. napolnjene z BCGph in okrepljene s hlFN-a 2b. Skladno z odsotnostjo antigenske stimulacije nismo odkrili GC v DLN neokuženih miši (slika 5A). Majhni GC so bili prisotni v DLN nenapredovanih miši, izzvanih z MLMLi (slika 5B).

Slika 5. Priprava BCGphipps in povečanje vpliva hFN-a 2b na odzive GC v DLN po izzivu MLM. Miši so bile žrtvovane osem tednov po izzivu z ML M. Odtočne bezgavke (DLN) so bile obarvane z jedrnim antigenom proliferirajočih celic (PCNA, rdeča jedra), arašidovim aglutininom (PNA, zeleno) in CD45R (B22{{13). }}, bela) za identifikacijo GC, ki vsebujejo kompaktne skupine PCNA*PNA plus * B220nizke GC B celice. GC B celice v DL Ns (A) miši, ki niso bile obdelane in niso bile izzvane; (B) miši, inokulirane s PBS in izzvane z MLM; (C) miši, napolnjene z BCGph in izzivane z MLM; (D) miši, intramuskularno okrepljene s hlFN-a 2b in izzvane z MLM; (E) miši, napolnjene z BCGph, okrepljene s hlFN-a 2b, in izzvane z ML M; (F) GC smo izmerili v posameznih DL. N-ji poskusnih miši izračunajo povprečno velikost GC. Lestvica=100 um.=6 miši/skupino. " p < 0.05, * p < 0,005; *** y < 0,0005 je veljalo za statistično pomembno.

Slika 5. Priprava BCGphipps in povečanje vpliva hlFN-a 2b na odzive GC v DLN po izzivu ML M. Miši so bile žrtvovane osem tednov po izzivu z ML M. Drenažne bezgavke (DLN) so bile obarvane s protitelesi, specifičnimi za jedrski antigen proliferirajočih celic (PCNA, rdeča jedra), arašidov aglutinin (PNA, zelena) in CD45R (B22{{ 13}}, bela) za identifikacijo GC, ki vsebujejo kompaktne grozde PCNAPNA plus plus B220nizke GC B celice. GC B celice v DL Ns (A) miši, ki niso bile obdelane in niso bile izzvane; (B) miši, inokulirane s PBS in izzvane z MLM; (C) miši, napolnjene z BCGph in izzvane z MLM; (D) miši, intramuskularno okrepljene s hlFN-a 2b in izzvane z MLM; (E) miši, ki so bile primarno z BCGph, okrepljene s hlFN-a 2b in izzvane z MLM; (F) GC smo izmerili v posameznih DLN eksperimentalnih miši za izračun povprečne velikosti GC. Lestvica=100 um. 1=6 miši/skupino. " y < 0.05. * y < 0,005, *** y < 0,0005 je veljalo za statistično pomembno.

Zanimivo je, da so imele miši, napolnjene z BCGph, bistveno večje GC kot miši, ki so bile izzvane z MLM (slika 5C). Miši, imunizirane s hlFN-a 2b (slika 5D), so imele GC s primerljivo velikostjo kot tiste pri miših, ki so bile izzvane z MLM. Miši, napolnjene z BCGph in okrepljene s hlFN-a 2b, so imele GC vmesne velikosti (slika 5E). Da bi imeli bolj kvantitativno oceno odzivov GC v DLN, smo izračunali povprečno velikost GC v posameznih odsekih DLN. V skladu z našimi opažanji smo ugotovili znatno zmanjšanje povprečne velikosti GC v DLN po injiciranju hlFN-a 2b in v protokolu za pripravo BCGph/hIFN-a 2b (slika 5E).

3.6. Primerljive ravni protiteles, specifičnih za glikolipide, pri miših, ki so bile izzvane z M. lepraemurium po začetni uporabi BCGphipps in povečanju hIFN{3}}b

Glede na razlike, opažene pri nastanku in organizaciji GC, smo izmerili koncentracijo protiteles, specifičnih za glikolipide, ekstrahirane iz MLM. Naši rezultati globalno kažejo, da na sistemske količine različnih razredov in izotipov protiteles, specifičnih za glikolipid, ni vplivalo cepljenje, zaporedno dajanje hIFN- 2b ali protokol BCGph priming/hIFN- 2b ( Tabela 2). Miši, okrepljene samo s hIFN- 2b, so izzvale večjo količino protiteles IgG in IgG1 v serumu. Vendar ravni protiteles IgG in Ig G1 niso bile statistično značilne v primerjavi z drugimi poskusnimi skupinami (tabela 2).

4. Razprava

V tej študiji smo pokazali, da je naš protokol za prvo krepitev, ki temelji na podkožnem začetku BCGphipps in zaporednem intramuskularnem spodbujanju z naraščajočimi količinami hIFN- 2b, zaščitil miši pred intradermalnim izzivom z MLM.

Protokol za prvo pospeševanje je preprečil rast MLM v koži in izboljšal lokalno patologijo z zmanjšanjem proizvodnje NT in nevtrofilnega vnetja (slika 3E). Posledica je bila tudi indukcija protivnetnih citokinov (IL-4 in IL-10), ki so verjetno preprečili prekomerno vnetje kože in se manifestirali sistemsko. Nepričakovano, čeprav je terapevtski režim zmanjšal CD3 plus FOXP3 plus Tregs v DLN (slika 4E), odzivi GC niso bili drastično povečani (slika 5E), serumske koncentracije protiteles, specifičnih za glikolipide, pa so bile podobne v vseh poskusnih skupinah, razen v miši, cepljene samo s hIFN- 2b (tabela 2). Kljub temu naši eksperimentalni podatki podpirajo potencialno uporabo pripravka BCG z adjuvansom z intramuskularnim povečanjem IFN 2b kot obetavne imunoterapije, ki si zasluži raziskavo pri človeški gobavosti.

Klinične manifestacije gobavosti so v korelaciji z imunološkim spektrom, odkritim pri bolnikih, in segajo od LL do TT [2,4,14,18]. Na splošno je za imunost gostitelja na M. leprae značilen predvsem polariziran odziv T pomočnika (Th1/Th2). Na eni strani spektra, čeprav je za LL značilna energija, je še vedno nekaj reaktivnosti na mikobakterijske antigene in proizvodnjo IL-4 in IL-10. Nasprotno pa pri TT prevladujoč odziv Th1 vodi do aktivacije makrofagov, ki jo poganja IFN, kar pospeši izločanje bacilov. Miši, okužene z MLM, običajno razvijejo lepromatozno gobavost brez jasne prevlade humoralne ali celične imunosti [18–20].

Zaščitna protitelesa, izzvana z okužbo ali cepljenjem [63], nastanejo s procesom, imenovanim zorenje afinitete, ki poteka v zarodnih središčih, oblikovanih v sekundarnih (vranica, bezgavke) ali terciarnih limfoidnih organih (TLO), ki nastanejo v perifernih tkivih [23,25]. . Ravno v GC je proizvodnja spominskih celic B in dolgoživih plazemskih celic, ki izločajo protitelesa, ki prispevajo k ustvarjanju dolgotrajne imunosti na prihodnja srečanja s patogeni. Učinkovita indukcija odzivov GC je odvisna od sodelovanja več tipov celic, vključno z B celicami, T folikularnimi celicami pomočnicami (TFH), makrofagi z obarvanjem telesa in folikularnimi dendritičnimi celicami (FDC) [64]. Dejansko cepiva sprožijo uspešne odzive GC in ektopične zarodne centre v bezgavkah [24, 25, 31, 49].

Poleg tega T folikularne celice pomočnice in T folikularne regulacijske celice [27–30] ohranjajo občutljivo ravnovesje med indukcijo učinkovitih odzivov protiteles in avtoimunostjo. Čeprav v naši študiji nismo izključili indukcije avtoimunosti, smo se še vedno osredotočili na učinke protokola za prvo povečanje z BCGph in hIFN- 2b na Tregs iz DLN. Zaščitene miši so imele znatno manj CD3 plus FOXP3 plus Tregs v svojih DLN. Vendar pa so potrebne nadaljnje študije, da se ugotovi, ali so nekateri od teh Treg celic T folikularne pomočnice, ki uravnavajo reakcije GC [27–30]. Ti rezultati lahko pomenijo, da je za nadzor rasti mikobakterij in preprečevanje patološkega vnetja kože potrebna učinkovita indukcija zaščitne imunosti v kombinaciji z rahlim zmanjšanjem Tregs v DLN.

Prejšnje študije so poročale o sistemskih in mukoznih učinkih IFN tipa I na T folikularne celice pomočnice in T folikularne regulatorne celice [19,32,64]. Dejansko IFN tipa I posredno poveča TFH v bezgavkah s stimulacijo priprave celic T s pomočjo dendritičnih celic [34]. IFN tipa I spodbuja tudi zamenjavo izotipa v GC. Poleg tega je nedavna študija pokazala, da IFN tipa I sproži tvorbo TLO v pljučih, ki jo poganja CXCL13- [49].

Tako bi lahko indukcija CXCL13 z IFN tipa I povečala rekrutacijo naivnih celic B v sekundarne limfoidne organe in povečala proizvodnjo plazemskih celic, ki izločajo protitelesa, kar bi globalno izboljšalo dolgotrajni spomin in imunološke odzive plazemskih celic [23–25,64]. ], zlasti v prisotnosti adjuvansov, kot je poli IC [65]. Poleg tega dajanje IFN tipa I povzroči nastanek GC v pljučih bolnikov z avtoimunskimi boleznimi [31] ali tuberkulozo [66,67]. Tako bi lahko blokada CXCL13 pomagala pri zdravljenju teh kroničnih vnetnih motenj [49]. V tem kontekstu smo opazili zelo blago zmanjšanje velikosti GC v DLN-jih zaščitenih primarno okrepljenih miši (slika 5E). Vendar pa so potrebne dodatne raziskave za boljšo opredelitev korelacije med tvorbo GC in zaščito, povzročeno pri tistih miših, ki so bile prvotno okrepljene. V eksperimentalnih nastavitvah priprave z BCGph in intramuskularnega hIFN{15}}b poživitve (51) so miši v naši študiji izkusile večjo zaščito z dajanjem BCGph-hIFN- 2b (80 odstotkov) kot samo z BCGph (60 odstotkov), kot je določeno z odsotnostjo ali majhnostjo kožnih lezij (slika 2) in primerljivo količino protiteles IgG in IgG1, specifičnih za glikolipide MLM (tabela 2). Naši rezultati so v nasprotju s povečano količino IgG pri miših, zaščitenih s cepljenjem z drugim sevom BCG (Pasteur) [41]. Ti podatki kažejo, da bi lahko vrsta seva BCG, uporabljenega za pripravo cepiva, vplivala na izid humoralnega imunskega odziva proti MLM ali M. leprae [51].

Poleg tega je več študij o tuberkulozi pokazalo potencial in ugodne učinke strategije heterolognega začetnega pospeševanja pri indukciji zaščitnih imunskih odzivov [68–70]. Poleg tega je dobro znano, da vrsta in pot imunizacije vplivata na obseg protiteles in celičnih imunskih odzivov. Presenetljivo je, da so zaščitene miši pokazale znatno višjo vrednost IL-4 in IL-10 v serumu v primerjavi z mišmi, zdravljenimi samo s PBS, BCGph ali hIFN- 2b (tabela 1). V našem laboratoriju trenutno preiskujemo, kako protivnetni citokini vplivajo na zaščitno imunost pri gobavosti. Vendar pa je več študij pokazalo, da je učinkovita celična imunost na mikobakterije odvisna od občutljivega ravnovesja med zaščito in preprečevanjem patologije [71]. Poleg tega obstajajo dokazi o indukciji obeh vrst citokinov v drugih eksperimentalnih modelih [72–75].

Naši skupni rezultati kažejo, da je uspeh našega protokola za povečanje moči odvisen od indukcije uravnoteženega imunskega odziva, ki učinkovito odpravlja MLM v koži in omejuje poškodbe tkiva z indukcijo protivnetnih citokinov (IL-4 in IL10), ki verjetno ščitijo imunske celice [76,77]. Dejansko IL-10, ki ga proizvaja induciran Tregs, modulira vnetje na površinah sluznice, zlasti na tistih, povezanih z vnetno črevesno boleznijo [77,78]. Te ugotovitve upravičujejo podrobno kinetično študijo aktivacije celic B, tvorbe in regulacije GC, tvorbe T folikularnih regulatornih celic in aktivacije NF-κB v našem sistemu za prvo pospeševanje z BCGph in hIFN- 2b, ki mu sledi okužba z MLM do imajo bolj mehanistično razumevanje vlog imunskih celic in poti NF-κB pri indukciji zaščitne imunosti v koži in bezgavkah po izzivu MLM.

5. Sklepi

Iz teh podatkov lahko sklepamo, da zaporedno intramuskularno spodbujanje s hIFN{0}}b izboljša cepljenje proti M. bovis BCG, ščiti pred intradermalnim izzivom z MLM in razkriva obetavne adjuvantne lastnosti človeškega IFN-a 2b v kontekstu BCG cepljenje za preprečevanje okužb z gobavostjo na endemičnih območjih. Kolikor nam je znano, je to prvo poročilo o terapevtski učinkovitosti BCGphipps v kombinaciji s farmacevtsko predstavitvijo hIFN- 2b v predkliničnem modelu gobavosti podobne bolezni.

Avtorski prispevki:

Načrt študije, GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M.; vodenje študije, GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M.; analiza podatkov: GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M.; interpretacija podatkov, GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M.; priprava rokopisa, GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M.; revizija vsebine rokopisa, GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M.; GGG, OR-E., SOI-T. in JR-M. prevzame odgovornost za celovitost analize podatkov. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje:

GGG in OR-E. so podprli SNI, CONACYT (Mexico City, Mehika). GGG je prejel podporo od Perfil Prodep 2019–2022 in JR-M. je bil podprt z notranjimi sredstvi Oddelka za medicino Univerze v Rochester Medical Center in RO1AI111914.

Izjava institucionalnega revizijskega odbora:

Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni po odobritvi Odbora za institucionalno oskrbo in upravljanje živali (ZOO-010-2020). CIE-ENCB ZOO 016/2014, 7. marec 2014.

Izjava o informirani privolitvi:

Se ne uporablja.

Izjava o razpoložljivosti podatkov:

Podatki se bodo delili v skladu z institucionalnimi smernicami.

Zahvala:

Hvaležni smo Ricardu Villalobosu za pomoč pri IHC in Rogeliu Hernandezu Pandu (INCMNSZ, Mexico City), ki je zagotovil sev BCGphipps.

Nasprotja interesov:

Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Reference

1. KDO. Svetovna zdravstvena organizacija: Tuberkuloza – globalna dejstva 2011/2102. Ženeva: WHO Stop TB Dep. 2012. Dostopno na spletu: http://www.who.int/tb/publications/2011/factsheet_tb_2011.pdf (dostopano 1. februarja 2021).

2. Dobro, PE Leprosy: Kaj se "odpravlja"? Bik. Svetovni zdravstveni organ. 2007, 85, 1–2. [CrossRef]

3. Rambukkana, A. Kako Mycobacterium leprae cilja na periferni živčni sistem? Trends Microbiol. 2000, 8, 23–28. [CrossRef]

4. Rodriguez, JIA; Triellato, GL; Meirelles, NML; Teixeira, CC; Lyon, S.; Esteves, ARM Metode razvrščanja gobavosti: primerjalna študija referenčnega značaja v Braziliji. Int. J. Infect. Dis. 2016, 45, 118–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Geluk, A.; van der Ploeg, J.; Teles, OBR; Kees, L.; Franken, MC; Prins, C.; Wouter, DJ; Sarno, NE; Sampaio, EP; Otenhoff, THM Racionalna kombinacija peptidov, pridobljenih iz različnih proteinov Mycobacterium leprae, izboljša občutljivost za imunodiagnostiko okužbe z M. leprae. Clin. Vacc. Immunol. 2008, 15, 522–533. [CrossRef] [PubMed]

6. Geluk, A.; Boboša, K.; Schip, JJVDP-V.; Spencer, JS; Banu, S.; Martins, MVSB; Cho, SN; Franken, KLMC; Kim, HJ; Bekele, Y.; et al. Novi biomarkerji, pomembni za diagnozo gobavosti, ki se uporabljajo na območjih, ki so hiperendemična za gobavost. J. Immunol. 2012, 188, 4782–4791. [CrossRef]

7. Geluk, A. Biomarkerji za gobavost: Bi raje T (celice)? Lepr. Rev. 2013, 84, 3–12. [CrossRef] [PubMed]

8. Alcaïs, A.; Alter, A.; Antoni, G.; Orlova, M.; Nguyen, VT; Singh, M.; Vanderborght, PR; Katoch, K.; Mira, MT; Vu, HT; et al. Postopno podvajanje identificira alel limfotoksina z nizko produkcijo kot glavni dejavnik tveganja za gobavost z zgodnjim nastopom. Nat. Genet. 2007, 39, 517–522. [CrossRef] [PubMed]

9. Avanzi, C.; Singh, P.; Truman, RW; Suffys, PN Molekularna epidemiologija gobavosti: posodobitev. Okužiti. Genet. Evol. 2020, 86, 104581. [CrossRef]

10. Lastoria, JC; Abreu, MA Pregled epidemioloških kliničnih in etnopatogenih vidikov gobavosti - 1. del. Bras. Dermatol. 2014, 89, 205–218. [CrossRef]

11. Rojas-Espinosa, O. Aktualne teme o profilih gostiteljskega imunološkega odziva na mikobakterijske okužbe; Pregledna knjiga; Tomioka, H., ur.; Raziskovalni kažipot: Trivandrum, Indija, 2009; strani 97–140.

12. Adams, LB; Pena, TM; Sharma, R.; Hagge, AD; Schurr, E.; Truman, RW Vpogled na živalske modele o imunogenetiki gobavosti. Ocena. mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 2012, 107, 197–208. [CrossRef]

13. Rojas-Espinosa, O.; Becerril-Villanueva, E.; Wek-Rodriguez, K.; Arce-Paredes, P.; Reyes-Maldonado, E. Paraliza zadnjih udov pri miših, okuženih z Mycobacterium lepraemurium, je posledica poškodbe kosti in ne prizadetosti živcev. Clin. Exp. Immunol. 2005, 140, 436–442. [CrossRef]

14. Modlin, LR Prirojeni imunski odziv pri gobavosti. Curr. Opin. Immunol. 2010, 22, 48–54. [CrossRef]

15. Oliveira, RB; Ochoa, MT; Sieling, PA; Rea, TH; Rambukkana, A.; Sarno, EN; Modlin, RL Izražanje Toll-like Receptor 2 na človeških Schwannovih celicah: mehanizem poškodbe živcev pri gobavosti. Okužiti. Imun. 2003, 71, 1427–1433. [CrossRef] 16. MacMicking, J.; Xie, QW; Nathan, C. Dušikov oksid in funkcija makrofagov. Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 323–350. [CrossRef]

17. Evans, T.; Buttery, L.; Tesar, A.; Springall, DR; Polak, J.; Cohen, J. Človeški nevtrofilci, zdravljeni s citokini, vsebujejo inducibilno sintazo dušikovega oksida, ki povzroči nitracijo zaužitih bakterij. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 1996, 93, 9553–9554. [CrossRef] [PubMed]

18. Fonseca, AB; Simon, dr.med.; Cazzaniga, RA; de Moura, TR; de Almeida, RP; Duthie, MS; Reed, SG; de Jesus, AR Vpliv prirojenih in adaptivnih imunskih odzivov na različne klinične rezultate gobavosti. Okužiti. Dis. Revščina 2017, 6, 5–13. [CrossRef] [PubMed]

19. Sadhu, S.; Khaitan, BK; Joshi, B.; Sengupta, U.; Nautiyal, AK; Mitra, DK Vzajemnost med regulatornimi celicami T in celicami Th17: pomen za polarizirano imunost pri gobavosti. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016, 10, e0004338. [CrossRef] [PubMed]

20. Rojas-Espinosa, O.; Wek-Rodríguez, K.; Arce-Paredes, P. Vpliv eksogene peroksidaze na razvoj mišje gobavosti. Int. J. Lepr. Drugi Mycobact. Dis. 2002, 70, 191–200.

21. Ischiropoulos, H. Biološka nitracija tirozina: patofiziološka funkcija dušikovega oksida in reaktivnih kisikovih vrst. Arh. Biochem. Biophys. 1998, 356, 1–11. [CrossRef]

22. Young, DB Leprosy lipid zagotavlja ključ do vstopa v Schwannove celice. Trends Microbiol. 2001, 9, 52–54. [CrossRef]

23. Bannard, O.; Cyster, JG Germinalni centri: programirani za zorenje afinitete in diverzifikacijo protiteles. Curr. Opin. Immunol. 2017, 45, 21–30. [CrossRef] [PubMed] 24. Victora, DG; Nussenweig, MC Germinalni centri. Annu. Rev. Immunol. 2012, 30, 429–457. [CrossRef] [PubMed]

26. Cirelli, KM; Crotty, SH Izboljšanje zarodnega centra z razširjeno razpoložljivostjo antigena. Curr. Opin. Immunol. 2017, 47, 64–69. [CrossRef]

26. Good-Jacobson, KL; Szumilas, CG; Chen, L.; Sharpe, AH; Tomayko, MM; Shlomchik, MJ PD-1 uravnava preživetje celic B zarodnega središča ter tvorbo in afiniteto dolgoživečih plazemskih celic. Nat. Immunol. 2010, 11, 535–542. [CrossRef]

27. Wollenberg, I.; Agua-Doce, A.; Hernández, A.; Almeida, C.; Oliveira, VG; Faro, J.; Graca, L. Regulacija reakcije zarodnega centra s Foxp3 plus folikularnimi regulatornimi T celicami. J. Immunol. 2011, 187, 4553–4560. [CrossRef] [PubMed]

28. Litterman, MA; Pierson, W.; Lee, SK; Kallies, A.; Kawamoto, S.; Rayner, TF; Srivastava, M.; Divekar, DP; Beaton, L.; Hogan, JJ; et al. FOXP3 plus folikularne regulacijske celice T nadzorujejo odziv zarodnega središča. Nat. med. 2011, 17, 975–982. [CrossRef]

29. Miles, B.; Connick, E. Nadzor germinalnega centra s folikularnimi regulatornimi celicami T med okužbo. Spredaj. Immunol. 2018, 9, 2704–3710. [CrossRef]

30. Fu, W.; Liu, X.; Lin, X.; Feng, H.; Sonce, L.; Li, S.; Chen, H.; Tang, H.; Lu, L.; Jin, W.; et al. Pomanjkanje T folikularnih regulatornih celic spodbuja avtoimunost. J. Exp. med. 2018, 215, 815–825. [CrossRef]

31. Pitzalis, C.; Jones, GW; Bombardieri, M.; Jones, SA. Ektopične limfoidne strukture pri okužbi, raku in avtoimunosti. Nat. Rev. Immunol. 2014, 14, 447–462. [CrossRef]

32. Aloulou, M.; Carr, EJ; Gador, M.; Bignon, A.; Liblau, RS; Fazilleau, N.; Linterman, MA Folikularne regulacijske T-celice so lahko specifične za imunizacijski antigen in izhajajo iz naivnih T-celic. Nat. Komun. 2016, 7, 10579–10589. [CrossRef]

33. Vinuesa, CG; Sanz, I.; Cook, MC Disregulacija zarodnih centrov pri avtoimunskih boleznih. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 845–857. [CrossRef]

34. Čučak, H.; Yrlid, U.; Reizis, B.; Kalinke, U.; Johansson-Lindborn, B. Signalizacija interferona tipa I v dendritičnih celicah stimulira razvoj T folikularnih pomožnih celic, rezidentnih limfnih vozlov. Imuniteta 2009, 31, 491–501. [CrossRef]

35. Desvignes, L.; Wolf, AJ; Ernst, JD Dinamične vloge IFN tipa I in tipa II pri zgodnji okužbi z Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 2012, 188, 6205–6215. [CrossRef]

36. Teles, MBR; Graeber, GT; Krutzik, RS; Montoya, D.; Schenk, M.; Lee, JD; Komisopoulou, E.; Kelly-Scumpia, K.; Chun, R.; Iyer, SS; et al. Interferon tipa I zavira humane antimikobakterijske odzive, ki jih sproži interferon tipa II. Znanost 2013, 339, 1448–1453. [CrossRef]

37. Ji, DX; Yamashiro, LH; Chen, KJ; Mukaida, N.; Kramnik, I.; Darwin, KH; Vance, RE Občutljivost za Mycobacterium tuberculosis, ki jo povzroča interferon tipa I, posreduje IL-1Ra. Nat. Microbiol. 2019, 4, 2128–2135. [CrossRef]

39. Manca, Č.; Cenova, L.; Bergtold, A.; Freeman, SH; Tovey, M.; Musser, MJ; Barry, EC, 3.; Freedman, HV; Kaplan, G. Virulentnost kliničnega izolata Mycobacterium tuberculosis pri miših je določena z neuspehom indukcije imunosti tipa Th1 in je povezana z indukcijo IFN-/. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 2007, 98, 5752–5757. [CrossRef] [PubMed]

39. Telesca, C.; Angelico, M.; Piccolo, P.; Nosotti, L.; Morrone, A.; Longhi, C.; Carbone, M.; Baiocchi, L. Interferon-alfa zdravljenje hepatitisa D povzroči poslabšanje tuberkuloze pri priseljencu. J. Infect. 2007, 54, e223–e226. [CrossRef] [PubMed]

40. Giacomini, E.; Remoli, ME; Gafa, V.; Pardini, M.; Fattorini, L.; Coccia, EM IFN- izboljša imunogenost BCG z delovanjem na zorenje DC. J. Leukoc. Biol. 2008, 85, 462–468. [CrossRef] [PubMed]

41. Rivas-Santiago, CE; Guerrero, GG IFN- Spodbujanje Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Güerin-Vaccine spodbuja celični odziv tipa Th1 in zaščito pred okužbo z M. tuberculosis. BioMed Res. Int. 2017, 2017, 6760. [CrossRef]

42. Guerrero, GG; Rangel-Moreno, J.; Islas-Trujillo, S.; Rojas-Espinosa, O. Zaporedno intramuskularno spodbujanje z IFN-alfa ščiti miši, cepljene z Mycobacterium bovis BCG, pred okužbo z M. lepraemurium. BioMed Med. Res. Int. 2015, 2015, 414027.

43. McNab, F.; Mayer-Barber, K.; Sher, A.; Wack, A.; O'Garra, A. Interferon tipa I pri nalezljivih boleznih. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 67–103. [CrossRef]

44. O'Shea, JJ; Visconti, R. IFN-ji tipa I in regulacija odzivov TH1: Enigme so razrešene in nastale. Nat. Immunol. 2000, 1, 17–19. [CrossRef]

45. González-Navajas, JM; Lee, J.; David, M.; Raz, E. Imunomodulatorne funkcije interferonov tipa I. Nat. Rev. Immunol. 2012, 12, 125–135. [CrossRef]

46. ​​Le Bon, A.; Močan interferon DF tipa I kot dražljaj za navzkrižno pripravo. Cytokine Growth Fact Rev. 2008, 19, 33–40. [CrossRef]

47. Bracci, L.; Canini, I.; Puzelli, S.; Sestili, P.; Venditti, M.; Spada, M.; Donatelli, I.; Belardelli, F.; Proietti, E. IFN tipa I je močan mukozni adjuvans za selektivno intranazalno cepljenje proti virusu influence pri miših in vpliva na zajemanje antigena na ravni sluznice. Vaccine 2005, 23, 2994–3004. [CrossRef]

48. Kavč, RB; Atmar, RL; Cate, TR; Quarles, JM; Keitel, WA; Arden, NH; Wells, J.; Niño, D.; Wyde, PR Kontrastni učinki interferona tipa I kot mukoznega adjuvansa za cepivo proti gripi pri miših in ljudeh. Vaccine 2009, 27, 5344–5348. [CrossRef] [PubMed]

49. Denton, AE; Innocentin, S.; Carr, EJ; Bradford, BM; Lafouresse, F.; Mabbott, NA; Mörbe, U.; Ludewig, B.; Groom, JR; Good-Jacobson, KL; et al. Interferon tipa I inducira CXCL13 za podporo tvorbe ektopičnega zarodnega središča. J. Exp. med. 2019, 216, 621–637. [CrossRef]

50. Toledo, PTG; Batista-Silva, LR; Medeiros, RCA; Lara, FA; Moraes, MO Interferoni tipa I, avtofagija in metabolizem gostitelja pri gobavosti. Spredaj. Immunol. 2018, 23, 806–817. [CrossRef]

51. Zhang, W.; Zhang, Y.; Zheng, H.; Pan, Y.; Liu, H.; Du, P.; Wan, L.; Liu, J.; Zhu, B.; Zhag, G.; et al. Sekvenciranje genoma in analiza sevov cepiva BCG. PLoS ONE 2013, 8, e071243. [CrossRef]

52. Wek-Rodriguez, K.; Silva-Miranda, M.; Arce-Paredes, P.; Rojas-Espinosa, O. Vpliv reaktivnih kisikovih posrednikov na sposobnost preživetja in infektivnost Mycobacterium lepraemurium. Int. J. Exp. Pathol. 2007, 88, 137–145. [CrossRef]

53. Kim, SH; Cohen, B.; Novick, D.; Rubinstein, M. Interferonski receptorji tipa I pri sesalcih so sestavljeni iz dveh podenot: IFN-R1 in IFN-R2. Gene 1997, 196, 279–286. [CrossRef]

54. Luo, Y.; Chen, X.; Han, RA; O'Donnell, M. Rekombinantni bacil Calmette-Guérin (BCG), ki izraža humani interferon-alfa 2B, kaže povečano imunogenost. Clin. Exp. Immunol. 2001, 123, 264–270. [CrossRef] [PubMed]

55. Sun, E.; Nian, X.; Liu, C.; Fan, X.; Han, R. Konstrukcija rekombinantnega humanega IFN -2b BCG in njegovih protitumorskih učinkov na rakave celice mehurja in vitro. Genet. Mol. Res. 2015, 14, 3436–3449. [CrossRef] [PubMed]

56. Prabhakaran, K.; Harris, EB; Kirchheimer, WF Vezava 14C-označene dope z Mycobacterium leprae in vitro. Int. J. Lepr. Drugi Mycobact. Dis. 1976, 44, 58–64.

57. Draper, P. Čiščenje Mycobacterium leprae. V zborniku priloge 4 poročila petega srečanja znanstvene delovne skupine za imunologijo gobavosti (IMMLEP), Ženeva, Švica, 24.–26. junij 1980; Svetovna zdravstvena organizacija: Ženeva, Švica, 1980.

58. Ischiropoulos, H.; Nelson, J.; Duran, D.; Al-Mehdi, A. Reakcije dušikovega oksida in peroksinitrita z organskimi molekulami in peroksidazo železovega hrena: Motnje pri določanju vodikovega peroksida. Prosti Radič. Biol. med. 1996, 20, 373–381. [CrossRef]

59. Schön, T.; Hernandez-Pando, R.; Negesse, Y.; Leekassa, R.; Sundqvist, T.; Britton, S. Izražanje inducibilne sintaze dušikovega oksida in nitrotirozina pri mejnih lezijah gobavosti. Br. J. Dermatol. 2001, 145, 809–815. [CrossRef]

60. Silva-Miranda, M.; WeK-Rodriguez, K.; Martinez, CE; Rojas-Espinosa, O. Izražanje ciklooksigenaze-2, alfa 1-kislega glikoproteina in inducibilne sintaze dušikovega oksida pri razvijajočih se lezijah mišje gobavosti. Int. J. Exp. Pot. 2006, 87, 485–494. [CrossRef]

61. Hernández-Pando, R.; Schön, T.; Orozco, EH; Serafín, T.; Estrada-Garcia, I. Izražanje inducibilne sintaze dušikovega oksida in nitrotirozina med razvojem eksperimentalne pljučne tuberkuloze. Exp. Strupeno. Pathol. 2001, 53, 257–265. [CrossRef]

62. Izcue, A.; Coombes, JL; Powrie, F. Regulativni limfociti in črevesno vnetje. Annu. Rev. Immunol. 2009, 27, 313–338. [CrossRef]

63. Sakaguchi, S.; Miyara, M.; Costantino, CM; Hafler, DA FOXP3 plus regulatorne celice T v človeškem imunskem sistemu. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 490–500. [CrossRef]

64. Plotkin, SA Korelati zaščite, povzročene s cepljenjem. Clin. Cepivo Immunol. 2010, 17, 1055–1065. [CrossRef] [PubMed]

65. Wu, H.; Chen, Y.; Liu, H.; Xu, L.-L.; Teuscher, P.; Wang, S.; Lu, S.; Dent, AL Folikularne regulacijske T-celice zavirajo proizvodnjo citokinov s folikularnimi pomožnimi celicami T in optimizirajo odzive IgG pri miših. EUR. J. Immunol. 2016, 46, 1152–1161. [CrossRef] [PubMed]

66. Jeyanathan, M.; Damjanovič, D.; Shaler, CR; Lai, R.; Wortzman, M.; Yin, C.; Zganiacz, A.; Lichty, D.; Xing, Z. Diferencialno vtisnjena prirojena imunost s cepljenjem za krepitev sluznice določa rezultate imunske zaščite proti tuberkulozi, neodvisno od T-celične imunosti. Mucosal Immunol. 2013, 6, 612–625. [CrossRef] [PubMed]

67. Jeyanathan, M.; Šao, Z.; Ju, X.; Harkness, R.; Jiang, R.; Li, J.; Xing, Z.; Zhu, T. AdHu5Ag85A Respiratory Mucosal Boost Imunization Izboljša zaščito pred pljučno tuberkulozo pri BCG primatih razen človeka. PLoS ONE 2015, 10, e0135009. [CrossRef]

68. Afhami, S.; Drumond, VA; D'Agositnio, MR; Jeyanathan, M.; Gillgrass, A.; Xing, Z. Napredovanje strategij imunoterapevtskega cepiva proti pljučni tuberkulozi. Spredaj. Immunol. 2020, 11, 557809. [CrossRef]

69. Torrado, E.; Robinson, RT; Cooper, AM Celični odziv na mikobakterije: uravnoteženje zaščite in patologije. Trendi Immunol. 2011, 32, 66–72. [CrossRef]

70. Xu, X.; Gao, W.; Cheng, S.; Yin, D.; Li, F.; Wu, Y.; Sonce, D.; Zhou, S.; Wang, D.; Zhang, Y.; et al. Protivnetni in imunomodulatorni mehanizmi atorvastatina v mišjem modelu travmatske poškodbe možganov. J. Neuroinflamm. 2017, 14, 167–182. [CrossRef]

71. Azeem, W.; Maukon, BR; Appel, S.; Maegrete, AO; Kalland, KH Dvojne pro- in protivnetne lastnosti dendritičnih celic, pridobljenih iz monocitov. Spredaj. Immunol. 2020, 11, 438–453. [CrossRef]

72. Sultana, S.; Bishay, B. Nevtralizacija TNFR-1 in TNFR-2 modulira septični artritis, ki ga povzroča S. aureus, z uravnavanjem ravni protivnetnih in protivnetnih citokinov med napredovanjem bolezni. Immunol. Lett. 2018, 196, 33–51. [CrossRef]

73. Pornografija, D.; Gilligan, MM; Huang, S.; Gartung, A.; Cortes-Puch, I.; Sime, PJ; Phipps, RP; Serhan, CHN; Hammock, BD Rešitev vnetja: dvojni pristop k preprečevanju citokinskih neviht pri COVID-19 Cancer Metastasis Rev. 2020, 39, 337–340. [CrossRef]

74. Longhi, poslanec; Trumpfheller, C.; Idoyaga, J.; Caskey, M.; Matoš, I.; Kluger, C.; Salazar, AM; Colonna, M.; Steinman, RM Dendritične celice potrebujejo sistemski odziv na interferon tipa I, da dozorijo in inducirajo imunost CD4 plus Th1 s poli IC kot adjuvansom. J. Exp. med. 2009, 206, 1589–1602. [CrossRef]

75. Khader, SA; Guglani, L.; Rangel-Moreno, J.; Gopal, R.; Junečko, BAF; Vodnjak, JJ; Martino, C.; Pearl, JE; Tighe, M.; Lin, Y.-Y.; et al. IL-23 je potreben za dolgoročno kontrolo Mycobacterium tuberculosis in tvorbo foliklov celic B v okuženih pljučih. J. Immunol. 2011, 187, 5402–5407. [CrossRef] [PubMed]

76. Choreño-Parra, JA; Bobba, S.; Rangel-Moreno, J.; Ahmed, M.; Mehra, S.; Rosa, B.; Martin, J.; Mitreva, M.; Kaushal, D.; Zúñiga, J.; et al. Okužba z Mycobacterium tuberculosis HN878 inducira človeškim podobne folikle B-celic pri miših. J. Infect. Dis. 2020, 221, 1636–1646. [CrossRef] [PubMed]

77. Schmidt, EG; Haribhai, D.; Williams, JB; Aggarwal, P.; Jia, S.; Charbonnier, LM; Yan, K.; Lorier, R.; Turner, A.; Ziegelbauer, J.; et al. IL-10, ki ga proizvajajo celice iTreg, nadzoruje kolitis in patogene eks. Treg celice med imunoterapijo. J. Immunol. 2012, 189, 5628–5648. [CrossRef]

78. Rubtsovo, YP; Rasmussen, JP; Chi, Y.; Fontenot, J.; Castelli, I.; Ja, X.; Treuting, P.; Siewe, I.; Roers, A.; Henderson, WRJ; et al. Regulativni interlevkin, pridobljen iz T-celic-10, omejuje vnetje na okoljskih mejah. Imuniteta 2018, 28, 546–558. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com